Name: crispr/cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation
Uploaded: 2019-06-20T13:00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid (R21OD023194 aan JX). Dit werk gebruikt kerndiensten ondersteund door het centrum voor geavanceerde modellen voor translationele wetenschappen en therapeuten (CAMTraST) aan de Universiteit van Michigan Medical Center.

Alle dieren onderhouds-, zorg-en gebruiksprocedures werden herzien en goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite (DEC) van de Universiteit van Michigan.
1. bereiding van de cellen
<ol><li>
Acquire Human iPSCs (ACS-1030) van de American Type Culture Collection (ATCC). De iPScs van de cultuur op kunstmatige extracellulaire matrijs met voeder-vrij de cultuurmiddel van de cel (zie lijst van materialen) in een incubator van de cel cultuur (5% CO2 bij 37 °c) naar aanleiding van de instructies van de leverancier.
	<ol>
<li>2 h voorafgaand aan transfectie, behandel de iPSCs met 10 µ M Rho-geassocieerde, coiled-Coil met eiwitkinase (ROCK) remmer Y27632 (gebruik van die vermindert apoptosis van gescheiden menselijke hiPSCs en verhoogt de overleving en het klonen van de efficiëntie van hiPSCs zonder van invloed zijn op hun pluripotentie).</li>
		<li>Wanneer transfecting, scheidt iPSCs met de oplossing van de detachement van de cel (Zie lijst van materialen) aan enige cellen bij 37 °c 5 min. Tel het aantal van de cel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vast te stellen een konijn fibroblast Cell cultuur met behulp van een primaire cultuur van konijn oor huidweefsel biopten, zoals eerder beschreven10.
	<ol>
<li>Een 0,5 cm x 0,5 cm oor huid biopsie wordt verkregen uit het puntje van het konijn oor. Scheer het haar uit het oor weefsel.</li>
		<li>Spoel 2x met Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met 5% penicilline-streptomycine. Breng het oor weefsel naar een nieuwe 6 cm weefselkweek schaal, dan snijd het weefsel in kleine stukjes (~ 1,0 mm x 1,0 mm). Voeg een paar druppels foetale boviene serum om het weefsel te voorkomen uitdrogen.</li>
		<li>Verspreid het versnipperde weefsel naar een 10 cm weefselkweek schaal, voeg dan 10 mL kweekmedium toe. Konijn fibroblast cellen worden gekweekt in Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) met 10% foetale boviene serum. Zet het weefselkweek gerecht in de cel kweek incubator (5% CO2 bij 37 ° c).</li>
		<li>Drie tot vijf dagen na het plateren, gebruik trypsine-EDTA om cellen te verteren bij 37 °C voor 2 min. Tel het aantal cellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ontwerp en synthese van gRNAs en donor oligos
<ol><li>Voor elk gen, ontwerp gids RNA gebaseerd op de opeenvolging van de gerichte Locus met behulp van een online tool (bijvoorbeeld < http://crispor.tefor.net/>).</li>
	<li>Deeg in de opeenvolging van DNA van belang.</li>
	<li>Selecteer een genoom-en protospacer motief (PAM). Mogelijke gids sequenties in input DNA-sequenties zal worden weergegeven op de outputpagina. Het wordt aanbevolen om gRNA te selecteren met een hoger voorspelde efficiëntie en een lagere off-target potentialen.</li>
	<li>Synthetiseren DNA door een commerciële verkoper voor het transcriberen van gRNAs. Voer in vitro transcriptie van gRNA met behulp van een gRNA synthese Kit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Zuiver de gRNA met behulp van een RNA zuivering microkolom opgenomen in de gRNA synthese Kit. Meet de concentratie en bewaar de gRNAs bij-80 °C.</li>
	<li>Ontwerp een ssODN donor sjabloon voor elke mutatie site. De ssODNs kan worden gesynthetiseerd door commerciële leveranciers zoals IDT. In het algemeen, elke ssODN is 120-160 nucleotiden (NT) in lengte, bestaande uit 60-80 NT in de linker homologie arm en 60-80 NT in de juiste homologie arm. Om het herknipsel van het bewerkte DNA te verhinderen, zou een stille verandering bij PAM in de ssODN moeten worden geïntroduceerd waar mogelijk. De KROKANT gesneden site moet zo dicht mogelijk bij de beoogde genomische verandering worden geplaatst.</li>
</ol>3. tube Electroporation van Cas9 RNP en ssODNs
<ol><li>Bereid de cellen voor zoals beschreven in punt 1.</li>
	<li>Hersuspend 2-3 x 105 cellen in 20 µ l van Electroporation buffer. Pipetteer voorzichtig omhoog en omlaag om een enkelvoudige cel suspensie te produceren.</li>
	<li>Voor Cas9 RNP transfectie, premix 2 µ g van Cas9-NLS proteïne met 0,67 µ g van gRNA bij kamertemperatuur (RT) voor 10-15 min. Daarna, meng zacht het gevormde RNP complex samen met 2 µ g van ssODN met cellen.</li>
	<li>Breng de cel mengsel naar een 20 µ L Electroporation buis met behulp van universele pasvorm pipet tips die door de tube Electroporation Kit. Om betere Electroporation te bereiken, probeer om de vorming van luchtbellen tijdens overdracht te vermijden.</li>
	<li>Plaats de Electroporation buis in de sleuf van de electroporator en druk op "Go" om te eindigen. Volg de voorgestelde parameters van de fabrikant voor elk type cel. Bijvoorbeeld, voor menselijke iPSCs en konijn fibroblast cellen, is de voltage reeks 420 V en de impulstijd is 30 Mej. een succesvolle Electroporation cyclus wordt vermeld door het impuls rapport op het vertoningsscherm van electroporator.</li>
	<li>Na de electroporation, de overdracht van de menselijke iPS cellen naar 1 mL van voorverwarmde Y-27632-bevattende cultuurmedium beschreven in cel cultuur deel. Voor konijn fibroblast cellen, breng ze naar DMEM met 10% foetale boviene serum.</li>
	<li>De opnieuw opgeschorte cellen van de plaat aan één goed van een 12 goed de cultuur plaat van de cel.</li>
	<li>Verander de cultuurmedium elke dag. Y-27632 wordt verwijderd uit de menselijke iPSC cultuurmedium 24 h post-Electroporation.</li>
</ol>4. analyse van Gene Editing Events
<ol><li>Oogst cellen 72 h na Electroporation. Verteren cellen van de cultuur plaat met behulp van trypsine-EDTA voor konijn fibroblast cellen of cel detachement oplossing voor menselijke iPSCs. Na centrifugeren, opnieuw op te schorten cellen met 350 mL lysis buffer (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA; pH 8,0, 10% SDS, Voeg 20 µ L van 20 mg/mL proteïnase K voorraad per 1 mL lysis buffer), dan Incubeer bij 55 °C 's nachts.</li>
	<li>Uittreksel het genomic DNA met fenol-chloroform gebruikend standaardprocedures.</li>
	<li>Versterken 100-200 BP DNA-fragmenten met gerichte regio met behulp van High-Fidelity DNA-polymerase, dan zuiveren de DNA-fragmenten van gels met behulp van een gel extractie Kit of rechtstreeks uit PCR producten met behulp van een PCR SV Mini Kit.</li>
	<li>Om te bepalen Gene Editing efficiency door bacteriële kolonie sequencing, ligase de gezuiverde PCR-producten in een pCR4-TOPO vector met behulp van een TOPO TA klonen Kit. Willekeurig pick-up bacteriële klonen, dan volgorde van de inserts met behulp van een universele sequencing primer die door de TOPO TA klonen Kit.</li>
	<li>Om de efficiency van het het bewerken van het gen door het diepe rangschikken te bepalen, verzend de gezuiverde PCR producten (~ 100-200 BP) van stap 4,3 voor het SCHERPEr amplicon rangschikken in een het rangschikken van DNA kern.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Cytosolic+Delivery+of+CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein+for+Efficient+Gene+Editing.">Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing.</a> ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).</li><li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo.">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li><li>Miller, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Viral+CRISPR/Cas+Gene+Editing+In+Vitro+and+In+Vivo+Enabled+by+Synthetic+Nanoparticle+Co-Delivery+of+Cas9+mRNA+and+sgRNA.">Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Administration+of+CRISPR/Cas9+Lipid+Nanoparticles+Achieves+Robust+and+Persistent+In+Vivo+Genome+Editing.">A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-targeted+delivery+of+CRISPR/Cas9+by+aptamer-functionalized+lipopolymer+for+therapeutic+genome+editing+of+VEGFA+in+osteosarcoma.">Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma.</a> Biomaterials. 147, 68-85 (2017).</li><li>Luo, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Specific+in+Vivo+Gene+Editing+Using+Cationic+Lipid-Assisted+Polymeric+Nanoparticles.">Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles.</a> ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).</li><li>Wang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+editing+via+CRISPR/Cas9+delivery+by+membrane-disruptive+and+endosomolytic+helical+polypeptide.">Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+homology-directed+gene+editing+by+CRISPR/Cas9+in+human+stem+and+primary+cells+using+tube+electroporation.">Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11649 (2018).</li><li>Du, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effect+of+young+oocytes+for+rabbit+somatic+cell+nuclear+transfer.">Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer.</a> Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).</li><li>Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneReviews(R). , (1993).</li><li>Friedman, J., et al., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneReviews(R). , (1993).</li><li>Hidaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+T790M+mutations+are+present+on+the+same+EGFR+allele+as+activating+mutations+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer.">Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+pathogenic+gene+mutation+in+human+embryos.">Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos.</a> Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+Pneumocystis+Infections+in+the+Lungs+of+Gene-Knockout+Rabbits+with+Severe+Combined+Immunodeficiency.">Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency.</a> Frontiers in Immunology. 9, 429 (2018).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+immunodeficient+rabbits+by+multiplex+embryo+transfer+and+multiplex+gene+targeting.">Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12202 (2017).</li></ol>

J. C. de werken bij Celetrix LLC, fabrikant van de buis electroporator. L. M., L. J., J. S., D. Y., J. Z., Y. E. C., en J. X. verklaar geen concurrerende belangen.

De tube Electroporation methode was effectief in het leveren van SCHERPEr/Cas9 RNP en ssODNs aan konijn en menselijke cellen, wat leidt tot robuuste precieze gen editing (PGE). Het primaire verschil tussen TE en andere conventionele Electroporation apparaten is het gebruik van een buis, waarin twee elektroden op de boven-en onderkant van de buis en het monster wordt geladen in volle dan verzegeld op Electroporation (Figuur 1). In een conventioneel Cuvette zijn de elektroden daarentegen aan de zijkanten en wordt het monster niet volledig afgedicht tijdens de Electroporation. Dit nieuwe ontwerp vermindert luchtbellen generatie en comprimeert luchtbellen grootte, die bijgevolg verbetert gelijkmatige verdeling van elektrische spanning, en als gevolg leidt tot verminderde celdood en hoge transfectie efficiëntie9. In het huidige werk, hoge PGE tarieven (15%-37%) werden bereikt gericht op EGFR, Mybpc3 en HBB genen in de menselijke iPSCs. Deze resultaten zijn in overeenstemming met een voorafgaand rapport waarin hoge PGE tarieven werden bereikt in menselijke stamcellen9.
De ziekte-veroorzakende veranderingen werden gericht in IL2RG en SPR genen in konijn cellen. Onlangs, IL2RG-knock-out konijnen zijn geproduceerd als modellen voor menselijke X-gebonden ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID-x1)16,17. De huidige werk toont aan dat de patiënt IL2RG mutaties (bijv. C231Y en Q235X) efficiënt kan worden gegenereerd in konijn cellen, waaruit blijkt dat de haalbaarheid van het creëren van SCID-x1 konijn modellen die patiënt mutaties. Het was ook aangetoond dat SPR R150G mutaties efficiënt kan worden gemaakt in konijn cellen. Deze mutatie veroorzaakt motorische en cognitieve tekorten bij kinderen12. Deze IL2RG en SPR mutatie konijn modellen, eenmaal gegenereerd, kunnen dienen als waardevolle preklinische modellen voor translationele studies. Zij kunnen ook worden gebruikt om Gene Editing-based therapeutische voor deze monogene ziekten vast te stellen.
Een zorg voor SCHERPEr/Cas9-gemedieerde gen editing toepassingen is de off-target Editing evenementen. Indeel tarieven werden geanalyseerd op voorspelde top off-target sites voor sgRNAs gebruikt in deze studie (tabel S1), met behulp van methoden eerder beschreven9. In totaal, zeven potentiële top off-target plaatsen werden geanalyseerd voor SG-rb-IL2RG-01, vijf voor SG-rb-SPR, Seven voor SG-hEGFR, vijf voor SG-hMybpc3, en Seven voor SG-hHBB), met behulp van de primers vermeld in tabel S2. Geen off-target indels werden onthuld door de T7E1 assays (figuur S1), met vermelding van minimale off-target Risico's voor de scherper/Cas9-gemedieerde gen bewerken met behulp van deze sgRNAs. Het geeft ook aan dat de tube Electroporation methode zelf niet veroorzaken of te verhogen off-target bewerkingen. Toch moeten inspanningen worden besteed aan het verminderen of elimineren van ongewenste off-target bewerkingen. Whole-genoom sequencing kan nodig zijn om dergelijke gebeurtenissen voor cellen die bestemd zijn om te worden gebruikt in klinische toepassingen uit te sluiten.
Op technisch niveau, worden de volgende beschouwd als belangrijke factoren aan het bereiken van efficiënte nauwkeurige genoom het uitgeven door SCHERPEr/Cas9 RNP buis Electroporation. Ten eerste wordt geadviseerd om een efficiënte sgRNA met voorspelde lage off-target potentieel te selecteren. Het is belangrijk om de inder efficiency van de geselecteerde sgRNA te valideren alvorens het voor PEG toepassingen te gebruiken. Het is niet zeldzaam dat een software voorspelde goede sgRNA faalt bij de validatie stap.
Ten tweede, om hoge PGE te bereiken, wordt het geadviseerd om een PAM verandering aan de ssODN donor waar mogelijk te veroorzaken. De reden is dat door dit te doen, SCHERPEr/Cas9 re-Cutting na donor template integratie wordt voorkomen. In bepaalde gevallen introduceert de PGE zelf PAM mutaties. In andere gevallen is het mogelijk om stille mutaties te introduceren in de PAM volgorde. In het geval dat een PAM mutatie niet mogelijk is, is het raadzaam om verschillende stille mutaties in de donor die overeenkomt met de sgRNA sequentie op te nemen.
Ten derde, bijzonder relevant voor te, is het belangrijk om de vorming van luchtbellen te vermijden wanneer het overbrengen van cellen en RNP mengsel aan de Electroporation buis. Terwijl het ontwerp van een TE buis al minimaliseert luchtbellen vorming, zal zorgvuldige behandeling verder te verminderen en kan zelfs volledig te voorkomen luchtbellen vorming. Een Trouble Shooting gids voor frequente problemen die kunnen worden aangetroffen bij de toepassing van Tube Electroporation voor de SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã gemedieerde nauwkeurige verwerking van genen is voorzien in tabel 2.
Tot slot wordt hier aangetoond dat Tube Electroporation een effectief middel is voor de levering van SCHERPEr/Cas9 RNP en ssODNs aan zoogdiercellen om hoge PGE tarieven te bereiken. Deze nieuwe TE transfectie techniek en zijn robuuste precieze Gene Editing rate kan vergemakkelijken de ontwikkeling van Gene editing toepassingen.

CRISPer/Cas9 is de meest gebruikte programmeerbare Nuclease voor het bewerken van genen. Het werkt door enige gids RNA (sgRNA)-bemiddelde erkenning van beide doel opeenvolgingen en een aangrenzende protospacer aangrenzende Motif (PAM) opeenvolging in het genoom. De Cas9 Nuclease genereert een twee-stranded DNA-break (DSB) gelegen drie nucleotiden stroomopwaarts van de PAM-sequentie1. De DSBs worden gerepareerd, hetzij door middel van foutgevoelige niet-homologe einde toetreden (NHEJ) of homologie-gerichte reparatie (HDR) paden. Voor het bereiken van precieze gen bewerken door middel van de HDR-route, donor sjablonen zijn vaak voorzien in het formaat van plasmide DNA (pDNA) of single-gestrande oligodeoxynucleotide (ssODN).
De scherper/Cas9 en sgRNA kunnen aan de cellen in drie formaten worden geleverd: ribonucleoproteã (RNP) complex van Cas9 proteïne en gRNA2,3; Cas9 mRNA en sgRNA4,5; of plasmide DNA (pDNA) dat de noodzakelijke promotors, gedreven sgRNA, en Cas9 codages gebied6,7,8bevat. Vele groepen hebben aangetoond dat wanneer de SCHERPEr/Cas9 als RNP wordt geleverd, de het bewerkings efficiency van het gen vaak overtreft die bereikt in pDNA of mRNA formaten, toe te schrijven aan de veel kleinere grootte van RNP in vergelijking met Nucleic zuren9. Bovendien is eerder aangetoond dat een nieuwe Tube Electroporation (TE) machine is bijzonder effectief in het bewerken van genen toepassingen in verschillende soorten cellen9.
Gepresenteerd in het huidige werk is een stap-voor-stap protocol in het gebruik van TE voor de levering van SCHERPEr/Cas9 RNP aan zoogdiercellen van verschillende soorten op verschillende klinisch relevante plaatsen. Deze roman TE transfectie techniek en hoge HDR-tarief fenomeen kan vinden brede toepassingen in biomedisch onderzoek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1364px;" width="1364">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:279px;">Accutase</td>
			<td style="width:240px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:246px;">792</td>
			<td style="width:600px;">Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td style="width:240px;">IDT</td>
			<td style="width:246px;">1074182</td>
			<td style="width:600px;">Cas9 protein, first used in Step 3.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMEM</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:246px;">11965092</td>
			<td style="width:600px;">For cell culture, first used in Step 1.2.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>1708075</td>
			<td>For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Electroporation buffer</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">13&#8211;0104</td>
			<td style="width:600px;">The electroporation buffer, first used in Step 3.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:279px;">Electroporation tubes</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">20 &#956;L: 12&#8211;0107; 120 &#956;L: 12&#8211;0104</td>
			<td style="width:600px;">The electroporation tube, first used in Step 3.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">Electroporator</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">CTX-1500A LE</td>
			<td style="width:600px;">The tube electroporation machine, first used in Step 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:246px;">12003C</td>
			<td style="width:600px;">For cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forma CO2 Incubators</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>Model 370</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:240px;">Qiagen</td>
			<td style="width:246px;">28115</td>
			<td style="width:600px;">For gel purification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human&#160; induced pluripotent stem cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-1030</td>
			<td>Human iPSCs, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Matrigel&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Corning</td>
			<td style="width:246px;">354277</td>
			<td style="width:600px;">Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">mTeSR 1 medium&#160;</td>
			<td style="width:240px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:246px;">85850</td>
			<td style="width:600px;">Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PCR SV mini</td>
			<td style="width:240px;">GeneAll</td>
			<td style="width:246px;">103-102</td>
			<td style="width:600px;">For PCR product purification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td>For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol-chloroform</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td>For DNA extraction, first used in Step 4.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:240px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:246px;">A29377</td>
			<td style="width:600px;">For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K Solution</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>AM2548</td>
			<td>For DNA extraction, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:240px;">NEB</td>
			<td style="width:246px;">M0491</td>
			<td style="width:600px;">For PCR amplification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">TA Cloning Kit&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:246px;">K457502</td>
			<td style="width:600px;">For TA clone sequencing, first used in Step 4.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (10 cm)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353003</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.2.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (12 well)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353043</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 3.7.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (6 cm)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353004</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP1757-500</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For cell digestion, first used in Step 1.2. 4.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Universal Fit Pipette Tips&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td>14-0101</td>
			<td>For electroporation, first used in Step 3.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Y27632</td>
			<td style="width:240px;">LC Labs</td>
			<td style="width:246px;">Y-5301</td>
			<td style="width:600px;">The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation

Gene Editing nucleasen, vertegenwoordigd door CRISPer-geassocieerde proteïne 9 (Cas9), worden steeds mainstream tools in biomedisch onderzoek. De succesvolle levering van SCHERPEr/Cas9 elementen in de doelcellen door transfectie is een voorwaarde voor efficiënte gen het uitgeven. Dit protocol toont aan dat Tube Electroporation (TE) machine-gemedieerde levering van CRISPer/Cas9 ribonucleoproteã (RNP), samen met single-gestrande oligodeoxynucleotide (ssODN) donor sjablonen voor verschillende soorten zoogdiercellen, leidt tot robuuste precieze gen Editing evenementen. Eerste, te werd toegepast om te leveren SCHERPEr/Cas9 RNP en ssODNs te induceren ziekte-veroorzakende mutaties in de interleukin 2 receptor subeenheid gamma (IL2RG) gen en sepiapterin reductase (SPR) gen in konijn fibroblast cellen. Precieze mutatie percentages van 3.57%-20% werden bereikt, zoals bepaald door bacteriële TA klonen sequencing. De zelfde strategie werd toen gebruikt in menselijke iPSCs op verscheidene klinisch relevante genen met inbegrip van epidermale de receptor van de groeifactor (EGFR), myosine bindende proteïne C, hart (Mybpc3), en hemoglobine subeenheid bèta (HBB). Consequent, zeer nauwkeurige mutatie tarieven werden bereikt (11.65%-37,92%) zoals bepaald door diepe sequencing (DeepSeq). Het huidige werk toont aan dat Tube Electroporation van CRISPer/Cas9 RNP een efficiënt transfectie protocol vormt voor het bewerken van genen in zoogdiercellen.

Te van Cas9 RNP en ssODNs aan konijn fibroblast cellen
Het algehele proces van TE-gemedieerde levering van Cas9 RNP aan zoogdiercellen wordt geïllustreerd in Figuur 1. Eerste, C231Y en Q235X mutaties werden geproduceerd in het IL2RG gen, en de R150G mutatie werd geproduceerd in de SPR gen in konijn fibroblast cellen. Verlies-van-functie mutaties in IL2RG en SPR genen is bekend dat de primaire immunodeficiëntie11 en motor en cognitieve tekorten veroorzaken12, respectievelijk.
De specifieke sgRNA ontwerpen worden geïllustreerd in Figuur 2a. De primers gebruikt om de beoogde gebieden te versterken zijn opgenomen in tabel 3. Sequenties van ssODNs worden weergegeven in tabel 1. De gene Editing tarieven werden bepaald door bacteriële TA klonen (Figuur 2b). Op de IL2RG C231 Locus, uit de 28 klonen die werden gesequenced, een (3,57%) droeg de nauwkeurige C231Y mutatie, vier (14,28%) verwerkte insertie of schrapping (indeel) mutaties, en de overige 23 (82%) waren wild-type. Op de IL2RG Q235 Locus, van de 27 klonen die werden gesequenced, twee (7,41%) droeg de precieze Q235X mutatie, drie gedragen indeel mutaties (11,11%) en de resterende waren wild-type. Op de SPG R150 Locus, van de 20 gesequenced klonen, vijf (25%) droeg de nauwkeurige R150G mutatie, 10 (50%) gedragen indeel mutaties, en de resterende waren wild-type.
Te van Cas9 RNP en ssODNs aan menselijke iPSCs
Te werd vervolgens gebruikt om Cas9 RNP en ssODNs te leveren aan de menselijke iPSCs en target klinisch relevante plaatsen in EGFR, Mybpc3, en HBB genen. Puntmutaties in de EGFR T790 proximale regio verleent weerstand tegen EGFR tyrosine kinase remmers bij patiënten van niet-kleine cel longkanker (NSCLC) harboring activerende mutaties van EGFR13. Een frame Shift mutatie in Exon 16 in Mybpc3 is betrokken bij Hypertrofische cardiomyopathie14. De E6V punt mutatie in het HBB gen leidt tot Sickle Cell Disease15.
De specifieke sgRNA ontwerpen worden geïllustreerd in Figuur 3a. De primers gebruikt om de beoogde gebieden te versterken zijn opgenomen in tabel 3. Sequenties van ssODNs worden weergegeven in tabel 1. De het bewerken van het gen tarieven werden bepaald door DeepSeq (Figuur 3b). Op de EGFR plaats, 15,68% van allelen droeg de precieze puntmutaties (6.315 leest), 22,75% uitgevoerd indeel mutaties (9.162 leest), en de resterende 61,57% waren wild-type (24.797 leest). Op de Mybpc3 Locus, 37,92% droeg de precieze 4-BP TGAA schrapping (11.654 leest), 2,24% uitgevoerd indeel mutaties (410 leest) en de resterende 59,84% waren wild-type (18.692 leest). Op de HBB Locus, 11,65% droeg de precieze E6V Mutatie (6.565 leest), 23,35% uitgevoerd indeel mutaties (13.163 leest) en de resterende 65% waren wild-type (36.644 leest).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig1.jpg"> Figuur 1: stroomschema van buis ELECTROPORATION van Cas9 rnp.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig2.jpg"> Figuur 2 : Gene editing van konijn fibroblast cellen. A illustratie vandedoel sequenties. De dozen wijzen op gerichte plaatsen. De onderstreepte brieven corresponderen met gRNA opeenvolgingen. Rood gekleurde letters geven PAM sequenties. (B) het klonen van Ta resultaten van het bewerken van genen gebeurtenissen. Dozen geven precies gemuteerde plaatsen aan. De getoonde volgorde van indeel is slechts representatief voor één allel type. Andere indeel sequenties worden niet getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig3.jpg"> Figuur 3 : Gene editing van menselijke iPSCs. A illustratie vandedoel sequenties. De dozen wijzen op gerichte plaatsen. De onderstreepte brieven corresponderen aan gRNA opeenvolging. Rood gekleurde letters geven PAM sequenties. (B) Deepseq resultaten van Gene Editing Events. Dozen geven precies gemuteerde plaatsen aan. Rood gekleurde letters geven stille mutaties die werden ingevoerd in de donor sjablonen. De getoonde volgorde van indeel is slechts representatief voor één allel type. Andere indeel sequenties worden niet getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Locus</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">
Oligo sequentie 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>(gerichte mutatie)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Konijn IL2RG (C231Y)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTATGGGAGTGCTCAGCATTGGAGT GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Konijn IL2RG (Q235X)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGAGTGCTTAGCATTGGAGT GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Konijn SPR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">gacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtgaacatctcgtcgctgtgtgccctgcagcccttcaagggctggg cgctgtac</td>
		</tr>
<tr>
<td>(R150G)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Menselijke EGFR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">ACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCTACAGTCCAACTGATTACCC AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>(De veranderingen naburige van het punt aan T790)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Menselijke Mybpc3</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGACCAGCTGGTGATGGTGGGGCAGCGGGTGGAGTTTGCGAGGTATCGGA GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4-BP schrapping)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Menselijke HBB</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC CTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>(E6V)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: sequenties van ssODNs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>Probleem</td>
			<td>Mogelijke redenen</td>
			<td>Oplossingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,1</td>
			<td>Lage indeel rate</td>
			<td>Het slechte ontwerp van RNA van de gids, gids de voorraden van RNA > 6 maanden, lage gids de concentratie van RNA</td>
			<td>Redesign gids RNA, produceren/bestellen nieuwe gids RNA.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,3</td>
			<td>Lage PGE efficiency</td>
			<td>het slechte ontwerp van DNA van de donor, lage efficiënte gids RNA, onjuiste hoeveelheid donor DNA of slechte kwaliteits DNA</td>
			<td>Verhoging homologie wapenlengte, Introduceer PAM mutatie, Introduceer stille mutaties aan de donor DNA, gebruik een efficiëntere gids RNA, Optimaliseer de verhouding van Cas9 proteïne over gids RNA.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,4</td>
			<td>Mislukte transfectie</td>
			<td>Luchtbellen gevormd tijdens de overdracht van cellen-buffer mengsel naar Electroporation buis, onjuiste spanning/duur instelling</td>
			<td>Probeer de vorming van luchtbellen te voorkomen, aanpassen van de spanning/duur instelling.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,6</td>
			<td>Low Cell levensvatbaarheid na Electroporation</td>
			<td>Lage overleving van enige menselijke IPSC</td>
			<td>Voeg ROCK remmer na electroporation, toename van het aantal cellen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,1</td>
			<td>Ontbroken PCR</td>
			<td>Hoge GC inhoud, of herhaalde opeenvolging</td>
			<td>Optimaliseer PCR voorwaarde, voeg DMSO aan PCR systeem toe.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: problemen met hulplijnen voor frequente problemen oplossen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer naam</td>
			<td>Volgorde</td>
			<td>Opmerking</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-IL2RG-F</td>
			<td>CATGACAGTGACAGGGTCCC</td>
			<td rowspan="2">Voor het versterken van het fragment van het konijn IL2RG DNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-IL2RG-R</td>
			<td>TGCCAGAGACACAAGCGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-SPR-F</td>
			<td>GTACTTTGGAGGGACAGAGG</td>
			<td rowspan="2">Voor het versterken van konijn SPR DNA fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-SPR-R</td>
			<td>CTCAGCACCCTGACACTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-F</td>
			<td>TGATGGCCAGCGTGGACAAC</td>
			<td rowspan="2">Voor het versterken van menselijk EGFR DNA fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-R</td>
			<td>ACCAGTTGAGCAGGTACTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-F</td>
			<td>ATGCCCCGTGCTTCTGGAAC</td>
			<td rowspan="2">Voor het versterken van menselijk Mybpc3 DNA fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-R</td>
			<td>TCAGGGGAGCCAACCCTCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-F</td>
			<td>TAACCTTGATACCAACCTGC</td>
			<td rowspan="2">Voor het versterken van menselijk HBB DNA fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-R</td>
			<td>CATTTGCTTCTGACACAACT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: primers gebruikt in stap 4,3.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

Hier gepresenteerd is een protocol voor efficiënte SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã-gemedieerde gen bewerken in zoogdiercellen met behulp van buis Electroporation.

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Veilig en effectief leveren van Cas9 elementen in cellen is van cruciaal belang voor genbewerking gebaseerde therapieën. De protocollen die we hier laten zien, tonen een nieuwe benadering in die richting. Het protocol maakt gebruik van een nieuwe elektroporatie methode genaamd buis elektroporatie.Dit leidt tot hoge cellulaire overlevingskansen en genbewerkingspercentages. De buis elektroporatie methode is virus, drug, en de verslaggever verrijking gratis. Deze hebben de voorkeur in klinische toepassingen, dus met genbewerking gebaseerde therapieën.De methode is universeel toepasbaar op veel celtypen. Bijvoorbeeld menselijke hematopoietische cellen, primaire T-cellen en andere cellen kunnen allemaal worden bewerkt met behulp van onze methode. Deze buis elektroporatie methode maakt gebruik van een dunne buis.Als u een eerste gebruiker bent, u proberen GFP uit te drukken plasmide DNA. Het aantonen van de procedure zal Linyuan Ma zijn, een postdoc uit mijn laboratorium. Om te beginnen met deze procedure verwerven menselijke IPSCs uit de American Type Culture Collection.Kweek de iPSC's op kunstmatige extracellulaire matrix met feeder-vrije celkweekmedium in een celkweek incubator bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide volgens de instructies van de leverancier. Twee uur voor de transfectie behandelen de iPSCs met 10 micromolar Rho-associated coiled-coil met eiwitkinaseremmer Y-27632. Bij transfecteren, dissociate iPSCs met cellossing oplossing om enkele cellen op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.Tel dan het aantal cellen. Om een konijn fibroblast cel cultuur te verkrijgen een oor huid biopsie van het puntje van een konijn oor. Spoel het weefsel twee maal af met DPBS met 5%penicilline-streptomycine.Breng het gespoelde oorweefsel naar een nieuwe zes centimeter weefselkweekschaal en snijd het weefsel in kleine stukjes, elk ongeveer een voor een millimeter. Voeg een paar druppels FBS toe om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt. Daarna, verspreid het versnipperde weefsel in een 10 centimeter weefsel cultuur schotel en voeg 10 milliliter van cultuur medium.Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende drie tot vijf dagen. Drie tot vijf dagen na beplating gebruik Trypsin-EDTA om de cellen te verteren op 37 graden Celsius gedurende twee minuten, dan tellen het aantal cellen. Na het ontwerpen en synthetiseren van de GRNAs en donor oligo's, bereiden de cellen zoals eerder beschreven.Resuspend 20 tot 30.000 cellen in 20 microliter van elektroporatiebuffer. Pipet voorzichtig op en neer om een enkele celopening te produceren. Voor Cas9 RNP-transfectie, pre-mix twee microgram Cas9 NLS eiwit met 0,67 microgram gRNA bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten.Meng het gevormde RNP-complex voorzichtig met twee microgram ssODN met cellen. Breng met behulp van universele pipettips van de elektroporatiekit het celmengsel over naar een elektroporatiebuis van 20 microliter. Plaats de elektroporatie buis in de sleuf van de elektroporator en druk op ga naar finish.Een succesvolle elektroporatiecyclus wordt aangegeven door het pulsrapport op het beeldscherm van de elektroporator. Na de elektroporatie brengen de menselijke iPS cellen aan één milliliter van voorverwarmde Y-27632 die cultuurmiddel bevatten zoals eerder beschreven. Dan plaat de geresuspended cellen in een put van een 12-well cel kweekplaat.Blijf de plaat kweken en zorg ervoor dat je het cultuurmedium elke dag verandert. Y-27632 wordt 24 uur na elektroporatie uit het menselijke iPSC-kweekmedium verwijderd. 72 uur na elektroporatie, oogst de cellen.Voor een konijn fibroblast cellen, gebruik Trypsin-EDTA om de cellen te verteren van de cultuurplaat. Voor menselijke iPSC's gebruik maken van celloslating oplossing om de cellen te verteren van de cultuur platen. Vercentrifugeren de monsters kort bij 1000 tpm gedurende vijf minuten en worden de cellen opnieuw opgetrokken met 350 milliliter lysisbuffer.Incubeer 's nachts bij 55 graden Celsius. De volgende dag extract het genomische DNA met fenol-chloroform met behulp van standaard procedures. Versterk 100 tot 200 basen paren van DNA-fragmenten uit gels met behulp van een gel extractie kit of rechtstreeks uit PCR-producten met behulp van een PCR SV mini kit.Gebruik een TOPO-TA-kloonkit om de gezuiverde PCR-producten te kruisen in een PCR4-TOPO-vector om de genbewerkingsefficiëntie te bepalen door bacteriële koloniesequentie. Pick-up bacteriële klonen en sequentie van de inserts met behulp van een universele sequencing primer die door de TOPO-TA klonen kit. Om de genbewerkingsefficiëntie te bepalen door diepe sequencing, stuur je de eerder verkregen gezuiverde PCR-producten voor CRISPR amplicon sequencing in een DNA-sequencing-kern.In deze studie wordt een buiselektroratiemethode effectief gebruikt om CRISPR/Cas9 RNP en ssODN's te leveren aan konijnen- en menselijke cellen, wat leidt tot robuuste, nauwkeurige genbewerking. Ten eerste worden C231Y- en Q235X-mutaties geproduceerd in het IL2RG-gen en wordt de R150G-mutatie geproduceerd in het SPR-gen in konijnenfiblastcellen. De specifieke sgRNA-ontwerpen en de genbewerkingspercentages die worden bepaald door bacteriële TA-klonen worden hier weergegeven.De IL2RG C231 locus, van de 28 gesequencequenties, draagt men de precieze C231Y mutatie, vier dragen invoeging of schrapping mutaties, en de resterende 23 zijn wild-type. Op de IL2RG Q235 locus, van de 27 gesequencequenties, twee dragen de precieze Q235X mutatie, drie dragen een indel mutatie, en de resterende zijn wild-type. Op de SPG R150 locus, van de 20 gesequenced klonen, vijf dragen de precieze R150 genmutatie, 10 dragen indel mutaties, en de resterende zijn wild-type.Buiselektroratie wordt vervolgens gebruikt om Cas9 RNP en ssODN's te leveren aan menselijke iPSC's en zich te richten op klinisch relevante loci in EGFR-, Mybpc3- en HBB-genen. Op de EGFR-locus draagt 15,68% van de allelen de precieze puntmutaties, 22,75% indelmutaties en de overige 61,57% is wildtype. Op de Mybpc3 locus, 37,92%dragen de nauwkeurige vier basis paar TGAA verwijdering, 2,24% dragen indel mutaties, en de resterende 59,84%zijn wild type.Op de HBB locus, 11,5%dragen de precieze E6V mutatie, 35,4% dragen indel mutaties, en de resterende 65%zijn wild-type. Cas9 RNP is de voorkeur vorm van Cas9 vanwege zijn kleinere omvang in vergelijking met plasmide DNA. De buiselektroratie is een effectieve methode om Cas9 RNP te leveren.We zijn vooral geïnteresseerd in het gebruik van buiselektroratie van Cas9 RNP in primaire T-cellen voor CAR T-toepassingen.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Gemedieerd Genoombewerking in de filamenteuze Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...