Name: crispr/cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation
Uploaded: 2019-06-20T13:00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R21OD023194-JX). Dette arbejde udnyttede Core Services understøttet af Center for Advanced modeller for translational Sciences and Therapeutics (CAMTraST) på University of Michigan Medical Center.

Alle dyre vedligeholdelses-, pleje-og brugs procedurer blev gennemgået og godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) ved University of Michigan.
1. klargøring af celler
<ol><li>
Erhverve Human iPSCs (ACS-1030) af den Amerikaner skrive kultursamling (ATCC). Kultur-iPScs på kunstig ekstravellulær matrix med feeder-fri cellekulturmedium (se tabel over materialer) i en cellekultur-inkubator (5% CO2 ved 37 °c) efter leverandørens anvisninger.
	<ol>
<li>2 timer før transfection, behandle iPSCs med 10 μM Rho-associeret, coiled-spole indeholdende protein kinase (ROCK) inhibitor Y27632 (anvendelse af som reducerer apoptose af dissocierede menneskelige hiPSCs og øger overlevelse og kloning effektivitet af hiPSCs uden påvirker deres pluripotens).</li>
		<li>Når transfecting, dissociere iPSCs med celle løsrivelse løsning (Se tabel over materialer) til enkeltceller ved 37 °c i 5 min. Tæl celletallet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etablere en kanin fibroblast cellekultur ved hjælp af en primær kultur af kanin øre hud vævsbiopsier, som tidligere beskrevet10.
	<ol>
<li>En 0,5 cm x 0,5 cm øre hud biopsi fås fra spidsen af kanin øret. Barber håret ud af ørevævet.</li>
		<li>Skyl 2x med Dulbeccos fosfatbuffer (DPBS) med 5% penicillin-streptomycin. Overfør ørevævet til en ny 6 cm vævskultur skål, og skær derefter vævet i små stykker (~ 1,0 mm x 1,0 mm). Tilsæt et par dråber føtal bovin serum for at forhindre, at vævet tørrer ud.</li>
		<li>Spred det strimlet væv til en 10 cm vævskultur skål, tilsæt derefter 10 ml kulturmedium. Kanin fibroblast celler dyrkes i Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum. Læg vævskultur skålen i celle kulturens inkubator (5% CO2 ved 37 °c).</li>
		<li>Tre til fem dage efter plating, brug trypsin-EDTA til at fordøje celler ved 37 °C i 2 min. Tæl celletallet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. design og syntese af gRNAs og donor oligos
<ol><li>For hvert gen, design guide RNA baseret på sekvensen af den målrettede søgsmåls ved hjælp af et online-værktøj (for eksempel < http://crispor.tefor.net/>).</li>
	<li>Indsæt i DNA-sekvensen af interesse.</li>
	<li>Vælg et genom og et protospacer-tilstødende motiv (PAM). Mulige guide sekvenser i input-DNA-sekvenser vil blive vist på outputsiden. Det anbefales at vælge gRNA med højere forventet effektivitet og lavere off-Target potentialer.</li>
	<li>Syntetisere DNA af en kommerciel sælger til overførsel grnas. Udfør in vitro-transkription af gRNA ved hjælp af et gRNA-syntese kit i henhold til producentens anvisninger.</li>
	<li>Rens gRNA ved hjælp af en RNA-rense mikrokolonne, der er inkluderet i gRNA-syntese sættet. Mål koncentrationen, og opbevar derefter gRNAs ved-80 °C.</li>
	<li>Design en ssODN-donor skabelon for hvert Mutations websted. Den ssODNs kan syntetiseres af kommercielle leverandører såsom IDT. Generelt er hver ssodn 120-160 nukleotider (NT) i længden, der består af 60-80 NT i den venstre homologi arm og 60-80 NT i den rigtige homologi arm. For at forhindre, at det redigerede DNA genfindes, bør der indføres en tavs mutation på PAM i ssODN, når det er muligt. CRISPR cut-stedet skal placeres så tæt på den tilsigtede genomiske ændring som muligt.</li>
</ol>3. tube elektroporation af Cas9 RNP og ssODNs
<ol><li>Forbered cellerne som beskrevet i afsnit 1.</li>
	<li>Resuspender 2-3 x 105 celler i 20 μl elektroporationbuffer. Pipette forsigtigt op og ned for at fremstille en enkelt cellesuspension.</li>
	<li>For Cas9 RNP transfection, premix 2 μg Cas9-NLS protein med 0,67 μg gRNA ved stuetemperatur (RT) for 10-15 min. Derefter blandes forsigtigt det dannede RNP-kompleks sammen med 2 μg ssODN med celler.</li>
	<li>Celle blandingen overføres til et 20 μL elektroporationsrør med Universal-fit pipettespidser, som leveres af rørelektroporationssættet. For at opnå bedre elektroporation, så prøv at undgå dannelsen af luftbobler under overførslen.</li>
	<li>Anbring elektroporationsrør i åbningen af elektroporatoren, og tryk på "go" for at afslutte. Følg producentens foreslåede parametre for hver celletype. For eksempel, for humane iPSCs og kanin fibroblast celler, er spændings sættet 420 V, og puls tiden er 30 MS. en vellykket elektroporation cyklus er indikeret af puls rapporten på displayet skærmen af elektro porator.</li>
	<li>Efter elektroporationen overføres de humane iPS-celler til 1 mL præ-warmed Y-27632-holdigt dyrkningsmedium, der er beskrevet i celle kulturdel. For kanin fibroblast celler overføres de til DMEM med 10% føtalt bovint serum.</li>
	<li>Pladen de resuspenderede celler til en brønd af en 12 brønd cellekultur plade.</li>
	<li>Skift kulturmediet hver dag. Y-27632 fjernes fra Human iPSC Culture medium 24 h post-elektro poration.</li>
</ol>4. analyse af Genredigeringsevents
<ol><li>Høst celler 72 h efter elektroporation. Fordøje celler fra kultur pladen ved hjælp af trypsin-EDTA til kanin fibroblast celler eller opløsning af celle løsrivelse til humane iPSCs. Efter centrifuge, resuspension celler med 350 mL lysis buffer (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA; pH 8,0, 10% SDS, tilsæt 20 μL 20 mg/mL proteinase K lager pr 1 mL lysis buffer), derefter inkube ved 55 °C natten.</li>
	<li>Udtræk genomisk DNA med phenol-chloroform ved hjælp af standardprocedurer.</li>
	<li>Amplify 100-200 BP DNA fragmenter indeholdende målrettet region ved hjælp af high-fidelity DNA Polymerase, derefter rense DNA fragmenter fra geler ved hjælp af et gel ekstraktions Kit eller direkte fra PCR produkter ved hjælp af en PCR SV mini kit.</li>
	<li>At bestemme genredigering effektivitet ved bakteriel koloni sekvensering, ubiquitinligase de oprensede PCR produkter i en pCR4-TOPO vektor ved hjælp af et TOPO TA kloning kit. Tilfældigt afhente bakterielle kloner, derefter sekvens skær ved hjælp af en universel sekvensering primer leveres af TOPO TA kloning kit.</li>
	<li>At bestemme genredigering effektivitet ved dyb sekventering, sende de rensede PCR produkter (~ 100-200 BP) fra trin 4,3 for crispr uancv sekvensering i en DNA sekventering kerne.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Cytosolic+Delivery+of+CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein+for+Efficient+Gene+Editing.">Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing.</a> ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).</li><li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo.">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li><li>Miller, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Viral+CRISPR/Cas+Gene+Editing+In+Vitro+and+In+Vivo+Enabled+by+Synthetic+Nanoparticle+Co-Delivery+of+Cas9+mRNA+and+sgRNA.">Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Administration+of+CRISPR/Cas9+Lipid+Nanoparticles+Achieves+Robust+and+Persistent+In+Vivo+Genome+Editing.">A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-targeted+delivery+of+CRISPR/Cas9+by+aptamer-functionalized+lipopolymer+for+therapeutic+genome+editing+of+VEGFA+in+osteosarcoma.">Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma.</a> Biomaterials. 147, 68-85 (2017).</li><li>Luo, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Specific+in+Vivo+Gene+Editing+Using+Cationic+Lipid-Assisted+Polymeric+Nanoparticles.">Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles.</a> ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).</li><li>Wang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+editing+via+CRISPR/Cas9+delivery+by+membrane-disruptive+and+endosomolytic+helical+polypeptide.">Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+homology-directed+gene+editing+by+CRISPR/Cas9+in+human+stem+and+primary+cells+using+tube+electroporation.">Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11649 (2018).</li><li>Du, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effect+of+young+oocytes+for+rabbit+somatic+cell+nuclear+transfer.">Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer.</a> Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).</li><li>Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneReviews(R). , (1993).</li><li>Friedman, J., et al., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneReviews(R). , (1993).</li><li>Hidaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+T790M+mutations+are+present+on+the+same+EGFR+allele+as+activating+mutations+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer.">Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+pathogenic+gene+mutation+in+human+embryos.">Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos.</a> Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+Pneumocystis+Infections+in+the+Lungs+of+Gene-Knockout+Rabbits+with+Severe+Combined+Immunodeficiency.">Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency.</a> Frontiers in Immunology. 9, 429 (2018).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+immunodeficient+rabbits+by+multiplex+embryo+transfer+and+multiplex+gene+targeting.">Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12202 (2017).</li></ol>

J. C. arbejder hos Celetrix LLC, producent af røret elektroporator. L. M., L. J., J. S., D. Y., J. Z., Y. E. C. og J. X. erklærer ingen konkurrerende interesser.

Røret elektroporation metode var effektiv til at levere CRISPR/Cas9 RNP og ssODNs til kanin og humane celler, hvilket fører til robust præcis genredigering (PGE). Den primære forskel mellem TE og andre konventionelle elektro porationsanordninger er brugen af et rør, hvor to elektroder er på toppen og bunden af røret og prøven er lastet i fuld derefter forseglet ved elektroporation (figur 1). I modsætning hertil er elektroderne i en konventionel kuvette på siderne, og prøven er ikke helt forseglet under elektroporering. Dette nye design reducerer luftboble generation og komprimerer luftboble størrelse, som derfor forbedrer jævn fordeling af elektrisk spænding, og som et resultat fører til reduceret celledød og høj transfektering effektivitet9. I det nuværende arbejde er høje PGE rater (15%-37%) blev opnået med EGFR-, Mybpc3-og HBB-gener i humane iPSCs. Disse resultater er i overensstemmelse med en tidligere rapport, hvor der blev opnået høje PGE-rater i humane stamceller9.
Sygdomsfremkaldende mutationer blev rettet mod IL2RG og SPR-gener i kanin celler. For nylig, IL2RG-knockout kaniner er blevet produceret som modeller for humant X-linked svær kombineret immundefekt (scid-x1)16,17. Det nuværende arbejde viser, at patient IL2RG-mutationer (f. eks. C231Y og Q235X) kan genereres effektivt i kanin celler, hvilket demonstrerer gennemførligheden af at skabe SCID-x1 kanin modeller, der transporterer patient mutationer. Det blev også påvist, at SPR R150G mutationer kan oprettes effektivt i kanin celler. Denne mutation forårsager motoriske og kognitive underskud hos børn12. Disse IL2RG og SPR mutation kanin modeller, når de er genereret, kan tjene som værdifulde prækliniske modeller for translationelle undersøgelser. De kan også anvendes til at etablere genredigeringbaseret terapeutisk behandling af disse mono ogene sygdomme.
En bekymring for CRISPR/Cas9-medierede genredigering applikationer er off-Target redigering begivenheder. Indel-satserne blev analyseret på forudsagte top off-Target-lokaliteter for sgRNAs, der blev anvendt i dette studie (tabel S1), ved hjælp af metoder, der tidligere er beskrevet9. I alt blev syv potentielle top off-Target-loci analyseret for SG-RB-IL2RG-01, fem for SG-RB-SPR, syv for SG-hEGFR, fem for SG-hMybpc3 og syv for SG-hHBB) ved hjælp af de primere, der er anført i tabel S2. Ingen ikke-Target-indels blev afsløret af T7E1 analyser (figur S1), hvilket indikerer minimal risiko for ikke-Target-risici for crispr/Cas9-medieret genredigering ved hjælp af disse sgrnas. Det indikerer også, at røret elektroporation metode selv ikke forårsager eller øge off-Target redigeringer. Ikke desto mindre bør indsatsen være dedikeret til at reducere eller eliminere uønskede redigeringer uden for målgruppen. Sekvensering af hele genomet kan være nødvendig for at udelukke sådanne hændelser for celler, der er beregnet til anvendelse i kliniske anvendelser.
På det tekniske plan, er følgende betragtes som vigtige faktorer for at opnå effektiv præcis genom redigering af CRISPR/Cas9 RNP rør elektroporation. For det første anbefales det at vælge en effektiv sgRNA med forventet lav off-Target potentiale. Det er vigtigt at validere den Indel effektivitet af den valgte sgRNA før du bruger det til PEG applikationer. Det er ikke sjældent, at en software forudsagt god sgRNA mislykkes på valideringstrinnet.
For det andet, for at opnå høj PGE, anbefales det at fremkalde en PAM-mutation til ssODN donor, når det er muligt. Begrundelsen er, at ved at gøre det, CRISPR/Cas9 re-skæring efter donor skabelon integration er forhindret. I visse tilfælde introducerer PGE selv PAM-mutationer. I andre tilfælde er det muligt at introducere tavse mutationer i PAM-sekvensen. I tilfælde af at en PAM-mutation ikke er mulig, tilrådes det at prøve at inkludere flere tavse mutationer i donoren, der svarer til sgRNA sekvensen.
For det tredje, særlig relevant for TE, er det vigtigt at undgå dannelsen af luftbobler, når overførsel af celler og RNP blanding til elektroporation røret. Mens udformningen af en TE rør allerede minimerer luftboble dannelse, omhyggelig håndtering vil yderligere reducere og kan endda fuldføre undgå luftboble dannelse. En fejl skydning guide til hyppige problemer, der kan opstå i anvendelsen af røret elektroporation for CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein medieret præcis genredigering er angivet i tabel 2.
Afslutningsvis er det påvist her, at rørelektroporation er et effektivt middel til levering af CRISPR/Cas9 RNP og ssODNs til pattedyrceller for at opnå høje PGE satser. Denne nye te transfektering teknik og dens robuste præcise genredigering sats kan lette udviklingen af genredigering applikationer.

CRISPR/Cas9 er den mest almindeligt anvendte programmerbare nuklease til genredigering. Det virker gennem enkelt guide RNA (sgRNA)-medieret anerkendelse af begge målsekvenser og en tilstødende protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens i genomet. Cas9-nukleasen genererer en dobbeltstrenget DNA-pause (DSB), der er placeret tre nukleotider opstrøms for PAM-sekvens1. Dsb'er repareres enten gennem fejlbehæftede ikke-homologe ende slutte (NHEJ) eller Homology-rettet reparation (HDR) veje. For at opnå præcis genredigering gennem HDR pathway, er donor skabeloner ofte leveres i form af plasmid DNA (pDNA) eller enkelt-strandede oligodeoxynucleotid (ssODN).
Crispr/Cas9 og sgrna kan leveres til cellerne i tre formater: ribonucleoprotein (RNP)-komplekset af Cas9 protein og grna2,3; Cas9 mRNA og sgrna4,5; eller plasmid DNA (pdna), der indeholder de nødvendige promotorer, drevet sgrna, og Cas9 kodning region6,7,8. Mange grupper har påvist, at når CRISPR/Cas9 leveres som RNP, overgår genredigeringen ofte de resultater, der opnås i pDNA-eller mRNA-formater, som kan tilskrives den meget mindre RNP-størrelse sammenlignet med nukleinsyre9. Desuden har det tidligere vist sig, at en roman tube elektroporation (TE) maskine er særligt effektiv i genredigering applikationer i flere celletyper9.
Præsenteret i det nuværende arbejde er en trin-for-trin protokol i at udnytte TE til levering af CRISPR/Cas9 RNP til pattedyrceller af forskellige arter på flere klinisk relevante loci. Denne roman te transfektering teknik og høj HDR sats fænomen kan finde brede anvendelser i biomedicinsk forskning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1364px;" width="1364">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:279px;">Accutase</td>
			<td style="width:240px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:246px;">792</td>
			<td style="width:600px;">Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td style="width:240px;">IDT</td>
			<td style="width:246px;">1074182</td>
			<td style="width:600px;">Cas9 protein, first used in Step 3.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMEM</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:246px;">11965092</td>
			<td style="width:600px;">For cell culture, first used in Step 1.2.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>1708075</td>
			<td>For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Electroporation buffer</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">13&#8211;0104</td>
			<td style="width:600px;">The electroporation buffer, first used in Step 3.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:279px;">Electroporation tubes</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">20 &#956;L: 12&#8211;0107; 120 &#956;L: 12&#8211;0104</td>
			<td style="width:600px;">The electroporation tube, first used in Step 3.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">Electroporator</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">CTX-1500A LE</td>
			<td style="width:600px;">The tube electroporation machine, first used in Step 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:246px;">12003C</td>
			<td style="width:600px;">For cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forma CO2 Incubators</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>Model 370</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:240px;">Qiagen</td>
			<td style="width:246px;">28115</td>
			<td style="width:600px;">For gel purification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human&#160; induced pluripotent stem cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-1030</td>
			<td>Human iPSCs, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Matrigel&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Corning</td>
			<td style="width:246px;">354277</td>
			<td style="width:600px;">Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">mTeSR 1 medium&#160;</td>
			<td style="width:240px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:246px;">85850</td>
			<td style="width:600px;">Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PCR SV mini</td>
			<td style="width:240px;">GeneAll</td>
			<td style="width:246px;">103-102</td>
			<td style="width:600px;">For PCR product purification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td>For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol-chloroform</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td>For DNA extraction, first used in Step 4.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:240px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:246px;">A29377</td>
			<td style="width:600px;">For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K Solution</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>AM2548</td>
			<td>For DNA extraction, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:240px;">NEB</td>
			<td style="width:246px;">M0491</td>
			<td style="width:600px;">For PCR amplification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">TA Cloning Kit&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:246px;">K457502</td>
			<td style="width:600px;">For TA clone sequencing, first used in Step 4.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (10 cm)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353003</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.2.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (12 well)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353043</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 3.7.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (6 cm)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353004</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP1757-500</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For cell digestion, first used in Step 1.2. 4.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Universal Fit Pipette Tips&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td>14-0101</td>
			<td>For electroporation, first used in Step 3.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Y27632</td>
			<td style="width:240px;">LC Labs</td>
			<td style="width:246px;">Y-5301</td>
			<td style="width:600px;">The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation

Genredigerende nukleaser, repræsenteret ved CRISPR-associeret protein 9 (Cas9), er ved at blive mainstream værktøjer i biomedicinsk forskning. Vellykket levering af crispr/Cas9 elementer i målcellerne ved transfektering er en forudsætning for effektiv genredigering. Denne protokol viser, at rørelektroporation (TE) maskine-medieret levering af CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), sammen med enkelt-strandede oligodeoxynucleotid (ssODN) donor skabeloner til forskellige typer af pattedyrceller, fører til robust præcise genredigeringshændelser. For det første blev te anvendt til at levere crispr/Cas9 RNP og ssodns til at fremkalde sygdomsfremkaldende mutationer i interleukin 2-receptor underenhed gamma (IL2RG)-genet og sepiapterin-reduktase (spr)-genet i kanin fibroblast celler. Præcise Mutations rater på 3.57% blev opnået som bestemt af bakteriel TA kloning sekvensering. Den samme strategi blev derefter anvendt i humane ipscs på flere klinisk relevante gener, herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), myosin binding protein C, hjerte (Mybpc3), og hæmoglobin underenhed Beta (hbb). Konsekvent, meget præcise Mutations rater blev opnået (11.65%-37,92%) som bestemt ved dyb sekvensering (DeepSeq). Det nuværende arbejde viser, at rørelektroporation af crispr/Cas9 RNP repræsenterer en effektiv transfektering protokol til genredigering i pattedyrceller.

TE af Cas9 RNP og ssODNs til kanin fibroblast celler
Den samlede proces med TE-medieret levering af Cas9 RNP til pattedyrceller er illustreret i figur 1. Først blev C231Y-og Q235X-mutationer produceret i IL2RG-genet, og R150G-mutationen blev fremstillet i SPR-genet i kanin fibroblast celler. Tab af funktion mutationer i IL2RG og SPR gener er kendt for at forårsage primær immundefekt11 og motoriske og kognitive underskud12, hhv.
De specifikke sgRNA-designs er illustreret i figur 2a. De primere, der anvendes til at forstærke målregionerne, er anført i tabel 3. Sekvenser af ssODNs er vist i tabel 1. Genredigeringsatserne blev bestemt ved bakteriel TA-kloning (figur 2b). På IL2RG C231 locus, ud af de 28 kloner, der blev sekvenseret, en (3,57%) den præcise C231Y-mutation, fire (14,28%) gennemført indsættelse eller sletning (Indel) mutationer, og de resterende 23 (82%) var vildtype. På IL2RG Q235 locus, ud af de 27 kloner, der blev sekvenseret, to (7,41%) den nøjagtige Q235X-mutation, tre gennemførte Indel-mutationer (11,11%) og de resterende var vildtype. På SPG R150 locus, af de 20 kloner sekvenseret, fem (25%) den præcise R150G-mutation, 10 (50%) gennemførte mutationer, og de resterende var vildtype.
TE af Cas9 RNP og ssODNs til humane iPSCs
TE blev derefter brugt til at levere Cas9 RNP og ssODNs til humane iPSCs og målrette klinisk relevant loci i EGFR, Mybpc3 og HBB-gener. Punktmutationer i EGFR T790 proksimal-regionen giver resistens over for EGFR-tyrosinkinasehæmmere hos patienter med ikke-småcellet lungecancer (NSCLC), der aktiverer mutationer af EGFR13. En frame Shift-mutation i exon 16 i Mybpc3 er impliceret i hypertrofisk kardiomyopati14. E6V-punkts mutationen i HBB-genet fører til seglcellesygdom15.
De specifikke sgRNA-designs er illustreret i figur 3a. De primere, der anvendes til at forstærke målregionerne, er anført i tabel 3. Sekvenser af ssODNs er vist i tabel 1. Genredigeringsatserne blev bestemt af DeepSeq (figur 3b). På EGFR locus, 15,68% af alleler transporteres præcis punktmutationer (6.315 læser), 22,75% båret Indel mutationer (9.162 læser), og de resterende 61,57% var vildtype (24.797 læser). På Mybpc3 locus, 37,92% båret den præcise 4-BP TGAA sletning (11.654 læser), 2,24% båret Indel mutationer (410 læser) og de resterende 59,84% var Wild-type (18.692 læser). På HBB locus, 11,65% båret den nøjagtige E6V mutation (6.565 læsninger), 23,35% båret Indel mutationer (13.163 læser) og de resterende 65% var vildtype (36.644 læser).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig1.jpg"> Figur 1: flow diagram af rørelektroporation af Cas9 RNP.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig2.jpg"> Figur 2 : Genredigering af kanin fibroblast celler. (A) illustration af målsekvenser. Kasserne angiver målrettede loci. Understregede bogstaver svarer til gRNA-sekvenser. Røde, farvede bogstaver indikerer PAM-sekvenser. B) at klon resultaterne af genredigeringsarrangementer. Kasser angiver præcist muteret loci. Den viste Indel-sekvens er kun repræsentativ for én allel-type. Andre Indel-sekvenser vises ikke. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig3.jpg"> Figur 3 : Genredigering af humane iPSCs. (A) illustration af målsekvenser. Kasserne angiver målrettede loci. Understregede bogstaver svarer til gRNA-sekvens. Røde, farvede bogstaver indikerer PAM-sekvenser. (B) deepseq-resultater af genredigeringshændelser. Kasser angiver præcist muteret loci. Røde, farvede bogstaver indikerer tavse mutationer, der blev introduceret i donor skabelonerne. Den viste Indel-sekvens er kun repræsentativ for én allel-type. Andre Indel-sekvenser vises ikke. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Locus</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">
Oligo-sekvens 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>(målrettet mutation)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanin IL2RG (C231Y)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTATGGGAGTGCTCAGCATTGGAGT GAATGGAGK-KÅRNESKAFAKKAĞCFAKATURI</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanin IL2RG (Q235X)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGAGTGCTTAGCATTGGAGT GAATGGAGK-KÅRNESKAFAKKAĞCFAKATURI</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanin SPR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">gacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtgaacatctcgtcgctgtgtgccctgcagcccttcaagggctggg cgctgtac</td>
		</tr>
<tr>
<td>(R150G)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Human EGFR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">ACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCTACAGTCCAACTGATTACCC TCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGRAKACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Punktmutationer umiddelbare til T790)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Human Mybpc3</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGACCAGCTGGTGATGGTGGGGCAGCGGGTGGAGTTTGCGAGGTATCGGA GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4-BP sletning)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Human HBB</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC Har du ikke mere at fordybe dig i, når du er på toppen af en</td>
		</tr>
<tr>
<td>E6V</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: sekvenser af ssODNs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trin</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Mulige årsager</td>
			<td>Løsninger</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,1 af</td>
			<td>Lav Indel-rate</td>
			<td>Dårlig guide RNA design, guide RNA bestande > 6 måneder, lav guide RNA koncentration</td>
			<td>Redesign guide RNA, producere/bestille ny guide RNA.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,3 af</td>
			<td>Lav PGE-effektivitet</td>
			<td>dårligt donor-DNA-design, lav effektiv guide-RNA, forkert mængde donor-DNA eller dårlig DNA-kvalitet</td>
			<td>Forøg homologi arm længde, introducere PAM mutation, introducere tavse mutationer til donor DNA, bruge en mere effektiv guide RNA, Optimer forholdet mellem Cas9 protein over guide RNA.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,4 af</td>
			<td>Mislykket transfektering</td>
			<td>Luftbobler dannet under overførsel af celler-buffer blanding til elektroporation rør, forkert spænding/varighed indstilling</td>
			<td>Prøv at undgå dannelsen af luftbobler, justere spænding/varighed indstilling.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,6 af</td>
			<td>lav cellelevedygtighed efter elektroporation</td>
			<td>Lav overlevelse af enkelt Human IPSC</td>
			<td>Tilsæt ROCK-hæmmer efter elektroporation, Øg antallet af celler.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,1 af</td>
			<td>Mislykket PCR</td>
			<td>Højt indhold af GC eller gentagen sekvens</td>
			<td>Optimer PCR-tilstanden, Tilføj DMSO til PCR-system.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: fejlfindingsvejledninger til hyppige problemer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Navn på primer</td>
			<td>Sekvens</td>
			<td>Bemærk</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-IL2RG-F</td>
			<td>CATGACAGTGACAGGGTCCC</td>
			<td rowspan="2">Til forstærkning af kanin IL2RG DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-IL2RG-R</td>
			<td>TGCCAGAGACACAAGCGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-SPR-F</td>
			<td>Fra Aalborg, Arhus, land</td>
			<td rowspan="2">Til forstærkning af kanin SPR DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ralle</td>
			<td>Af CTCAGCACCCTGACACTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-F</td>
			<td>TGATGGCCAGCGTGGACAAC</td>
			<td rowspan="2">Til forstærkning af humant EGFR-DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-R</td>
			<td>Fra Aalborg, Arhus, lander</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-F</td>
			<td>Af ATGCCCCGTGCTTCTGGAAC</td>
			<td rowspan="2">Til forstærkning af humant Mybpc3 DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-R</td>
			<td>TCAGGGGAGCCAACCCTCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-F</td>
			<td>TAACCTTGATACCAACCTGC</td>
			<td rowspan="2">Til forstærkning af humant HBB-DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-R</td>
			<td>Af CATTTGCTTCTGACACAACT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: grundere anvendt i trin 4,3.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medieret præcis Genredigering ved Rørelektroporation

Præsenteret her er en protokol for effektiv CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medieret genredigering i pattedyrsceller ved hjælp af rørelektroporation.

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Sikker og effektiv levering af Cas9-elementer i celler er afgørende for genredigeringsbaserede behandlinger. De protokoller, vi viser her, viser en ny tilgang i den retning. Protokollen anvender en ny elektroporationsmetode kaldet rørelektroporation.Dette fører til høje cellulære overlevelsesrater samt genredigering satser. Røret elektroporation metode er virus, narkotika, og reporter berigelse fri. Disse foretrækkes i kliniske applikationer, så med genredigering baserede behandlinger.Metoden er universelt anvendelig for mange celletyper. For eksempel kan humane hæmatopoietiske celler, primære T-celler og andre celler alle redigeres ved hjælp af vores metode. Denne tube elektroporation metode bruger et tyndt rør.Hvis du er en første gang bruger, kan du prøve GFP udtrykke plasmid DNA. Demonstration af proceduren vil være Linyuan Ma, en postdoc fra mit laboratorium. For at begynde denne procedure erhverve menneskelige iPSCs fra den amerikanske Type Kultur Collection.Kultur iPSCs på kunstig ekstracellulær matrix med feeder-fri cellekultur medium i en cellekultur inkubator ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid efter leverandørens anvisninger. To timer før transfektion behandle iPC'er med 10 micromolar Rho-associeret coiled-coil indeholdende protein kinase hæmmer Y-27632. Ved transfekting skal iPSCs adskilles med celleløsning til enkelte celler ved 37 grader Celsius i fem minutter.Tæl derefter antallet af celler. At etablere en kanin fibroblast cellekultur opnå et øre hud biopsi fra spidsen af en kanin øre. Skyl vævet to gange med DPBS indeholdende 5% penicillin-streptomycin.Overfør det skyllede ørevæv til en ny seks centimeter vævskulturskål og skær vævet i små stykker, hver omkring en efter en millimeter. Tilsæt et par dråber FBS for at forhindre vævet i at tørre ud. Efter dette, sprede strimlet væv i en 10 centimeter væv kultur fad og tilsæt 10 milliliter kultur medium.Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i tre til fem dage. Tre til fem dage efter plating bruge Trypsin-EDTA at fordøje cellerne ved 37 grader Celsius i to minutter, derefter tælle antallet af celler. Efter at designe og syntetisere gRNA'er og donor oligos, forberede cellerne som tidligere beskrevet.Opslæm 20 til 30.000 celler i 20 mikroliter elektroporationsbuffer. Pipette op og ned omhyggeligt for at producere en enkelt celle suspension. For Cas9 RNP transfektion, pre-mix to mikrogram Cas9 NLS protein med 0,67 mikrogram gRNA ved stuetemperatur i 10 til 15 minutter.Bland forsigtigt det dannede RNP-kompleks med to mikrogram ssODN med celler. Ved hjælp af universelle pipettespidser fra elektroporationssættet skal celleblandingen overføres til et 20 mikroliterelektroporationsrør. Placer elektroporationsrøret i elektroporatorens sprække, og tryk på gå til.En vellykket elektroporationscyklus angives med pulsrapporten på elektroporatorens skærm. Efter elektroporationen overføres de humane iPS-celler til en milliliter forvarmt Y-27632 indeholdende kulturmedium som tidligere beskrevet. Derefter plade de resuspended celler i en brønd af en 12-godt celle kultur plade.Fortsæt med at dyrke pladen, og sørg for at ændre kulturmediet hver dag. Y-27632 fjernes fra det menneskelige iPSC-kulturmedium 24 timer efter elektroporation. 72 timer efter elektroporation, høst cellerne.For en kanin fibroblast celler, bruge Trypsin-EDTA at fordøje cellerne fra kultur pladen. Til humane iPSC'er anvendes celleløsning til at fordøje cellerne fra kulturpladerne. Prøverne centrifugeres kortvarigt ved 1000 omdrejninger i fem minutter, og cellerne skal opslæmes igen med 350 milliliter lysisbuffer.Inkuber natten over ved 55 grader Celsius. Den næste dag udtrække genomiske DNA med phenol-chlorform ved hjælp af standard procedurer. Forstærke 100 til 200 baser par DNA fragmenter fra geler ved hjælp af enten en gel ekstraktion kit eller direkte fra PCR produkter ved hjælp af en PCR SV mini kit.For at bestemme genredigering effektivitet ved bakteriel koloni sekventering, bruge en TOPO-TA kloning kit til at ligate de rensede PCR produkter i en PCR4-TOPO vektor. Tilfældigt afhente bakterielle kloner og sekvens skær ved hjælp af en universel sekventering primer, som TOPO-TA kloning kit. For at bestemme genredigeringseffektiviteten ved dyb sekvensering skal du sende de tidligere opnåede rensede PCR-produkter til CRISPR-ampliconsekvensering i en DNA-sekventeringskerne.I denne undersøgelse anvendes en rørelektroporeringsmetode effektivt til at levere CRISPR/Cas9 RNP og ssODN'er til kanin og humane celler, hvilket fører til robust, præcis genredigering. For det første produceres C231Y- og Q235X-mutationer i IL2RG-genet, og R150G-mutationen produceres i SPR-genet i kaninfibroblastceller. De specifikke sgRNA-design og genredigeringshastighederne, der bestemmes af bakteriel TA-kloning, vises her.IL2RG C231 locus, ud af de 28 kloner sekvenseret, man bærer den præcise C231Y mutation, fire bære indsættelse eller sletning mutationer, og de resterende 23 er vilde-type. På IL2RG Q235 locus, ud af de 27 kloner sekvenseret, to bære den præcise Q235X mutation, tre bære en vantro mutation, og de resterende er vilde-type. På SPG R150 locus, af de 20 kloner sekvenseret, fem bære den præcise R150 genmutation, 10 bære vantro mutationer, og de resterende er vilde-type.Tube elektroporation bruges derefter til at levere Cas9 RNP og ssODNs til menneskelige iPSCs og målrette klinisk relevante loci i EGFR, Mybpc3, og HBB gener. På EGFR locus, 15,68% af alleler bære den præcise punkt mutationer, 22,75% bære vantro mutationer, og de resterende 61,57% er vilde-type. På Mybpc3 locus, 37,92% bære den præcise fire base par TGAA sletning, 2,24% bære vantro mutationer, og de resterende 59,84% er vilde type.På HBB locus, 11,5% bære den præcise E6V mutation, 35,4% bære vantro mutationer, og de resterende 65% er vilde-type. Cas9 RNP er den foretrukne form af Cas9 på grund af sin mindre størrelse i forhold til plasmid DNA. Rørelektrektren er en effektiv metode til at levere Cas9 RNP.Vi er især interesseret i at udnytte rør elektroporation af Cas9 RNP i primære T-celler til CAR T applikationer.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping og CRISPR / Cas9 redigering for at identificere et lægemiddelresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Udvælgelsesafhængig og uafhængig generering af CRISPR / Cas9-medierede Gene Knockouts i Pattedyrceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion af CRISPR/Cas9 Protein i kanal havkat, Ictalurus punctatus, embryoner til Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion og identifikation af CRISPR/Cas9-genereret gen Knockouts i Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering at gøre betinget mutanter af menneskelige Malaria parasitten, P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introduktion af et gen knockout direkte i den Amastigote fase af Trypanosoma cruzi ved hjælp af Crispr/Cas9 system

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-medieret Genom Redigering i filamentøse Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...