Name: crispr/cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation
Uploaded: 2019-06-20T13:00:00
Duration: 8 min 31 s
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Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (R21OD023194 para JX). Este trabalho utilizou os principais serviços apoiados pelo centro de modelos avançados de Ciências translacionais e terapêuticas (CAMTraST) no centro médico da Universidade de Michigan.

Todos os procedimentos de manutenção, cuidados e uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) da Universidade de Michigan.
1. preparação de células
<ol><li>
Adquira iPSCs humanos (ACS-1030) da coleção de cultura de tipo americano (ATCC). Cultura iPScs na matriz extracelular artificial com meio de cultura celular livre de alimentador (ver tabela de materiais) em uma incubadora de cultura celular (5% CO2 a 37 ° c) seguindo as instruções do fornecedor.
	<ol>
<li>2 h antes do transfection, trate os iPSCs com 10 μm Rho-associado, coiled-bobina que contem o inibidor da quinase da proteína (rocha) Y27632 (a utilização de que reduz o apoptose de hipscs humanos dissociada e aumenta a eficiência da sobrevivência e do clonagem de hipscs sem que afetam a sua pluripotência).</li>
		<li>Quando transfecting, dissociar iPSCs com solução do destacamento da pilha (veja a tabela dos materiais) às únicas pilhas no ° c 37 por 5 minutos. conte o número da célula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estabeleça uma cultura da pilha do fibroblasto do coelho usando uma cultura preliminar de biópsias do tecido da pele da orelha de coelho, como descrito previamente10.
	<ol>
<li>Uma biópsia da pele da orelha de 0,5 cm x de 0,5 cm é obtida da ponta da orelha de coelho. Raspar o cabelo do tecido da orelha.</li>
		<li>Enxague 2x com solução salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) com 5% de penicilina-estreptomicina. Transfira o tecido da orelha a um prato novo da cultura do tecido de 6 cm, a seguir corte o tecido em partes pequenas (~ 1,0 milímetros x 1,0 milímetros). Acrescente algumas gotas de soro fetal bovino para evitar que o tecido seque.</li>
		<li>Espalhe o tecido desfiado a um prato da cultura do tecido de 10 cm, a seguir adicione 10 ml do meio de cultura. As células de fibroblastos de coelhos são cultivadas em meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) com soro bovino fetal a 10%. Põr o prato da cultura do tecido na incubadora da cultura da pilha (5% CO2 em 37 ° c).</li>
		<li>Três a cinco dias após o chapeamento, use Trypsin-EDTA para digerir as células a 37 ° c por 2 min. conte o número da célula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. projeto e síntese de gRNAs e oligos doadores
<ol><li>Para cada gene, o RNA do guia de projeto baseou na seqüência do locus alvejado usando uma ferramenta em linha (por exemplo, < http://crispor.tefor.net/>).</li>
	<li>Colar na seqüência de DNA de interesse.</li>
	<li>Selecione um genoma e um motivo de protoespaçador adjacente (PAM). As sequências de guia possíveis nas sequências de DNA de entrada serão exibidas na página de saída. Recomenda-se selecionar gRNA com maior eficiência prevista e menores potenciais fora do alvo.</li>
	<li>Sintetizar DNA por um vendedor comercial para transcrever gRNAs. Realize a transcrição in vitro do gRNA utilizando um kit de síntese gRNA de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Purify o gRNA usando uma micro coluna da purificação do RNA incluída no jogo da síntese de gRNA. Meça a concentração, a seguir armazene o gRNAs em-80 ° c.</li>
	<li>Projete um molde do doador de ssODN para cada local da mutação. O ssODNs pode ser sintetizado por vendedores comerciais como o IDT. Em geral, cada ssodn é 120-160 nucleotídeos (NT) de comprimento, consistindo de 60-80 NT no braço de homologia esquerda e 60-80 NT no braço de homologia direita. Para impedir a retifica do ADN editado, uma mutação silenciosa no Pam deve ser introduzida no ssodn sempre que possível. O local de corte CRISPR deve ser localizado o mais próximo possível da mudança genômica pretendida.</li>
</ol>3. tubo Electroporation de Cas9 RNP e ssODNs
<ol><li>Prepare as células conforme descrito na seção 1.</li>
	<li>Ressuscitação 2-3 x 105 células em 20 μL de tampão de electroporação. Pipeta acima e para baixo com cuidado para produzir uma suspensão da único-pilha.</li>
	<li>Para transfecção de Cas9 RNP, premix 2 μg de proteína Cas9-NLS com 0,67 μg de gRNA à temperatura ambiente (RT) por 10-15 min. Em seguida, misture suavemente o complexo RNP formado juntamente com 2 μg de ssODN com células.</li>
	<li>Transfira a mistura da pilha a um tubo de Electroporation de 20 μL usando pontas universais da pipeta do ajuste fornecidas pelo jogo do Electroporation do tubo. Para obter uma melhor electroporação, tente evitar a formação de bolhas de ar durante a transferência.</li>
	<li>Coloque o tubo de electroporação na ranhura do electroporador e prima "Go" para terminar. Siga os parâmetros sugeridos do fabricante para cada tipo de célula. Por exemplo, para iPSCs humanos e células de fibroblastos de coelho, o conjunto de tensão é 420 V e o tempo de pulso é de 30 ms. um ciclo de Electroporation bem sucedido é indicado pelo relatório do pulso na tela de exposição do electroporator.</li>
	<li>Após o electroporation, transfira as pilhas humanas do iPS a 1 mL do meio de cultura pre-aquecido de Y-27632-contendo descrito na divisória da cultura da pilha. Para células de fibroblastos de coelhos, transfira-as para DMEM com soro bovino fetal a 10%.</li>
	<li>Placa as pilhas ressuscipended a um poço de uma placa da cultura da pilha de 12 poços.</li>
	<li>Mude o meio de cultura todos os dias. Y-27632 retira-se do meio de cultura humano do iPSC 24 h borne-Electroporation.</li>
</ol>4. análise de eventos de edição de genes
<ol><li>Células de colheita 72 h após o electroporation. Digerir as células da placa de cultura usando Trypsin-EDTA para células de fibroblastos de coelhos ou solução de descolamento de células para iPSCs humanos. Após a centrifugação, as células de ressuscita com 350 mL de tampão de lise (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA; pH 8,0, 10% SDS, adicionar 20 μL de 20 mg/mL de proteases K estoque por 1 mL de tampão de Lise), em seguida, incubar a 55 ° c durante a noite.</li>
	<li>Extraia o DNA genómico com fenol-clorofórmio usando procedimentos padrão.</li>
	<li>Amplify 100-200 BP fragmentos do ADN que contêm a região alvejada usando a polimerase de alta fidelidade do ADN, a seguir purificar os fragmentos do ADN dos géis usando um jogo da extração do gel ou diretamente dos produtos do PCR usando um mini jogo do PCR SV.</li>
	<li>Para determinar a eficiência de edição de genes por sequenciamento de colônias bacterianas, ligase os produtos de PCR purificados em um vetor pCR4-TOPO usando um kit de clonagem TOPO TA. Aleatoriamente pegar clones bacterianos, em seguida, sequenciar as inserções usando uma cartilha seqüenciamento universal fornecido pelo kit de clonagem TOPO TA.</li>
	<li>Para determinar a eficiência da edição do gene pelo seqüenciamento profundo, emita os produtos purified do PCR (~ 100-200 BP) da etapa 4,3 para o sequenciamento do amplicon de CRISPR em um núcleo de sequenciamento do ADN.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Cytosolic+Delivery+of+CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein+for+Efficient+Gene+Editing.">Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing.</a> ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).</li><li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo.">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li><li>Miller, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Viral+CRISPR/Cas+Gene+Editing+In+Vitro+and+In+Vivo+Enabled+by+Synthetic+Nanoparticle+Co-Delivery+of+Cas9+mRNA+and+sgRNA.">Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Administration+of+CRISPR/Cas9+Lipid+Nanoparticles+Achieves+Robust+and+Persistent+In+Vivo+Genome+Editing.">A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-targeted+delivery+of+CRISPR/Cas9+by+aptamer-functionalized+lipopolymer+for+therapeutic+genome+editing+of+VEGFA+in+osteosarcoma.">Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma.</a> Biomaterials. 147, 68-85 (2017).</li><li>Luo, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Specific+in+Vivo+Gene+Editing+Using+Cationic+Lipid-Assisted+Polymeric+Nanoparticles.">Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles.</a> ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).</li><li>Wang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+editing+via+CRISPR/Cas9+delivery+by+membrane-disruptive+and+endosomolytic+helical+polypeptide.">Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+homology-directed+gene+editing+by+CRISPR/Cas9+in+human+stem+and+primary+cells+using+tube+electroporation.">Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11649 (2018).</li><li>Du, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effect+of+young+oocytes+for+rabbit+somatic+cell+nuclear+transfer.">Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer.</a> Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).</li><li>Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneReviews(R). , (1993).</li><li>Friedman, J., et al., Adam, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+Pneumocystis+Infections+in+the+Lungs+of+Gene-Knockout+Rabbits+with+Severe+Combined+Immunodeficiency.">Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency.</a> Frontiers in Immunology. 9, 429 (2018).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+immunodeficient+rabbits+by+multiplex+embryo+transfer+and+multiplex+gene+targeting.">Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12202 (2017).</li></ol>

J. C. trabalha na empresa Celetrix LLC, fabricante do electroporator do tubo. L. M., L. J., J. S., D. Y., J. Z., Y. E. C., e J. X. não declaram interesses concorrentes.

O método do Electroporation do tubo era eficaz em entregar CRISPR/Cas9 RNP e ssODNs às pilhas do coelho e do ser humano, conduzindo à edição precisa robusta do gene (PGE). A principal diferença entre o TE e outros dispositivos convencionais de eletroporação é o uso de um tubo, no qual dois eletrodos estão na parte superior e inferior do tubo e a amostra é carregada na íntegra, em seguida, selada após a eletroporação (Figura 1). Em contrapartida, em uma cubeta convencional, os eletrodos estão nas laterais e a amostra não está totalmente selada durante a eletroporação. Este projeto novo reduz a geração da bolha de ar e comprime o tamanho da bolha de ar, que melhora conseqüentemente mesmo a distribuição da tensão elétrica, e em conseqüência conduz à morte de pilha reduzida e à eficiência elevada do transfection9. No presente trabalho, taxas elevadas de PGE (15%-37%) foram alcançados visando os genes EGFR, Mybpc3 e HBB em iPSCs humanos. Estes resultados são consistentes com um relatório prévio em que as taxas elevadas de PGE foram conseguidas em pilhas de haste humanas9.
As mutações causadoras da doença foram alvejadas em genes de IL2RG e de SPR em pilhas do coelho. Recentemente, os coelhos IL2RG-Knockout foram produzidos como modelos para a imunodeficiência combinada severa X-lig humana (scid-X1)16,17. O presente trabalho mostra que as mutações do paciente IL2RG (por exemplo, C231Y e Q235X) podem ser eficientemente geradas em células de coelhos, demonstrando a viabilidade da criação de modelos de coelhos SCID-X1 portadores de mutações do paciente. Também foi demonstrado que as mutações da SPR R150G podem ser eficientemente criadas em células de coelhos. Esta mutação provoca déficits motores e cognitivos em crianças12. Esses modelos de coelhos de mutação IL2RG e SPR, uma vez gerados, podem servir como modelos pré-clínicos valiosos para estudos translacionais. Eles também podem ser usados para estabelecer terapêutica baseada na edição de genes para essas doenças monogênicas.
Uma preocupação para aplicativos de edição de genes mediados por CRISPR/Cas9 é os eventos de edição fora do alvo. As taxas de Indel foram analisadas em sítios de topo fora do alvo previstos para sgRNAs utilizados neste estudo (tabela S1), utilizando métodos previamente descritos9. No total, foram analisados sete potenciais loci fora do alvo para SG-RB-IL2RG-01, cinco para SG-RB-SPR, sete para SG-hEGFR, cinco para SG-hMybpc3 e sete para SG-hHBB), utilizando os primers listados na tabela S2. Nenhum indels fora do alvo foi revelado pelos ensaios T7E1 (Figura S1), indicando riscos mínimos fora do alvo para a edição do gene MEDIADO por crispr/Cas9 usando estes sgRNAs. Igualmente indica que o método do Electroporation do tubo próprio não causa ou aumenta edições do fora-alvo. No entanto, os esforços devem ser dedicados para reduzir ou eliminar edições indesejáveis fora do alvo. O sequenciamento do genoma inteiro pode ser necessário para excluir tais eventos para as células que se destinam a ser utilizadas em aplicações clínicas.
No nível técnico, os seguintes são considerados fatores-chave para a obtenção de uma edição eficiente do genoma com a eletroporação de tubo CRISPR/Cas9 RNP. Primeiramente, é aconselhável selecionar um sgRNA eficiente com o baixo potencial fora-alvo previsto. É importante validar a eficiência do Indel do sgRNA selecionado antes de usá-lo para aplicações de PEG. Não é raro que um software previu bom sgRNA falha na etapa de validação.
Em segundo lugar, para conseguir o PGE elevado, recomenda-se induzir uma mutação de PAM ao doador de ssODN sempre que possível. A lógica é que, ao fazê-lo, o recorte CRISPR/Cas9 após a integração do modelo de doador é evitado. Em certos casos, o próprio PGE introduz mutações do PAM. Em outros casos, é possível introduzir mutações silenciosas na sequência do PAM. No caso de uma mutação do PAM não ser possível, é aconselhável tentar incluir várias mutações silenciosas no doador que corresponde à sequência de sgRNA.
Em terceiro lugar, particularmente relevante para TE, é importante evitar a formação de bolhas de ar ao transferir as células e a mistura de RNP para o tubo de eletroporação. Quando o projeto de um tubo do TE já minimiza a formação da bolha de ar, a manipulação cuidadosa reduzirá mais e pode mesmo terminar evita a formação da bolha de ar. Um guia de tiro de problemas para problemas freqüentes que podem ser encontrados na aplicação de eletroporação de tubo para a edição de gene precisa mediada por ribonucleoproteína CRISPR/Cas9 é fornecido na tabela 2.
Em conclusão, é demonstrado aqui que o electroporation do tubo é meios eficazes para a entrega de CRISPR/Cas9 RNP e de ssODNs às pilhas de mamífero para conseguir taxas elevadas de PGE. Esta técnica nova do transfection do TE e sua taxa precisa robusta da edição do gene podem facilitar o desenvolvimento de aplicações de edição do gene.

CRISPR/Cas9 é o nuclease programável o mais geralmente usado para a edição do gene. Trabalha com o único RNA do guia (sgRNA)-reconhecimento negociado de ambas as seqüências do alvo e uma seqüência adjacente do motivo do protospacer adjacente (PAM) no genoma. A nuclease Cas9 gera uma ruptura de DNA de duas cordas (DSB) localizada a partir de três nucleotídeos a montante da sequência PAM1. Os DSBs são reparados através das vias de junção de final não homólogas propensas a erros (NHEJ) ou de reparação dirigida por homologia (HDR). Para obter a edição precisa do gene através da via HDR, os modelos de doadores são frequentemente fornecidos no formato de DNA plasmídeo (pDNA) ou oligodeoxinucleotídeo de uma única fita (ssODN).
Crispr/Cas9 e o sgrna podem ser entregues nas células em três formatos: o complexo de ribonucleoproteína (RNP) de proteína Cas9 e grna2,3; Cas9 mRNA e sgrna4,5; ou DNA plasmídeo (PDNA) que contém os promotores necessários, sgrna impulsionado, e região de codificação de Cas96,7,8. Muitos grupos demonstraram que, quando CRISPR/Cas9 é entregue como RNP, a eficiência de edição de genes supera frequentemente as alcançadas nos formatos pDNA ou mRNA, atribuíveis ao tamanho muito menor de RNP em comparação com os ácidos nucleicos9. Além disso, tem sido mostrado previamente que uma máquina nova do Electroporation do tubo (TE) é particular eficaz em aplicações de edição do gene em diversos tipos da pilha9.
Apresentado no presente trabalho é um protocolo passo-a-passo na utilização de TE para a entrega de RNP CRISPR/Cas9 a células de mamíferos de diferentes espécies em vários locos clinicamente relevantes. Esta novela técnica do transfection do TE e o fenômeno elevado da taxa de HDR podem encontrar aplicações largas na pesquisa biomédica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1364px;" width="1364">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:279px;">Accutase</td>
			<td style="width:240px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:246px;">792</td>
			<td style="width:600px;">Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td style="width:240px;">IDT</td>
			<td style="width:246px;">1074182</td>
			<td style="width:600px;">Cas9 protein, first used in Step 3.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMEM</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:246px;">11965092</td>
			<td style="width:600px;">For cell culture, first used in Step 1.2.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>1708075</td>
			<td>For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Electroporation buffer</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">13&#8211;0104</td>
			<td style="width:600px;">The electroporation buffer, first used in Step 3.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:279px;">Electroporation tubes</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">20 &#956;L: 12&#8211;0107; 120 &#956;L: 12&#8211;0104</td>
			<td style="width:600px;">The electroporation tube, first used in Step 3.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">Electroporator</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">CTX-1500A LE</td>
			<td style="width:600px;">The tube electroporation machine, first used in Step 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:246px;">12003C</td>
			<td style="width:600px;">For cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forma CO2 Incubators</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>Model 370</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:240px;">Qiagen</td>
			<td style="width:246px;">28115</td>
			<td style="width:600px;">For gel purification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human&#160; induced pluripotent stem cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-1030</td>
			<td>Human iPSCs, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Matrigel&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Corning</td>
			<td style="width:246px;">354277</td>
			<td style="width:600px;">Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">mTeSR 1 medium&#160;</td>
			<td style="width:240px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:246px;">85850</td>
			<td style="width:600px;">Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PCR SV mini</td>
			<td style="width:240px;">GeneAll</td>
			<td style="width:246px;">103-102</td>
			<td style="width:600px;">For PCR product purification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td>For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol-chloroform</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td>For DNA extraction, first used in Step 4.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:240px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:246px;">A29377</td>
			<td style="width:600px;">For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K Solution</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>AM2548</td>
			<td>For DNA extraction, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:240px;">NEB</td>
			<td style="width:246px;">M0491</td>
			<td style="width:600px;">For PCR amplification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">TA Cloning Kit&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:246px;">K457502</td>
			<td style="width:600px;">For TA clone sequencing, first used in Step 4.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (10 cm)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353003</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.2.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (12 well)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353043</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 3.7.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (6 cm)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353004</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP1757-500</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For cell digestion, first used in Step 1.2. 4.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Universal Fit Pipette Tips&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td>14-0101</td>
			<td>For electroporation, first used in Step 3.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Y27632</td>
			<td style="width:240px;">LC Labs</td>
			<td style="width:246px;">Y-5301</td>
			<td style="width:600px;">The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation

As nucleases de edição genética, representadas pela proteína 9 (Cas9) associada à CRISPR, estão se tornando ferramentas mainstream na pesquisa biomédica. A entrega bem-sucedida de elementos CRISPR/Cas9 nas células alvo por transfecção é um pré-requisito para a edição eficiente do gene. Este protocolo demonstra que a entrega mediada por máquina do Electroporation do tubo (TE) do ribonucleoprotein de CRISPR/Cas9 (RNP), junto com moldes único-encalhado do doador do oligodeoxynucleotide (ssODN) aos tipos diferentes de pilhas de mamíferos, conduz a robusto eventos de edição de genes precisos. Primeiramente, o te foi aplicado para entregar crispr/Cas9 RNP e ssodns para induzir mutações causadoras da doença no gene da subunidade gama (IL2RG) do receptor da interleucina 2 e no gene da redutase do sepiapterina (SPR) em pilhas do fibroblasto do coelho. As taxas de mutação precisa de%-20% foram conseguidas como determinado pelo sequenciamento bacteriano da clonagem de TA. A mesma estratégia foi usada então em iPSCs humanos em diversos genes clìnica relevantes que incluem o receptor epidérmico do fator de crescimento (EGFR), a proteína de ligação C do miosina, cardíaco (Mybpc3), e beta da subunidade da hemoglobina (HBB). Consistentemente, as taxas de mutação altamente precisas foram alcançadas (11.65%-37,92%) como determinado pelo seqüenciamento profundo (DeepSeq). O presente trabalho demonstra que o electroporation do tubo de CRISPR/Cas9 RNP representa um protocolo eficiente do transfection para a edição do gene em pilhas de mamíferos.

TE de Cas9 RNP e ssODNs a células de fibroblastos de coelhos
O processo global de fornecimento mediado por TE de Cas9 RNP para células de mamíferos é ilustrado na Figura 1. Primeiramente, as mutações C231Y e Q235X foram produzidas no gene IL2RG, e a mutação R150G foi produzida no gene do SPR em pilhas do fibroblasto do coelho. As mutações da perda--função em genes de IL2RG e de SPR são sabidas para causar a imunodeficiência preliminar11 e os deficits do motor e os cognitivos12, respectivamente.
Os designs sgRNA específicos são ilustrados na Figura 2a. Os primers utilizados para amplificar as regiões visadas estão listados na tabela 3. As sequências de ssODNs são mostradas na tabela 1. As taxas de edição do gene foram determinadas por clonagem de at bacteriana (Figura 2b). No locus IL2RG SP c231, dos 28 clones que foram seqüenciados, um (3,57%) transportou a mutação C231Y precisa, quatro (14,28%) de inserção ou deleção (Indel), e os restantes 23 (82%) eram selvagens-tipo. No locus IL2RG Q235, dos 27 clones que foram seqüenciados, dois (7,41%) carregou a mutação Q235X precisa, três realizaram mutações do Indel (11,11%) e os restantes eram de tipo selvagem. No locus SPG r150, dos 20 clones seqüenciados, cinco (25%) transportou a mutação R150G precisa, 10 (50%) transportou mutações do Indel, e o restante era selvagem-tipo.
TE de Cas9 RNP e ssODNs para iPSCs humanos
O TE foi então utilizado para entregar o RNP e o ssODNs de Cas9 a iPSCs humanos e segmentar os Locos clinicamente relevantes nos genes EGFR, Mybpc3 e HBB. As mutações pontuais na região proximal do EGFR T790 conferem resistência aos inibidores da tirosina quinase do EGFR em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) que abriam Mutações ativadoras do EGFR13. Uma mutação do Frameshift no exon 16 em Mybpc3 é implicada na cardiomiopatia hipertrófica14. A mutação de ponto E6V no gene de HBB conduz à doença de pilha de Sickle15.
Os designs sgRNA específicos são ilustrados na Figura 3a. Os primers utilizados para amplificar as regiões visadas estão listados na tabela 3. As sequências de ssODNs são mostradas na tabela 1. As taxas de edição do gene foram determinadas pelo DeepSeq (Figura 3B). No locus EGFR, 15,68% dos alelos carregavam as mutações pontuais exatas (6.315 leituras), 22,75% carregavam mutações no Indel (9.162 leituras), e os restantes 61,57% eram de tipo selvagem (24.797 leituras). No locus Mybpc3, 37,92% carregavam o apagamento exato de 4-BP TGAA (11.654 leituras), 2,24% carregavam mutações no Indel (410 leituras) e os restantes 59,84% eram Wild-Type (18.692 leituras). No locus HBB, 11,65% carregavam a mutação E6V precisa (6.565 leituras), 23,35% carregavam mutações do Indel (13.163 leituras) e os restantes 65% eram Wild-Type (36.644 leituras).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig1.jpg"> Figura 1: fluxograma do Electroporation do tubo de Cas9 RNP.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig2.jpg"> Figura 2 : Edição do gene de pilhas do fibroblasto do coelho. (A) ilustração das sequências alvo. As caixas indicam loci alvejado. As letras sublinhadas correspondem às sequências gRNA. As letras coloridas vermelhas indicam seqüências de PAM. (B) ta clonagem de resultados de eventos de edição de genes. Caixas indicam precisamente loci mutado. A seqüência de Indel mostrada é somente representativa de um tipo do alelo. Outras sequências Indel não são mostradas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig3.jpg"> Figura 3 : Edição do gene de iPSCs humanos. (A) ilustração das sequências alvo. As caixas indicam loci alvejado. As letras sublinhadas correspondem à sequência gRNA. As letras coloridas vermelhas indicam seqüências de PAM. (B) resultados deepseq de eventos de edição de genes. Caixas indicam precisamente loci mutado. As letras coloridas vermelhas indicam as mutações silenciosas que foram introduzidas nos moldes do doador. A seqüência de Indel mostrada é somente representativa de um tipo do alelo. Outras sequências Indel não são mostradas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Locus</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">
Sequência de oligo 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>(mutação direcionada)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coelho IL2RG (C231Y)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTATGGGAGTGCTCAGCATTGGAGT GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coelho IL2RG (Q235X)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGAGTGCTTAGCATTGGAGT GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Coelho SPR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">gacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtgaacatctcgtcgctgtgtgccctgcagcccttcaagggctggg o cgctgtac</td>
		</tr>
<tr>
<td>(R150G)</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGFR humano</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">ACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCTACAGTCCAACTGATTACCC AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Mutações pontuais centesimal a T790)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Human Mybpc3</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGACCAGCTGGTGATGGTGGGGCAGCGGGTGGAGTTTGCGAGGTATCGGA O GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>(supressão de 4 BP)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBB humano</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC O CTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>E6V</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: sequências de ssODNs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passo</td>
			<td>Problema</td>
			<td>Razões possíveis</td>
			<td>Soluções</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,1</td>
			<td>Baixa taxa de Indel</td>
			<td>Projeto pobre do RNA do guia, estoques do RNA do guia > 6 meses, baixa concentração do RNA do guia</td>
			<td>Redesenho guia RNA, produzir/encomendar novo guia RNA.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,3</td>
			<td>Baixa eficiência de PGE</td>
			<td>projeto de DNA de doadores pobres, baixo RNA guia eficiente, quantidade incorreta de DNA doador ou DNA de má qualidade</td>
			<td>Aumente o comprimento do braço do homologia, introduz a mutação de Pam, introduz mutações silenciosas ao ADN do doador, usa um RNA mais eficiente do guia, otimiza a relação da proteína Cas9 sobre o RNA do guia.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,4</td>
			<td>Falha na transfecção</td>
			<td>Bolhas de ar formadas durante a transferência de células-buffer de mistura para tubo de Electroporation, tensão incorreta/ajuste de duração</td>
			<td>Tente evitar a formação de bolhas de ar, ajustar a tensão/ajuste de duração.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,6</td>
			<td>baixa viabilidade celular após eletroporação</td>
			<td>Baixa sobrevida de um único IPSC humano</td>
			<td>Adicione o inibidor da rocha após o electroporation, aumente o número de pilhas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,1</td>
			<td>PCR falhado</td>
			<td>Alto conteúdo GC, ou sequência repetitiva</td>
			<td>Otimize a condição do PCR, adicione o sistema de DMSO ao PCR.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: guias de Troubleshooting para problemas freqüentes.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome da cartilha</td>
			<td>Seqüência</td>
			<td>Nota</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-IL2RG-F</td>
			<td>CATGACAGTGACAGGGTCCC</td>
			<td rowspan="2">Para amplificar o fragmento do ADN IL2RG do coelho</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-IL2RG-R</td>
			<td>TGCCAGAGACACAAGCGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-SPR-F</td>
			<td>O GTACTTTGGAGGGACAGAGG</td>
			<td rowspan="2">Para amplificar o fragmento do ADN do SPR do coelho</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-SPR-R</td>
			<td>O CTCAGCACCCTGACACTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-F</td>
			<td>TGATGGCCAGCGTGGACAAC</td>
			<td rowspan="2">Para amplificar o fragmento de DNA EGFR humano</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-R</td>
			<td>ACCAGTTGAGCAGGTACTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-F</td>
			<td>ATGCCCCGTGCTTCTGGAAC</td>
			<td rowspan="2">Para amplificar fragmento de DNA Mybpc3 humano</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-R</td>
			<td>TCAGGGGAGCCAACCCTCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-F</td>
			<td>TAACCTTGATACCAACCTGC</td>
			<td rowspan="2">Para amplificar o fragmento humano do ADN de HBB</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-R</td>
			<td>Método CATTTGCTTCTGACACAACT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: primers usados na etapa 4,3.

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CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

É apresentado aqui um protocolo para a edição eficiente do gene de CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-negociado em pilhas de mamíferos usando o electroporation do tubo.

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Entregar com segurança e eficácia elementos Cas9 nas células é fundamental para terapias baseadas em edição de genes. Os protocolos que mostramos aqui mostram uma nova abordagem nessa direção. O protocolo utiliza um novo método de eletroporação chamado eletroporação de tubos.Isso leva a altas taxas de sobrevivência celular, bem como taxas de edição de genes. O método de eletroporação do tubo é vírus, droga, e o enriquecimento repórter livre. Estes são preferidos em aplicações clínicas, por isso, com terapias baseadas em edição de genes.O método é universalmente aplicável a muitos tipos de células. Por exemplo, células hematopoiéticas humanas, células T primárias e outras células podem ser editadas usando nosso método. Este método de eletroporação do tubo usa um tubo fino.Se você é um usuário de primeira vez, você pode tentar GFP expressando DNA plasmídeo. Demonstrando o procedimento será Linyuan Ma, um pós-doutor do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, adquira iPSCs humanos da American Type Culture Collection.Cultura os iPSCs em matriz extracelular artificial com meio de cultura celular livre de alimentador em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono seguindo as instruções do fornecedor. Duas horas antes da transfecção tratar os iPSCs com 10 micromolar rho-associated bobina enrolada contendo inibidor de proteína quinase Y-27632. Ao transfetar, dissociar iPSCs com solução de descolamento celular para células únicas a 37 graus Celsius por cinco minutos.Então conte o número de células. Para estabelecer uma cultura de células fibroblastos de coelho obtenha uma biópsia da pele da orelha da ponta de uma orelha de coelho. Enxágüe o tecido duas vezes com DPBS contendo 5% de penicilina-estreptomicina.Transfira o tecido da orelha enxaguado para um novo prato de cultura tecidual de seis centímetros e corte o tecido em pequenos pedaços, cada um cerca de um por um milímetro. Adicione algumas gotas de FBS para evitar que o tecido seque. Depois disso, espalhe o tecido desfiado em um prato de cultura de tecido de 10 centímetros e adicione 10 mililitros de meio de cultura.Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três a cinco dias. Três a cinco dias após o uso de revestimento Trypsin-EDTA para digerir as células a 37 graus Celsius por dois minutos, em seguida, contar o número de células. Depois de projetar e sintetizar os gRNAs e oligos doadores, prepare as células como descrito anteriormente.Resuspend 20 a 30.000 células em 20 microliters de tampão de eletroporação. Pipeta para cima e para baixo cuidadosamente para produzir uma única suspensão celular. Para transfecção Cas9 RNP, pré-misture dois microgramas de proteína Cas9 NLS com 0,67 microgramas de gRNA em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos.Misture suavemente o complexo RNP formado com dois microgramas de ssODN com células. Usando dicas universais de pipeta do kit de eletroporação, transfira a mistura celular para um tubo de eletroporação de 20 microliter. Coloque o tubo de eletroporação na ranhura do eletroporador e pressione para terminar.Um ciclo de eletroporação bem sucedido é indicado pelo relatório de pulso na tela de exibição do eletroporador. Após a eletroporação transferir as células iPS humanas para um mililitro de Y-27632 pré-aquecido contendo meio de cultura como descrito anteriormente. Em seguida, emplaque as células resuspended em um poço de uma placa de cultura celular de 12 poços.Continue a cultivar o prato, certificando-se de mudar o meio de cultura todos os dias. Y-27632 é removido do meio de cultura iPSC humano 24 horas após a eletroporação. 72 horas após a eletroporação, colmeia as células.Para células de fibroblasto de coelho, use Trypsin-EDTA para digerir as células da placa de cultura. Para iPSCs humanos, use solução de descolamento celular para digerir as células das placas de cultura. Centrifugar brevemente as amostras a 1000 rpm por cinco minutos, e resuspensar as células com 350 mililitros de tampão de lise.Incubar durante a noite a 55 graus Celsius. No dia seguinte extrair o DNA genômico com fenol-clorofórmio usando procedimentos padrão. Amplie de 100 a 200 bases pares de fragmentos de DNA de géis usando um kit de extração de gel ou diretamente de produtos PCR usando um mini kit PCR SV.Para determinar a eficiência de edição de genes por sequenciamento de colônias bacterianas, use um kit de clonagem TOPO-TA para ligar os produtos PCR purificados em um vetor PCR4-TOPO. Pegue aleatoriamente clones bacterianos e sequencie as pastilhas usando um primer de sequenciamento universal fornecido pelo kit de clonagem TOPO-TA. Para determinar a eficiência de edição de genes por sequenciamento profundo, envie os produtos PCR purificados previamente obtidos para sequenciamento crispr amplicon em um núcleo de sequenciamento de DNA.Neste estudo, um método de eletroporação de tubos é efetivamente usado para fornecer CRISPR/Cas9 RNP e SsODNs para células coelhos e humanas, levando a uma edição de genes robusta e precisa. Primeiro, as mutações C231Y e Q235X são produzidas no gene IL2RG, e a mutação R150G é produzida no gene SPR em células fibroblastos de coelho. Os desenhos sgRNA específicos e as taxas de edição de genes determinadas pela clonagem de TA bacteriana são mostrados aqui.O lócus IL2RG C231, dos 28 clones sequenciados, um carrega a mutação C231Y precisa, quatro mutações de inserção ou exclusão de transporte, e os 23 restantes são do tipo selvagem. No lócus IL2RG Q235, dos 27 clones sequenciados, dois carregam a mutação precisa de Q235X, três carregam uma mutação indel, e o restante é tipo selvagem. No lócus SPG R150, dos 20 clones sequenciados, cinco carregam a mutação genética R150 precisa, 10 carregam mutações indel, e o restante é do tipo selvagem.A eletroporação de tubos é então usada para fornecer Cas9 RNP e ssODNs para iPSCs humanos e atingir loci clinicamente relevante nos genes EGFR, Mybpc3 e HBB. No lócus EGFR, 15,68% dos alelos carregam as mutações precisas de pontos, 22,75% carregam mutações indelés e os 61,57% restantes são do tipo selvagem. No lócus Mybpc3, 37,92% carregam a exclusão de TGAA de quatro pares base precisos, 2,24% carregam mutações indel e os 59,84% restantes são do tipo selvagem.No lócus do HBB, 11,5% carregam a mutação precisa do E6V, 35,4% carregam mutações indel e os 65% restantes são do tipo selvagem. Cas9 RNP é a forma preferida de Cas9 devido ao seu tamanho menor em comparação com o DNA plasmídeo. A eletroporação do tubo é um método eficaz para entregar Cas9 RNP.Estamos particularmente interessados em utilizar a eletroporação de tubo de Cas9 RNP em células T primárias para aplicações CAR T.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Mapeamento QTL e edição CRISPR / Cas9 para identificar um gene de resistência a medicamentos em<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Genética

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene edição para fazer condicional mutantes de humano parasita da malária por p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

Edição de genoma mediado por CRISPR-Cas9 no Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...