Name: crispr/cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation
Uploaded: 2019-06-20T13:00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R21OD023194 til JX). Dette arbeidet benyttet Core Services støttet av senter for avanserte modeller for translational Sciences og legemiddel selskap (CAMTraST) ved University of Michigan Medical Center.

Alle dyr opprettholdelsen, bekymre, og bruk prosedyrer var anmelder og anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av det universitet av Michigan.
1. utarbeidelse av celler
<ol><li>
Tilegne seg menneskelig iPSCs (ACS-1030) fra American type Culture Collection (ATCC). Kultur iPScs på kunstig ekstracellulære matrise med mater-fri cellekultur medium (se tabell over materialer) i en cellekultur inkubator (5% CO2 ved 37 ° c) etter leverandørens anvisninger.
	<ol>
<li>2 h før transfeksjoner, behandle iPSCs med 10 μM Rho-assosiert, spiral-coil inneholder protein kinase (ROCK) inhibitor Y27632 (bruk som reduserer apoptose av dissosiert menneskelige hiPSCs og øker overlevelse og kloning effektiviteten av hiPSCs uten påvirker deres pluripotency).</li>
		<li>Når transfecting, distansere iPSCs med celle avløsning løsning (se tabell over materialer) til enkeltceller ved 37 ° c i 5 min. Tell celle nummeret.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etablere en kanin Fibroblast cellekultur ved hjelp av en primær kultur av kanin øret hud vev biopsier, som tidligere beskrevet10.
	<ol>
<li>En 0,5 cm x 0,5 cm øret hud biopsi er Hentet fra tuppen av kanin øret. Barbere håret av øret vev.</li>
		<li>Skyll 2x med Dulbecco ' s fosfat-bufret saltvann (DPBS) med 5% penicillin-Streptomycin. Overfør øre vevet til en ny 6 cm vev kultur rett, deretter skjære vevet i små biter (~ 1,0 mm x 1,0 mm). Tilsett noen dråper fosterets storfe serum for å hindre at vevet tørker ut.</li>
		<li>Spre revet vev til en 10 cm vev kultur parabol, legg deretter til 10 mL kultur medium. Rabbit Fibroblast celler er kultivert i Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM) med 10% fosterets storfe serum. Sett vevet kultur parabolen i cellen kultur inkubator (5% CO2 ved 37 ° c).</li>
		<li>Tre til fem dager etter plating, bruke Trypsin-EDTA til å fordøye celler ved 37 ° c i 2 min. Tell celle nummeret.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. design og syntese av gRNAs og donor oligos
<ol><li>For hvert gen, design guide RNA basert på sekvensen av det målrettede geometriske verk ved hjelp av et nettbasert verktøy (for eksempel < http://crispor.Tefor.net/>).</li>
	<li>Lim inn i DNA-sekvensen av interesse.</li>
	<li>Velg et Genova og protospacer motiv (PAM). Mulig guide sekvenser i input DNA-sekvenser vil bli vist på output siden. Det anbefales å velge gRNA med høyere anslått effektivitet og lavere potensielle potensialer.</li>
	<li>Syntetisere DNA av en kommersiell leverandør for transkribere gRNAs. Utfør in vitro transkripsjon av gRNA ved hjelp av en gRNA syntese Kit i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
	<li>Rens gRNA ved å bruke en RNA-kolonne som er inkludert i gRNA-syntesen. Mål konsentrasjonen, og oppbevar deretter gRNAs ved-80 ° c.</li>
	<li>Design en ssODN donor mal for hver mutasjon området. SsODNs kan være syntetisert av kommersielle leverandører som IDT. Generelt, hver ssODN er 120-160 nukleotider (NT) i lengde, bestående av 60-80 NT i venstre homologi arm og 60-80 NT i høyre homologi arm. For å hindre recutting av den redigerte DNA, en stille mutasjon på PAM bør innføres i ssODN når det er mulig. Den CRISPR kuttet området bør være plassert så nær den tiltenkte genomisk endring som mulig.</li>
</ol>3. Tube electroporation av Cas9 RNP og ssODNs
<ol><li>Klargjør cellene slik det er beskrevet i avsnitt 1.</li>
	<li>Resuspend 2-3 x 105 celler i 20 μL av electroporation buffer. Pipetter opp og ned forsiktig for å produsere en enkelt celle suspensjon.</li>
	<li>For Cas9 RNP-transfeksjoner, Premix 2 μg av Cas9-NLS-protein med 0,67 mikrogram gRNA ved romtemperatur (RT) i 10-15 min. Deretter forsiktig blande dannet RNP kompleks sammen med 2 mikrogram ssODN med celler.</li>
	<li>Overfør celle blandingen til en 20 μL electroporation tube ved hjelp av universell passform pipette tips levert av røret electroporation Kit. For å oppnå bedre electroporation, prøv å unngå dannelse av luftbobler under overføringen.</li>
	<li>Plasser electroporation røret i sporet på electroporator og trykk "Go" for å fullføre. Følg produsentens foreslåtte parametere for hver celle type. For eksempel, for Human iPSCs og kanin Fibroblast celler, er spennings settet 420 V og puls tid er 30 MS. en vellykket electroporation syklus indikeres av puls rapporten på electroporator.</li>
	<li>Etter electroporation, overføre den menneskelige iPS-celler til 1 mL pre-varmet Y-27632-inneholdende kultur medium beskrevet i cellekultur del. For kanin Fibroblast celler, overføre dem til DMEM med 10% fosterets storfe serum.</li>
	<li>Plate de resuspendert cellene til en brønn av en 12 brønn cellekultur plate.</li>
	<li>Endre kultur mediet hver dag. Y-27632 er fjernet fra den menneskelige iPSC kultur medium 24 h post-electroporation.</li>
</ol>4. analyse av gen redigerings hendelser
<ol><li>Harvest celler 72 h etter electroporation. Digest celler fra kulturen plate ved hjelp Trypsin-EDTA for kanin Fibroblast celler eller celle avløsning løsning for menneskelig iPSCs. Etter sentrifuger, resuspend celler med 350 mL lyseringsbuffer (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA; pH 8,0, 10% SDS, tilsett 20 μL av 20 mg/mL proteinase K lager per 1 mL lyseringsbuffer), deretter ruge ved 55 ° c over natten.</li>
	<li>Pakk ut det genomisk DNA-et med fenol-kloroform ved bruk av standard prosedyrer.</li>
	<li>Forsterk 100-200 BP DNA-fragmenter som inneholder målrettet region ved hjelp av høyverdig DNA-polymerase, og rens deretter DNA-fragmentene fra gels ved hjelp av et gel-avsugs sett eller direkte fra PCR-produkter ved hjelp av en PCR SV mini-pakke.</li>
	<li>For å fastslå genredigering effektivitet av bakteriell koloni sekvensering, ligase de renset PCR produkter til en pCR4-TOPO vektor ved hjelp av et TOPO TA kloning Kit. Tilfeldig plukke opp bakterielle kloner, deretter sekvens innsatsene ved hjelp av en universell sekvensering primer levert av TOPO TA kloning Kit.</li>
	<li>For å bestemme genredigering effektivitet ved dyp sekvensering, Send renset PCR produkter (~ 100-200 BP) fra trinn 4,3 for CRISPR amplicon sekvensering i en DNA-sekvensering kjerne.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Cytosolic+Delivery+of+CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein+for+Efficient+Gene+Editing.">Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing.</a> ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).</li><li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo.">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li><li>Miller, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Viral+CRISPR/Cas+Gene+Editing+In+Vitro+and+In+Vivo+Enabled+by+Synthetic+Nanoparticle+Co-Delivery+of+Cas9+mRNA+and+sgRNA.">Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Administration+of+CRISPR/Cas9+Lipid+Nanoparticles+Achieves+Robust+and+Persistent+In+Vivo+Genome+Editing.">A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-targeted+delivery+of+CRISPR/Cas9+by+aptamer-functionalized+lipopolymer+for+therapeutic+genome+editing+of+VEGFA+in+osteosarcoma.">Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma.</a> Biomaterials. 147, 68-85 (2017).</li><li>Luo, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Specific+in+Vivo+Gene+Editing+Using+Cationic+Lipid-Assisted+Polymeric+Nanoparticles.">Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles.</a> ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).</li><li>Wang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+editing+via+CRISPR/Cas9+delivery+by+membrane-disruptive+and+endosomolytic+helical+polypeptide.">Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+homology-directed+gene+editing+by+CRISPR/Cas9+in+human+stem+and+primary+cells+using+tube+electroporation.">Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11649 (2018).</li><li>Du, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effect+of+young+oocytes+for+rabbit+somatic+cell+nuclear+transfer.">Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer.</a> Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).</li><li>Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneReviews(R). , (1993).</li><li>Friedman, J., et al., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneReviews(R). , (1993).</li><li>Hidaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+T790M+mutations+are+present+on+the+same+EGFR+allele+as+activating+mutations+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer.">Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+pathogenic+gene+mutation+in+human+embryos.">Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos.</a> Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+Pneumocystis+Infections+in+the+Lungs+of+Gene-Knockout+Rabbits+with+Severe+Combined+Immunodeficiency.">Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency.</a> Frontiers in Immunology. 9, 429 (2018).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+immunodeficient+rabbits+by+multiplex+embryo+transfer+and+multiplex+gene+targeting.">Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12202 (2017).</li></ol>

J. C. jobber for Celetrix LLC, produsenten av røret electroporator. L. M., L. J., J. S., D. Y., J. Z., Y. E. C. og J. X. erklærer ingen konkurrerende interesser.

Røret electroporation metoden var effektiv i å levere CRISPR/Cas9 RNP og ssODNs til kanin og menneskelige celler, som fører til robust presis genredigering (PGE). Den primære forskjellen mellom TE og andre konvensjonelle electroporation enheter er bruk av et rør, der to elektroder er på toppen og bunnen av røret og prøven er lagt i full deretter forseglet på electroporation (figur 1). I kontrast, i en konvensjonell Cuvette, elektrodene er på sidene og prøven er ikke helt forseglet under electroporation. Denne nye designen reduserer luftboblen generasjon og komprimerer luftboble størrelse, som følgelig forbedrer jevn fordeling av elektrisk spenning, og som et resultat fører til redusert celle død og høy transfeksjoner effektivitet9. I dagens arbeid, høy PGE priser (15%-37%) ble oppnådd målretting EGFR, Mybpc3 og HBB gener i menneskelig iPSCs. Disse resultatene er i samsvar med en tidligere rapport der høye PGE priser ble oppnådd i humane stamceller9.
Sykdomsfremkallende mutasjoner ble målrettet i IL2RG og SPR gener i kanin celler. Nylig har IL2RG-knockout kaniner blitt produsert som modeller for menneskelig X-knyttet alvorlig kombinert immunsvikt (SCID-X1)16,17. Den nåværende arbeid viser at pasienten IL2RG mutasjoner (f. eks C231Y og Q235X) kan være effektivt generert i kanin celler, demonstrere muligheten for å skape SCID-X1 kanin modeller bærer pasienten mutasjoner. Det ble også demonstrert at SPR R150G mutasjoner kan effektivt opprettes i kanin celler. Denne mutasjonen forårsaker motor og kognitive underskudd hos barn12. Disse IL2RG og SPR mutasjon kanin modeller, en gang generert, kan tjene som verdifulle prekliniske modeller for translational studier. De kan også brukes til å etablere gen redigerings BAS ert legemiddelbehandling for disse monogenic sykdommene.
En bekymring for CRISPR/Cas9-mediert gen redigeringsprogrammer er off-målet redigering hendelser. Indel ratene var analysert for forutsi topp av-mål steder for sgRNAs anvendt i denne studere (bord S1), benytter metoder tidligere beskrevet9. I alt, syv potensielle Top off-Target Loci ble analysert for SG-RB-IL2RG-01, fem for SG-RB-SPR, syv for SG-hEGFR, fem for SG-hMybpc3, og syv for SG-hHBB), ved hjelp av primere oppført i tabellen S2. Ingen av-målet indeler ble avslørt av T7E1 analysene (figur S1), indikerer minimal off-mål risiko for CRISPR/Cas9-mediert genredigering bruker disse sgRNAs. Det indikerer også at selve rør electroporation metoden ikke forårsaker eller øker redigeringer utenfor målet. Innsatsen bør likevel være dedikert til å redusere eller eliminere uønskede redigeringer utenfor mål. Helhet-Genova sekvensering kanskje være på krevd å utelukke slik begivenheter for celler det er hadde til hensikt å bli brukt inne klinisk søknadene.
For det teknisk plan flate, det fulgte er betraktet som nøkkelfaktorene å oppnå effektiv akkurat Genova redigere bort av CRISPR/Cas9 RNP rør electroporation. Først anbefales det å velge en effektiv sgRNA med anslått lav off-Target potensial. Det er viktig å validere den indel effektiviteten til den valgte sgRNA før den brukes til PEG-applikasjoner. Det er ikke sjelden at en programvare spådd god sgRNA mislykkes på valideringstrinnet.
For det andre, for å oppnå høy PGE, anbefales det å indusere en PAM mutasjon til ssODN donor når det er mulig. Begrunnelsen er at ved å gjøre det, CRISPR/Cas9 re-skjæring etter donor mal integrering er forhindret. I visse tilfeller introduserer PGE selv PAM mutasjoner. I andre tilfeller er det mulig å innføre stille mutasjoner i PAM sekvensen. I tilfelle at en PAM mutasjon ikke er mulig, er det anbefalt å prøve å inkludere flere tause mutasjoner i donor som tilsvarer sgRNA sekvensen.
For det tredje, spesielt relevant for TE, er det viktig å unngå dannelse av luftbobler ved overføring av celler og RNP-blandingen til electroporation røret. Mens utformingen av et TE-rør allerede minimerer luftboble dannelse, vil forsiktig håndtering redusere og kan til og med fullføre unngå luftboble dannelse. En feilsøking guide for hyppige problemer som kan oppstå i anvendelsen av rør electroporation for CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein mediert presis genredigering er gitt i tabell 2.
Avslutningsvis er det demonstrert her at tube electroporation er et effektivt middel for levering av CRISPR/Cas9 RNP og ssODNs til pattedyrceller for å oppnå høy PGE priser. Denne nye tes transfeksjoner teknikken og den robuste, presise gen redigerings hastigheten kan forenkle utviklingen av gen redigeringsprogrammer.

CRISPR/Cas9 er den mest brukte programmerbare nuklease for genredigering. Det fungerer gjennom én guide RNA (sgRNA)-mediert anerkjennelse av både mål sekvenser og en tilstøtende protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens i Genova. Den Cas9 nuklease genererer en dobbel-strandet DNA Break (DSB) ligger tre nukleotider oppstrøms av PAM sekvensen1. DSBs repareres enten gjennom feilutsatte ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ)-eller homologi (HDR)-baner. For å oppnå presis genredigering gjennom HDR-veien, er donor maler ofte gitt i formatet til plasmider DNA (pDNA) eller single-strandet oligodeoxynucleotide (ssODN).
CRISPR/Cas9 og sgRNA kan leveres til cellene i tre formater: den ribonucleoprotein (RNP) kompleks av Cas9 protein og gRNA2,3; Cas9 mRNA og sgRNA4,5; eller plasmider DNA (pDNA) som inneholder de nødvendige arrangører, drevet sgRNA, og Cas9 koding region6,7,8. Mange grupper har vist at når CRISPR/Cas9 leveres som RNP, er Gen redigerings effektiviteten ofte bedre enn de som er oppnådd i pDNA-eller mRNA-format, som kan tilskrives den mye mindre størrelsen på RNP sammenlignet med de nukleinsyre syrer9. Videre har det vært tidligere vist at en roman tube electroporation (TE) maskinen er spesielt effektiv i gen redigeringsprogrammer i flere celletyper9.
Presentert i dagens arbeid er en trinnvis protokoll i å utnytte TE for levering av CRISPR/Cas9 RNP til pattedyrceller av ulike arter ved flere klinisk relevante Loci. Denne romanen TE transfeksjoner teknikk og høy HDR rate fenomen kan finne brede anvendelser i biomedisinsk forskning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1364px;" width="1364">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:279px;">Accutase</td>
			<td style="width:240px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:246px;">792</td>
			<td style="width:600px;">Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td style="width:240px;">IDT</td>
			<td style="width:246px;">1074182</td>
			<td style="width:600px;">Cas9 protein, first used in Step 3.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMEM</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:246px;">11965092</td>
			<td style="width:600px;">For cell culture, first used in Step 1.2.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>1708075</td>
			<td>For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Electroporation buffer</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">13&#8211;0104</td>
			<td style="width:600px;">The electroporation buffer, first used in Step 3.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:279px;">Electroporation tubes</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">20 &#956;L: 12&#8211;0107; 120 &#956;L: 12&#8211;0104</td>
			<td style="width:600px;">The electroporation tube, first used in Step 3.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">Electroporator</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">CTX-1500A LE</td>
			<td style="width:600px;">The tube electroporation machine, first used in Step 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:246px;">12003C</td>
			<td style="width:600px;">For cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forma CO2 Incubators</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>Model 370</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:240px;">Qiagen</td>
			<td style="width:246px;">28115</td>
			<td style="width:600px;">For gel purification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human&#160; induced pluripotent stem cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-1030</td>
			<td>Human iPSCs, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Matrigel&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Corning</td>
			<td style="width:246px;">354277</td>
			<td style="width:600px;">Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">mTeSR 1 medium&#160;</td>
			<td style="width:240px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:246px;">85850</td>
			<td style="width:600px;">Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PCR SV mini</td>
			<td style="width:240px;">GeneAll</td>
			<td style="width:246px;">103-102</td>
			<td style="width:600px;">For PCR product purification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td>For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol-chloroform</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td>For DNA extraction, first used in Step 4.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:240px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:246px;">A29377</td>
			<td style="width:600px;">For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K Solution</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>AM2548</td>
			<td>For DNA extraction, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:240px;">NEB</td>
			<td style="width:246px;">M0491</td>
			<td style="width:600px;">For PCR amplification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">TA Cloning Kit&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:246px;">K457502</td>
			<td style="width:600px;">For TA clone sequencing, first used in Step 4.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (10 cm)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353003</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.2.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (12 well)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353043</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 3.7.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (6 cm)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353004</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP1757-500</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For cell digestion, first used in Step 1.2. 4.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Universal Fit Pipette Tips&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td>14-0101</td>
			<td>For electroporation, first used in Step 3.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Y27632</td>
			<td style="width:240px;">LC Labs</td>
			<td style="width:246px;">Y-5301</td>
			<td style="width:600px;">The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation

Genredigering nukleaser, representert ved CRISPR-Associated protein 9 (Cas9), blir mainstream-verktøy i biomedisinsk forskning. Vellykket levering av CRISPR/Cas9-elementer til målcellene ved transfeksjoner er en forutsetning for effektiv genredigering. Denne protokollen viser at tube electroporation (TE) maskin-mediert levering av CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), sammen med single-strandet oligodeoxynucleotide (ssODN) donor maler til ulike typer pattedyrceller, fører til robust presise gen redigerings hendelser. Først ble TE brukt til å levere CRISPR/Cas9 RNP og ssODNs å indusere sykdomsfremkallende mutasjoner i interleukin 2 reseptoren delenhet gamma (IL2RG) genet og sepiapterin reduktase (SPR) genet i kanin Fibroblast celler. Presis mutasjon utbredelsen av 3.57%-20% ble oppnådd som bestemmes av bakteriell TA kloning sekvensering. Den samme strategien ble deretter brukt i Human iPSCs på flere klinisk relevante gener inkludert epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR), myosin bindende protein C, CARDIAC (Mybpc3), og hemoglobin delenhet beta (HBB). Konsekvent, svært presise mutasjon priser ble oppnådd (11.65%-37,92%) som bestemmes av dyp sekvensering (DeepSeq). Det foreliggende arbeidet viser at rør electroporation av CRISPR/Cas9 RNP representerer en effektiv transfeksjoner protokoll for genredigering i pattedyrceller.

TE av Cas9 RNP og ssODNs til kanin Fibroblast celler
Den samlede prosessen med TE-mediert levering av Cas9 RNP til pattedyrceller er illustrert i figur 1. Først ble C231Y og Q235X mutasjoner produsert i IL2RG genet, og R150G mutasjon ble produsert i SPR genet i kanin Fibroblast celler. Tap-of-Function mutasjoner i IL2RG og SPR gener er kjent for å forårsake primær immunsvikt11 og motor og kognitive underskudd12, henholdsvis.
De spesifikke sgRNA-designene er illustrert i figur 2a. Den primere som brukes til å forsterke de målrettede regionene er oppført i tabell 3. Sekvenser av ssODNs er vist i tabell 1. Gen redigerings ratene ble bestemt av bakteriell TA-kloning (figur 2b). På IL2RG C231 geometriske steder, av de 28 kloner som var i rekkefølge, en (3,57%) gjennomført den presise C231Y mutasjon, fire (14,28%) utført innsetting eller sletting (indel) mutasjoner, og de resterende 23 (82%) var vill-type. På IL2RG Q235 geometriske steder, av de 27 kloner som var i rekkefølge, to (7,41%) gjennomført den presise Q235X mutasjon, tre gjennomført indel mutasjoner (11,11%) og de resterende var vill-type. På SPG R150 geometriske, av de 20 kloner sekvensert, fem (25%) gjennomført den presise R150G mutasjon, 10 (50%) gjennomført indel mutasjoner, og de resterende var vill-type.
TE av Cas9 RNP og ssODNs til menneskelig iPSCs
TE ble deretter brukt til å levere Cas9 RNP og ssODNs til humant iPSCs og målrette klinisk relevant Loci i EGFR, Mybpc3 og HBB gener. Point mutasjoner i EGFR T790 proksimale regionen konferere motstand mot EGFR tyrosin kinase hemmere hos pasienter med ikke-liten celle lungekreft (NSCLC) harboring aktivere mutasjoner av EGFR13. En frameshift mutasjon i ekson 16 i Mybpc3 er innblandet i hypertrofisk kardiomyopati14. E6V punkt mutasjon i HBB genet fører til sigdcellesykdom15.
De spesifikke sgRNA-designene er illustrert i figur 3a. Den primere som brukes til å forsterke de målrettede regionene er oppført i tabell 3. Sekvenser av ssODNs er vist i tabell 1. Gen redigerings ratene ble bestemt av DeepSeq (figur 3b). På EGFR-geometriske, 15,68% av alleler gjennomført nøyaktig punkt mutasjoner (6 315 leser), 22,75% gjennomført indel mutasjoner (9 162 leser), og de resterende 61,57% var vill-type (24 797 leser). På Mybpc3 geometriske, 37,92% gjennomført den presise 4-BP TGAA sletting (11 654 leser), 2,24% gjennomført indel mutasjoner (410 leser) og de resterende 59,84% var vill-type (18 692 leser). På HBB-geometriske, 11,65% gjennomført den presise E6V mutasjon (6 565 leser), 23,35% gjennomført indel mutasjoner (13 163 leser) og de resterende 65% var vill-type (36 644 leser).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig1.jpg"> Figur 1: Flow diagram av tube ELECTROPORATION av Cas9 RNP.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig2.jpg"> Figur 2 : Genredigering av kanin Fibroblast celler. (A) illustrasjon av mål sekvenser. Bokser indikerer målrettede Loci. Understrekede bokstaver tilsvarer gRNA-sekvenser. Rød fargede bokstaver indikerer PAM-sekvenser. (B) ta kloning resultater av genredigering hendelser. Bokser indikerer nettopp mutert Loci. Indel sekvensen som vises, er bare representativ for én allel type. Andre indel sekvenser vises ikke. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig3.jpg"> Figur 3 : Gene redigering av menneskelig iPSCs. (A) illustrasjon av mål sekvenser. Bokser indikerer målrettede Loci. Understrekede bokstaver tilsvarer gRNA sekvens. Rød fargede bokstaver indikerer PAM-sekvenser. (B) Deepseq resultatene av gen redigerings hendelser. Bokser indikerer nettopp mutert Loci. Rød fargede bokstaver indikerer stille mutasjoner som ble innført i donor maler. Indel sekvensen som vises, er bare representativ for én allel type. Andre indel sekvenser vises ikke. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Locus</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">
Oligo sekvens 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>(målrettet mutasjon)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanin IL2RG (C231Y)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTATGGGAGTGCTCAGCATTGGAGT GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanin IL2RG (Q235X)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGAGTGCTTAGCATTGGAGT GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanin SPR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">gacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtgaacatctcgtcgctgtgtgccctgcagcccttcaagggctggg cgctgtac</td>
		</tr>
<tr>
<td>(R150G)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Human EGFR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">ACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCTACAGTCCAACTGATTACCC AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Point mutasjoner proximate til T790)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Human Mybpc3</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGACCAGCTGGTGATGGTGGGGCAGCGGGTGGAGTTTGCGAGGTATCGGA GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4-BP sletting)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Human HBB</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC CTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>E6V</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: sekvenser av ssODNs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trinn</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Mulige årsaker</td>
			<td>Løsninger</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,1 for alle</td>
			<td>Lav indel hastighet</td>
			<td>Dårlig guide RNA design, guide RNA bestandene > 6 måneder, lav guide RNA-konsentrasjon</td>
			<td>Redesign guide RNA, produsere/bestille nye guide RNA.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,3 for alle</td>
			<td>Lav PGE effektivitet</td>
			<td>dårlig donor DNA design, lav effektiv guide RNA, feil mengde donor DNA eller dårlig kvalitet DNA</td>
			<td>Øk homologi arm lengde, innføre PAM mutasjon, innføre tause mutasjoner til donor DNA, bruke en mer effektiv guide RNA, Optimaliser forholdet mellom Cas9 protein over guide RNA.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,4 for alle</td>
			<td>Mislykkede transfeksjoner</td>
			<td>Luftbobler dannet under overføring av celler-buffer blandingen til electroporation tube, feil spenning/varighet innstilling</td>
			<td>Prøv å unngå dannelse av luftbobler, justere spenningen/varighet innstillingen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,6 for alle</td>
			<td>lav celle levedyktighet etter electroporation</td>
			<td>Lav overlevelse av enslige menneskelige IPSC</td>
			<td>Legg ROCK inhibitor etter electroporation, øke antall celler.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,1 for alle</td>
			<td>Mislykket PCR</td>
			<td>Høyt GC-innhold eller repeterende sekvens</td>
			<td>Optimaliser PCR tilstand, Legg DMSO til PCR system.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: feilsøkings veiledninger for hyppige problemer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primer navn</td>
			<td>Sekvens</td>
			<td>Merk</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-IL2RG-F</td>
			<td>CATGACAGTGACAGGGTCCC</td>
			<td rowspan="2">For å forsterke kanin IL2RG DNA fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-IL2RG-R</td>
			<td>TGCCAGAGACACAAGCGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-SPR-F</td>
			<td>GTACTTTGGAGGGACAGAGG</td>
			<td rowspan="2">For å forsterke kanin SPR DNA fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-SPR-R</td>
			<td>CTCAGCACCCTGACACTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-F</td>
			<td>TGATGGCCAGCGTGGACAAC</td>
			<td rowspan="2">For å forsterke humant EGFR DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-R</td>
			<td>ACCAGTTGAGCAGGTACTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-F</td>
			<td>ATGCCCCGTGCTTCTGGAAC</td>
			<td rowspan="2">For å forsterke humant Mybpc3 DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-R</td>
			<td>TCAGGGGAGCCAACCCTCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-F</td>
			<td>TAACCTTGATACCAACCTGC</td>
			<td rowspan="2">For å forsterke humant HBB DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-R</td>
			<td>CATTTGCTTCTGACACAACT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: primere brukt i trinn 4,3.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediert presis Genredigering av tube electroporation

Presentert her er en protokoll for effektiv CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediert genredigering i pattedyrceller ved hjelp av tube electroporation.

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Sikker og effektivt å levere Cas9-elementer i celler er avgjørende for genredigeringsbaserte terapier. Protokollene vi viser her viser en ny tilnærming i den retningen. Protokollen benytter en ny elektroporasjonsmetode kalt rørelektroporasjon.Dette fører til høye cellulære overlevelsesrater samt genredigeringsrater. Rørelektroporasjonsmetoden er virus, stoff og reporterberikelse gratis. Disse foretrekkes i kliniske applikasjoner, så med genredigeringsbaserte terapier.Metoden gjelder universelt for mange celletyper. For eksempel kan menneskelige hematopoetiske celler, primære T-celler og andre celler alle redigeres ved hjelp av vår metode. Denne rørelektroporasjonsmetoden bruker et tynt rør.Hvis du er en førstegangsbruker, kan du prøve GFP som uttrykker plasmid DNA. Å demonstrere prosedyren vil være Linyuan Ma, en postdoktor fra laboratoriet mitt. For å begynne denne prosedyren skaffe menneskelige iPSCer fra American Type Culture Collection.Kultur iPSCene på kunstig ekstracellulær matrise med materfri cellekulturmedium i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid etter leverandørens instruksjoner. To timer før transfeksjon behandle iPSCs med 10 mikromolar Rho-assosiert kveilet-coil som inneholder protein kinase hemmere Y-27632. Ved transfisering, dissosiere iPSCer med celleavløsningsløsning til enkeltceller ved 37 grader Celsius i fem minutter.Telle deretter antall celler. For å etablere en kanin fibroblast cellekultur få en øre hudbiopsi fra spissen av et kaninøre. Skyll vevet to ganger med DPBS som inneholder 5% penicillin-streptomycin.Overfør det skyllede ørevevet til en ny seks centimeter vevskulturrett og kutt vevet i små biter, hver omtrent en etter en millimeter. Tilsett noen dråper FBS for å hindre at vevet tørker ut. Etter dette sprer du det strimlede vevet i en 10 centimeter vevskulturrett og legger til 10 milliliter kulturmedium.Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i tre til fem dager. Tre til fem dager etter plating bruk Trypsin-EDTA å fordøye cellene på 37 grader Celsius i to minutter, og deretter telle antall celler. Etter å ha designet og syntetisert gRNAs og donor oligos, forberede cellene som tidligere beskrevet.Resuspend 20 til 30, 000 celler i 20 mikroliter elektroporasjonbuffer. Pipette opp og ned nøye for å produsere en enkelt celle suspensjon. For Cas9 RNP transfection, pre-mix to mikrogram Cas9 NLS protein med 0,67 mikrogram gRNA ved romtemperatur i 10 til 15 minutter.Bland forsiktig det dannede RNP-komplekset med to mikrogram ssODN med celler. Bruk universelle pipettespisser fra elektroporasjonssettet til å overføre celleblandingen til et 20 mikroliter elektroporasjonsrør. Plasser elektroporasjonsrøret i sporet på elektroporen og trykk gå til slutt.En vellykket elektroporasjonssyklus indikeres av pulsrapporten på skjermen til elektroporatoren. Etter elektroporasjonen overfører de menneskelige iPS-cellene til en milliliter forhåndsoppvarmet Y-27632 som inneholder kulturmedium som tidligere beskrevet. Deretter plate de resuspended cellene i en brønn av en 12-brønns celle kultur plate.Fortsett å dyrke platen, og sørg for å endre kulturmediet hver dag. Y-27632 fjernes fra det menneskelige iPSC-kulturmediet 24 timer etter elektroporering. 72 timer etter elektroporasjon høster cellene.For en kanin fibroblast celler, bruk Trypsin-EDTA å fordøye cellene fra kulturplaten. For menneskelige iPSCer bruk celleavløsningsløsning for å fordøye cellene fra kulturplatene. Sentrifuger prøvene ved 1000 o/min i fem minutter, og gjenoppstår cellene med 350 milliliter lysisbuffer.Inkuber over natten ved 55 grader Celsius. Neste dag trekker ut genomisk DNA med fenolklorform ved hjelp av standardprosedyrer. Forsterk 100 til 200 baser par DNA fragmenter fra geler ved hjelp av enten en gel ekstraksjon kit eller direkte fra PCR produkter ved hjelp av en PCR SV mini kit.For å bestemme genredigeringseffektiviteten ved bakteriell kolonisekvensering, bruk et TOPO-TA kloningssett for å ligate de rensede PCR-produktene til en PCR4-TOPO-vektor. Tilfeldig plukke opp bakterielle kloner og sekvens innsatsene ved hjelp av en universell sekvensering primer levert av TOPO-TA kloning kit. For å fastslå genredigeringseffektiviteten ved dyp sekvensering, send de tidligere oppnådde rensede PCR-produktene for CRISPR ampliconsekvensering i en DNA-sekvenseringskjerne.I denne studien brukes en rørelektroporasjonsmetode effektivt til å levere CRISPR/Cas9 RNP og ssODNer til kanin- og menneskeceller, noe som fører til robust, presis genredigering. For det første produseres C231Y- og Q235X-mutasjoner i IL2RG-genet, og R150G-mutasjonen produseres i SPR-genet i kaninfibroblastceller. De spesifikke sgRNA-designene og genredigeringsfrekvensene bestemmes av bakteriell TA-kloning, vises her.IL2RG C231-locus, ut av de 28 klonene sekvensert, bærer en presis C231Y mutasjon, fire bære innsetting eller sletting mutasjoner, og de resterende 23 er vill-type. Ved IL2RG Q235-locus, ut av de 27 klonene som er sekvensert, bærer to den nøyaktige Q235X-mutasjonen, tre bærer en indel mutasjon, og de resterende er villtype. Ved SPG R150-locus, av de 20 klonene som er sekvensert, bærer fem den nøyaktige R150-genmutasjonen, 10 bærer indelmutasjoner, og de resterende er villtype.Rørelektroporasjon brukes deretter til å levere Cas9 RNP og ssODNer til menneskelige iPSCer og målrette klinisk relevant loci i EGFR, Mybpc3 og HBB gener. Ved EGFR-locusen bærer 15,68% av allelene de nøyaktige punktmutasjonene, 22,75% bærer indelmutasjoner, og de resterende 61,57% er villtype. På Mybpc3 locus, 37,92% bære nøyaktig fire base pair TGAA sletting, 2,24% bære indel mutasjoner, og de resterende 59,84%er vill type.Ved HBB-locusen bærer 11,5% den nøyaktige E6V-mutasjonen, 35,4% bærer indelmutasjoner, og de resterende 65% er villtype. Cas9 RNP er den foretrukne formen for Cas9 på grunn av sin mindre størrelse i forhold til plasmid DNA. Rørelektroporasjonen er en effektiv metode for å levere Cas9 RNP.Vi er spesielt interessert i å utnytte rørelektroporering av Cas9 RNP i primære T-celler for CAR T-applikasjoner.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartlegging og CRISPR / Cas9 redigering for å identifisere et stoffresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Utvalgsavhengig og uavhengig generasjon av CRISPR / Cas9-medierte Gene Knockouts i mammale celler

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, embryo for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produksjon og identifikasjon av CRISPR/Cas9-generert Gene Knockouts i modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Vi presenterer en Gene knockout direkte inn i Amastigote Stage av Trypanosoma cruzi bruker CRISPR/Cas9 system

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-mediert genomredigering i filamentous ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...