Name: crispr/cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation
Uploaded: 2019-06-20T13:00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation at JoVE.com

Detta arbete stöddes av de nationella hälso instituten (R21OD023194 till JX). Detta arbete utnyttjas Core Services stöds av centrum för avancerade modeller för translationell vetenskap och Therapeutics (CAMTraST) vid University of Michigan Medical Center.

Alla djur skötsel-, skötsel-och användnings procedurer granskades och godkändes av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén (IACUC) vid University of Michigan.
1. beredning av celler
<ol><li>
Förvärva mänskliga iPSCs (ACS-1030) från American typ Culture Collection (ATCC). Kultur iPScs på konstgjord extracellulär matris med feeder-fri cell odlings substrat (se material tabell) i en cell kultur inkubator (5% CO2 vid 37 ° c) enligt leverantörens anvisningar.
	<ol>
<li>2 h före transfektion, behandla iPSCs med 10 μM Rho-associerad, spiral-spole som innehåller protein Kinas (ROCK) hämmare Y27632 (vars användning minskar apoptos av separerade mänskliga hiPSCs och ökar överlevnad och kloning effektivitet av hiPSCs utan som påverkar deras pluripotens).</li>
		<li>När transfecting, dissociera iPSCs med cell avlossning lösning (se tabell över material) till enstaka celler vid 37 ° c i 5 min. räkna cell numret.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etablera en kanin fibroblast cell kultur med hjälp av en primär kultur kanin öron vävnad biopsier, som tidigare beskrivits10.
	<ol>
<li>En 0,5 cm x 0,5 cm öron hudbiopsi erhålls från spetsen av kaninörat. Raka håret från öron vävnaden.</li>
		<li>Skölj 2x med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) med 5% penicillin-streptomycin. Överför öron vävnaden till en ny 6 cm vävnad kultur skålen, sedan klippa vävnaden i små bitar (~ 1,0 mm x 1,0 mm). Tillsätt några droppar av fetalt bovint serum för att förhindra att vävnaden torkar ut.</li>
		<li>Sprid strimlad vävnad till en 10 cm vävnad kultur skålen, tillsätt sedan 10 mL odlings substrat. Kanin fibroblast celler odlas i Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medium (DMEM) med 10% Foster bovint serum. Placera vävnads odlings skålen i cell kulturens inkubator (5% CO2 vid 37 ° c).</li>
		<li>Tre till fem dagar efter plätering, Använd trypsin-EDTA för att smälta cellerna vid 37 ° c i 2 min. räkna cell numret.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. design och syntes av gRNAs och givar oligos
<ol><li>För varje gen, Design Guide RNA baserat på sekvensen av riktade Locus med hjälp av ett online-verktyg (till exempel < http://crispor.tefor.net/>).</li>
	<li>Klistra in i DNA-sekvensen av intresse.</li>
	<li>Välj ett genom och protospacer-angränsande motiv (PAM). Möjliga guide sekvenser i DNA-sekvenser kommer att visas på utmatnings sidan. Det rekommenderas att välja gRNA med högre förväntad effektivitet och lägre off-Target potentialer.</li>
	<li>Syntetisera DNA av en kommersiell leverantör för att transkribera gRNAs. Utför in vitro-transkription av gRNA med en gRNA-syntessats enligt tillverkarens anvisningar.</li>
	<li>Rena gRNA med hjälp av en RNA rening Micro kolumn ingår i gRNA syntes kit. Mät koncentrationen och förvara sedan gRNAs vid-80 ° c.</li>
	<li>Designa en ssODN-givar mall för varje mutationplats. Den ssODNs kan syntetiseras av kommersiella leverantörer som IDT. I allmänhet är varje ssodn 120-160 nukleotider (NT) i längd, bestående av 60-80 NT i den vänstra homologi armen och 60-80 NT i den högra homologi armen. För att förhindra omskärning av det redigerade DNA, bör en tyst mutation vid PAM införas i ssODN när det är möjligt. CRISPR-klippplatsen bör placeras så nära den avsedda genomiska förändringen som möjligt.</li>
</ol>3. rör elektroporation av Cas9 RNP och ssODNs
<ol><li>Förbered cellerna enligt beskrivningen i avsnitt 1.</li>
	<li>Omsuspendera 2-3 x 105 celler i 20 μl elektroporationbuffert. Pipettera upp och ner försiktigt för att framställa en encellig SUS pension.</li>
	<li>För Cas9 RNP-transfektion, premix 2 μg Cas9-NLS-protein med 0,67 μg gRNA vid rums temperatur (RT) för 10-15 min. Blanda sedan försiktigt det bildade RNP-komplexet tillsammans med 2 μg ssODN med celler.</li>
	<li>Överför cell blandningen till ett 20 μL elektroporationsslang med hjälp av Universal Fit pipettspetsar som tillhandahålls av rör elektroporationssatsen. För att uppnå bättre elektroporation, försök att undvika bildandet av luft bubblor under överföringen.</li>
	<li>Placera elektroporationsröret i uttaget på elektroporatorn och tryck på "go" för att avsluta. Följ tillverkarens föreslagna parametrar för varje cell typ. Till exempel, för mänskliga iPSCs och kanin fibroblast celler, spänningen som är 420 V och puls tid är 30 ms. en lyckad elektroporationscykel indikeras av puls rapporten på elektroporatorns skärm.</li>
	<li>Efter elektroporationen, överföra de mänskliga iPS-cellerna till 1 mL förvärmda Y-27632-innehållande odlings medium som beskrivs i cell kultur delen. För kanin fibroblast celler, överföra dem till DMEM med 10% Foster bovint serum.</li>
	<li>Platta de återsuspenderade cellerna till en brunn av en 12 brunn cell kultur plattan.</li>
	<li>Ändra odlings mediet varje dag. Y-27632 tas bort från den mänskliga iPSC kultur medium 24 h efter elektroporation.</li>
</ol>4. analys av gen redigerings händelser
<ol><li>Harvest celler 72 h efter elektroporation. Smälta celler från kulturen plattan med trypsin-EDTA för kanin fibroblast celler eller cell avlossning lösning för mänskliga iPSCs. Efter Centrifugera, omsuspendera celler med 350 mL lyseringsbuffert (1 M Tris HCl, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, pH 8,0, 10% SDS, tillsätt 20 μL 20 mg/mL proteinas K-lager per 1 mL lyseringsbuffert), och inkubera sedan vid 55 ° c över natten.</li>
	<li>Extrahera genomiskt DNA med fenol-kloroform med standard procedurer.</li>
	<li>Amplifiera 100-200 BP DNA fragment som innehåller mål regionen med HiFi-DNA-polymeras, sedan rena DNA fragment från geler med hjälp av en gel extraktion Kit eller direkt från PCR produkter med hjälp av en PCR SV mini kit.</li>
	<li>För att bestämma gen redigering effektivitet genom bakteriell koloni sekvensering, Ligase de renade PCR-produkter i en pCR4-TOPO vektor med en TOPO TA kloning kit. Slumpmässigt plocka upp bakterie kloner, sedan sekvens insatserna med hjälp av en universell sekvensering primer som tillhandahålls av TOPO TA kloning kit.</li>
	<li>För att bestämma gen redigering effektivitet genom djup sekvensering, skicka renade PCR-produkter (~ 100-200 BP) från steg 4,3 för crispr amplikon sekvensering i en DNA-sekvensering kärna.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Cytosolic+Delivery+of+CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein+for+Efficient+Gene+Editing.">Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing.</a> ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).</li><li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo.">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li><li>Miller, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Viral+CRISPR/Cas+Gene+Editing+In+Vitro+and+In+Vivo+Enabled+by+Synthetic+Nanoparticle+Co-Delivery+of+Cas9+mRNA+and+sgRNA.">Non-Viral CRISPR/Cas Gene Editing In Vitro and In Vivo Enabled by Synthetic Nanoparticle Co-Delivery of Cas9 mRNA and sgRNA.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (4), 1059-1063 (2017).</li><li>Finn, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single+Administration+of+CRISPR/Cas9+Lipid+Nanoparticles+Achieves+Robust+and+Persistent+In+Vivo+Genome+Editing.">A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing.</a> Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).</li><li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-targeted+delivery+of+CRISPR/Cas9+by+aptamer-functionalized+lipopolymer+for+therapeutic+genome+editing+of+VEGFA+in+osteosarcoma.">Tumor cell-targeted delivery of CRISPR/Cas9 by aptamer-functionalized lipopolymer for therapeutic genome editing of VEGFA in osteosarcoma.</a> Biomaterials. 147, 68-85 (2017).</li><li>Luo, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-Specific+in+Vivo+Gene+Editing+Using+Cationic+Lipid-Assisted+Polymeric+Nanoparticles.">Macrophage-Specific in Vivo Gene Editing Using Cationic Lipid-Assisted Polymeric Nanoparticles.</a> ACS Nano. 12 (2), 994-1005 (2018).</li><li>Wang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+editing+via+CRISPR/Cas9+delivery+by+membrane-disruptive+and+endosomolytic+helical+polypeptide.">Nonviral gene editing via CRISPR/Cas9 delivery by membrane-disruptive and endosomolytic helical polypeptide.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4903-4908 (2018).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+homology-directed+gene+editing+by+CRISPR/Cas9+in+human+stem+and+primary+cells+using+tube+electroporation.">Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11649 (2018).</li><li>Du, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effect+of+young+oocytes+for+rabbit+somatic+cell+nuclear+transfer.">Beneficial effect of young oocytes for rabbit somatic cell nuclear transfer.</a> Cloning Stem Cells. 11 (1), 131-140 (2009).</li><li>Allenspach, E., Rawlings, D. J., Scharenberg, A. M., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneReviews(R). , (1993).</li><li>Friedman, J., et al., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneReviews(R). , (1993).</li><li>Hidaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+T790M+mutations+are+present+on+the+same+EGFR+allele+as+activating+mutations+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer.">Most T790M mutations are present on the same EGFR allele as activating mutations in patients with non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 108, 75-82 (2017).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+pathogenic+gene+mutation+in+human+embryos.">Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos.</a> Nature. 548 (7668), 413-419 (2017).</li><li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+Pneumocystis+Infections+in+the+Lungs+of+Gene-Knockout+Rabbits+with+Severe+Combined+Immunodeficiency.">Bacterial and Pneumocystis Infections in the Lungs of Gene-Knockout Rabbits with Severe Combined Immunodeficiency.</a> Frontiers in Immunology. 9, 429 (2018).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+immunodeficient+rabbits+by+multiplex+embryo+transfer+and+multiplex+gene+targeting.">Production of immunodeficient rabbits by multiplex embryo transfer and multiplex gene targeting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12202 (2017).</li></ol>

J. C. arbetar på Celetrix LLC, tillverkare av röret elektroporator. L. M., L. J., J. S., D. Y., J. Z., Y. E. C., och J. X. deklarera inget konkurrerande intresserar.

Röret elektroporation metod var effektivt för att leverera CRISPR/Cas9 RNP och ssODNs till kanin och mänskliga celler, vilket leder till robust exakt gen redigering (PGE). Den främsta skillnaden mellan TE och andra konventionella elektroporation anordningar är användningen av ett rör, där två elektroder är på toppen och botten av röret och provet lastas i sin helhet sedan förseglade på elektroporation (figur 1). Däremot, i en konventionell kyvetten, elektroderna är på sidorna och provet är inte helt förseglade under elektroporation. Denna nya design minskar luft bubblor generation och komprimerar luft bubbla storlek, vilket därmed förbättrar även distribution av elektrisk spänning, och som ett resultat leder till minskad celldöd och hög transfektion effektivitet9. I det nuvarande arbetet har höga PGE-räntor (15%-37%) uppnåddes riktade mot EGFR-, Mybpc3-och HBB-gener i humana iPSCs. Dessa resultat överensstämmer med en tidigare rapport där höga PGE-frekvenser uppnåddes i mänskliga stamceller9.
Sjukdomsframkallande mutationer var inriktade på IL2RG och SPR gener i kanin celler. Nyligen har IL2RG-knockout kaniner producerats som modeller för mänskliga X-länkade svår kombinerad immun brist (scid-x1)16,17. Det nuvarande arbetet visar att patient IL2RG mutationer (t. ex. C231Y och Q235X) effektivt kan genereras i kanin celler, vilket visar möjligheten att skapa SCID-x1 kanin modeller redovisade patient mutationer. Det visades också att SPR R150G-mutationer effektivt kan skapas i kanin celler. Denna mutation orsakar motoriska och kognitiva underskott hos barn12. Dessa IL2RG och SPR mutation kanin modeller, en gång genererade, kan tjäna som värdefulla prekliniska modeller för translationella studier. De kan också användas för att etablera genredigeringsbaserade terapier för dessa monogena sjukdomar.
Ett bekymmer för CRISPR/Cas9-medierade gen redigerings program är off-Target redigering händelser. Indel-kurserna analyserades vid förutsedda topp-off-Target-platser för sgRNAs som användes i denna studie (tabell S1), med metoder som tidigare beskrivits9. Sammanlagt analyserades sju potentiella topp-Target loci för SG-RB-IL2RG-01, fem för SG-RB-SPR, sju för SG-hEGFR, fem för SG-hMybpc3 och sju för SG-hHBB), med primers listade i tabell S2. Ingen off-Target indels avslöjades av T7E1 analyser (figur S1), vilket tyder på minimala off-Target risker för crispr/Cas9-medierad gen redigering med hjälp av dessa sgRNAs. Det visar också att röret elektroporation metoden i sig inte orsakar eller öka off-Target redigeringar. Insatserna bör dock inriktas på att minska eller eliminera oönskade redigeringar utanför mål. Hel-genom-sekvensering kan behövas för att utesluta sådana händelser för celler som är avsedda att användas i kliniska tillämpningar.
På teknisk nivå anses följande vara viktiga faktorer för att uppnå effektiv exakt genom redigering av CRISPR/Cas9 RNP Tube electroporation. Först är det klokt att välja en effektiv sgRNA med förväntad låg off-Target potential. Det är viktigt att validera indel effektiviteten i den valda sgRNA innan du använder den för PEG applikationer. Det är inte ovanligt att en program vara förutspådde bra sgRNA Miss lyckas vid validerings steget.
För det andra, för att uppnå hög PGE, rekommenderas att inducera en PAM mutation till ssODN givaren när det är möjligt. Logiken är att genom att göra så, CRISPR/Cas9 re-Cutting efter givar mal len integration förhindras. I vissa fall introducerar PGE själv PAM-mutationer. I andra fall är det möjligt att introducera tysta mutationer i PAM-sekvensen. I händelse av att en PAM-mutation inte är möjlig, är det tillrådligt att försöka inkludera flera tysta mutationer i givaren som motsvarar sgRNA sekvens.
För det tredje, särskilt relevant för TE, är det viktigt att undvika bildandet av luft bubblor vid överföring av celler och RNP blandning till elektroporation röret. Medan utformningen av en TE-röret minimerar redan luft bubbla bildas, noggrann hantering kommer att ytterligare minska och kan även slutföra undvika luft bubbla formation. En fel sökning guide för frekventa problem som kan uppstå vid applicering av rör elektroporation för CRISPR/Cas9 ribonukleoprotein medierad exakt gen redigering finns i tabell 2.
Sammanfattnings vis är det visat här att röret elektroporation är ett effektivt sätt för leverans av CRISPR/Cas9 RNP och ssODNs till däggdjurs celler för att uppnå höga PGE priser. Denna nya TE-transfektion teknik och dess robusta exakta gen redigering hastighet kan under lätta utvecklingen av gen redigerings program.

CRISPR/Cas9 är den mest använda programmerbara nukleasen för gen redigering. Det fungerar genom single guide RNA (sgRNA)-medierad erkännande av både målsekvenser och en intilliggande protospacer intilliggande motiv (PAM) sekvens i genomet. Den Cas9 nuclease genererar en dubbelsträngad DNA-paus (DSB) ligger tre nukleotider uppströms PAM sekvens1. De DSBs repare ras antingen genom fel benägna icke-homologa sammanfogning (NHEJ) eller Homology-riktad reparation (HDR) vägar. För att uppnå exakt gen editering genom HDR-vägen ges ofta givar mallar i formatet plasmid DNA (pDNA) eller enkelsträngad oligodeoxynucleotid (ssODN).
Crispr/Cas9 och sgrna kan levereras till cellerna i tre format: ribonukleoprotein (RNP) komplex av Cas9 protein och grna2,3; Cas9 mRNA och sgrna4,5; eller plasmid DNA (pdna) som innehåller nödvändiga initiativtagare, driven sgrna, och Cas9 kodning region6,7,8. Många grupper har visat att när CRISPR/Cas9 levereras som RNP, den gen redigering effektivitet överträffar ofta de som uppnås i pDNA eller mRNA format, som kan hänföras till den mycket mindre storlek RNP jämfört med nukleinsyror9. Dessutom har det tidigare visats att en ny rör elektroporation (TE)-maskin är särskilt effektiv vid gen editerings tillämpningar i flera cell typer9.
Presenteras i det nuvarande arbetet är ett steg-för-steg-protokoll för att använda TE för leverans av CRISPR/Cas9 RNP till däggdjurs celler av olika arter vid flera kliniskt relevanta loci. Denna roman TE transfektion teknik och hög HDR frekvens fenomen kan hitta breda tillämpningar inom biomedicinsk forskning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1364px;" width="1364">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:279px;">Accutase</td>
			<td style="width:240px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:246px;">792</td>
			<td style="width:600px;">Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td style="width:240px;">IDT</td>
			<td style="width:246px;">1074182</td>
			<td style="width:600px;">Cas9 protein, first used in Step 3.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMEM</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:246px;">11965092</td>
			<td style="width:600px;">For cell culture, first used in Step 1.2.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>1708075</td>
			<td>For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Electroporation buffer</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">13&#8211;0104</td>
			<td style="width:600px;">The electroporation buffer, first used in Step 3.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:279px;">Electroporation tubes</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">20 &#956;L: 12&#8211;0107; 120 &#956;L: 12&#8211;0104</td>
			<td style="width:600px;">The electroporation tube, first used in Step 3.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:279px;">Electroporator</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td style="width:246px;">CTX-1500A LE</td>
			<td style="width:600px;">The tube electroporation machine, first used in Step 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:240px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:246px;">12003C</td>
			<td style="width:600px;">For cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forma CO2 Incubators</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>Model 370</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:240px;">Qiagen</td>
			<td style="width:246px;">28115</td>
			<td style="width:600px;">For gel purification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human&#160; induced pluripotent stem cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ACS-1030</td>
			<td>Human iPSCs, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Matrigel&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Corning</td>
			<td style="width:246px;">354277</td>
			<td style="width:600px;">Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">mTeSR 1 medium&#160;</td>
			<td style="width:240px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:246px;">85850</td>
			<td style="width:600px;">Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">PCR SV mini</td>
			<td style="width:240px;">GeneAll</td>
			<td style="width:246px;">103-102</td>
			<td style="width:600px;">For PCR product purification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td>For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol-chloroform</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>15593031</td>
			<td>For DNA extraction, first used in Step 4.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:240px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:246px;">A29377</td>
			<td style="width:600px;">For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K Solution</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>AM2548</td>
			<td>For DNA extraction, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Q5 high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td style="width:240px;">NEB</td>
			<td style="width:246px;">M0491</td>
			<td style="width:600px;">For PCR amplification, first used in Step 4.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">TA Cloning Kit&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:246px;">K457502</td>
			<td style="width:600px;">For TA clone sequencing, first used in Step 4.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (10 cm)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353003</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.2.3.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (12 well)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353043</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 3.7.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish (6 cm)</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353004</td>
			<td>For cell culture, first used in Step 1.2.2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP1757-500</td>
			<td>For making lysis buffer, first used in Step 4.1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:240px;">Thermo Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For cell digestion, first used in Step 1.2. 4.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Universal Fit Pipette Tips&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Celetrix</td>
			<td>14-0101</td>
			<td>For electroporation, first used in Step 3.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Y27632</td>
			<td style="width:240px;">LC Labs</td>
			<td style="width:246px;">Y-5301</td>
			<td style="width:600px;">The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9 ribonucleoprotein-mediated precise gene editing by tube electroporation

Genredigerande nukleaser, föret rädda av CRISPR-Associated protein 9 (Cas9), blir mainstream verktyg inom biomedicinsk forskning. Framgångs rik leverans av CRISPR/Cas9 element till mål cellerna genom transfektion är en förutsättning för effektiv gen redigering. Detta protokoll visar att rör elektroporation (te) maskinmedierad tillförsel av crispr/Cas9 ribonukleoprotein (RNP), tillsammans med enkelsträngade givar mallar för oligodeoxinukleotidsyntes (ssodn) till olika typer av däggdjurs celler, leder till robusta exakta gen redigerings händelser. Först, te tillämpades för att leverera crispr/Cas9 RNP och ssodns att inducera sjukdomsframkallande mutationer i interleukin 2 receptor subenhet gamma (IL2RG) genen och sepiapterin reduktas (SPR) genen i kanin fibroblast celler. Exakta mutations frekvenser på 3.57% uppnåddes som bestämdes av bakteriell TA-klonings-sekvensering. Samma strategi användes sedan i mänskliga ipscs på flera kliniskt relevanta gener inklusive Epidermal tillväxtfaktor receptor (EGFR), myosin bindande protein C, hjärt (Mybpc3), och hemoglobin subenhet beta (HBB). Konsekvent, mycket exakta mutations frekvenser uppnåddes (11.65%-37,92%) bestäms av djup sekvensering (DeepSeq). Det nuvarande arbetet visar att tubelektroporation av CRISPR/Cas9 RNP representerar ett effektivt transfektionssystem för gen editering i däggdjurs celler.

TE av Cas9 RNP och ssODNs till kanin fibroblast celler
Den övergripande processen för TE-medierad leverans av Cas9 RNP till däggdjurs celler illustreras i figur 1. Första, C231Y och Q235X mutationer producerades i IL2RG genen, och R150G mutation producerades i SPR genen i kanin fibroblast celler. Förlust av funktion mutationer i IL2RG och SPR gener är kända för att orsaka primär immun brist11 och motor och kognitiva underskott12, respectively.
De specifika sgRNA-konstruktionerna illustreras i figur 2A. De primers som används för att förstärka de riktade regionerna listas i tabell 3. Sekvenser av ssODNs visas i tabell 1. Gen editerings frekvensen bestämdes av bakteriell TA-kloning (figur 2b). Vid IL2RG C231 Locus, av de 28 klonerna som sekvenserades, en (3,57%) den exakta C231Y-mutationen, fyra (14,28%) infogning eller radering (indel) mutationer, och resterande 23 (82%) var vildtyp. Vid IL2RG Q235 Locus, av de 27 klonerna som sekvenserades, två (7,41%) den exakta Q235X-mutationen, tre burna indelmutationer (11,11%) och de kvarvarande var vildtyp. Vid SPG R150 Locus, av de 20 klonerna sekvenserade, fem (25%) bar den exakta R150G-mutationen, 10 (50%) indelmutationer och de kvarvarande var vildtyp.
TE av Cas9 RNP och ssODNs till mänsklig iPSCs
TE användes sedan för att leverera Cas9 RNP och ssODNs till humana iPSCs och rikta kliniskt relevant loci i EGFR, Mybpc3, och HBB gener. Punkt mutationer i EGFR T790 proximala regionen ger resistens mot EGFR tyrosinkinashämmare hos patienter med icke-småcellig lung cancer (NSCLC) hyser aktiverande mutationer av EGFR13. En frameshift-mutation i eXoN 16 i Mybpc3 är inblandad i hypertrofisk kardiomyopati14. E6V-punktmutationen i HBB-genen leder till sicklecellanemi15.
De specifika sgRNA-designerna illustreras i figur 3a. De primers som används för att förstärka de riktade regionerna listas i tabell 3. Sekvenser av ssODNs visas i tabell 1. Gen redigerings frekvensen bestämdes av DeepSeq (figur 3b). Vid EGFR-Locus, 15,68% av alleler bar exakt punkt mutationer (6 315 läsningar), 22,75% burna indel mutationer (9 162 läsningar), och de återstående 61,57% var vild-typ (24 797 läsningar). Vid Mybpc3 Locus, 37,92% bar den exakta 4-BP TGAA radering (11 654 läser), 2,24% burna indel mutationer (410 läsningar) och resterande 59,84% var vild-typ (18 692 läsningar). Vid HBB-Locus, 11,65% bar den exakta E6V mutationen (6 565 läsningar), 23,35% burna indel mutationer (13 163 läsningar) och resterande 65% var vildtyp (36 644 läsningar).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig1.jpg"> Figur 1: flödes schema för rör elektroporation av Cas9 RNP.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig2.jpg"> Figur 2 : Gen redigering av kanin fibroblast celler. Aillustration av målsekvenser. Rutor anger riktad Loki. Understrukna bokstäver motsvarar gRNA-sekvenser. Röda färgade bokstäver visar PAM-sekvenser. (B) ta kloning resultat av gen redigering händelser. Rutorna anger exakt muterad loci. Indel sekvens som visas är endast representativ för en allel typ. Andra indel-sekvenser visas inte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59512/59512fig3.jpg"> Figur 3 : Gen redigering av mänskliga iPSCs. Aillustration av målsekvenser. Rutor anger riktad Loki. Understrukna bokstäver motsvarar gRNA-sekvensen. Röda färgade bokstäver visar PAM-sekvenser. (B) deepseq resultat av gen redigering händelser. Rutorna anger exakt muterad loci. Röda färgade bokstäver indikerar tysta mutationer som infördes i donatormallarna. Indel sekvens som visas är endast representativ för en allel typ. Andra indel-sekvenser visas inte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59512/59512fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Locus</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">
Oligo sekvens 
			 </td>
		</tr>
<tr>
<td>(riktad mutation)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanin IL2RG (C231Y)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTATGGGAGTGCTCAGCATTGGAGT Mer från GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanin IL2RG (Q235X)</td>
			<td colspan="8">AGCGTGGATGGGCAGAAACTCTACACGTTCCGAGTCCGGAGCCGTTTTAACCCTTTGTGTGGGAGTGCTTAGCATTGGAGT Mer från GAATGGAGCCACCCGATCCACTGGGGGAGCAAAACTTCAAAGGGTAAAATGGGCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kanin SPR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">gacctccatgctctgcctgacctcctgcatcctgaaggcgtttcctgccagtcctggCctcagcgggactgtggtgaacatctcgtcgctgtgtgccctgcagcccttcaagggctggg Mer från cgctgtac</td>
		</tr>
<tr>
<td>(R150G)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Humant EGFR</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">ACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCTACAGTCCAACTGATTACCC AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Punkt mutationer omedelbara till T790)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mänsklig Mybpc3</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">GCCCCCTGTGCTCATCACGCGCCCCTTGGAGGACCAGCTGGTGATGGTGGGGCAGCGGGTGGAGTTTGCGAGGTATCGGA Mer från GGAGGGGGCGCAAGTCAAATGGTGAGTTCCAGAAGCACGGGGCATGGGTGTTGGGGGCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>(4-BP radering)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mänsklig HBB</td>
			<td colspan="8" rowspan="2">TCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCAGTTACTGCC Mer från CTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>(E6V)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: sekvenser av ssODNs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Steg</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Möjliga orsaker</td>
			<td>Lösningar</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,1</td>
			<td>Låg indel ränta</td>
			<td>Dålig guide RNA design, guide RNA bestånd > 6 månader, låg guide RNA koncentration</td>
			<td>Redesign guide RNA, producera/beställa ny guide RNA.</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,3</td>
			<td>Låg PGE-effektivitet</td>
			<td>dålig DNA-design, lågt effektivt styr-RNA, felaktig mängd givar-DNA eller dålig DNA-kvalitet</td>
			<td>Öka homologi armen längd, införa pam mutation, införa tysta mutationer till givaren DNA, använda en mer effektiv guide RNA, optimera förhållandet mellan Cas9 protein över guide RNA.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,4</td>
			<td>Misslyckad transfektion</td>
			<td>Luft bubblor bildas vid överföring av celler-buffert blandning till elektroporation röret, felaktig spänning/varaktighet inställning</td>
			<td>Försök att undvika bildandet av luft bubblor, justera spänning/varaktighet inställning.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,6</td>
			<td>låg cell lönsamhet efter elektroporation</td>
			<td>Låg överlevnad av enstaka mänskliga IPSC</td>
			<td>Tillsätt ROCK-hämmare efter elektroporation, öka antalet celler.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,1</td>
			<td>Misslyckad PCR</td>
			<td>Hög GC-innehåll eller repetitiv sekvens</td>
			<td>Optimera PCR-tillstånd, tillsätt DMSO till PCR-systemet.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: fel söknings guider för frekventa problem.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Namn på primer</td>
			<td>Sekvens</td>
			<td>Observera</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-IL2RG-F</td>
			<td>Mer från CATGACAGTGACAGGGTCCC</td>
			<td rowspan="2">För förstärkning av kanin IL2RG DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-IL2RG-R</td>
			<td>Mer från TGCCAGAGACACAAGCGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-SPR-F</td>
			<td>Mer från GTACTTTGGAGGGACAGAGG</td>
			<td rowspan="2">För förstärkt kanin SPR DNA fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>RB-SPR-R</td>
			<td>Mer från CTCAGCACCCTGACACTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-F</td>
			<td>Mer från TGATGGCCAGCGTGGACAAC</td>
			<td rowspan="2">För förstärkning av humant EGFR DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-EGFR-R</td>
			<td>Mer från ACCAGTTGAGCAGGTACTGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-F</td>
			<td>Mer från ATGCCCCGTGCTTCTGGAAC</td>
			<td rowspan="2">För förstärkning av humant Mybpc3 DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-Mybpc3-R</td>
			<td>Mer från TCAGGGGAGCCAACCCTCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-F</td>
			<td>TAACCTTGATACCAACCTGC</td>
			<td rowspan="2">För förstärkning av humant HBB DNA-fragment</td>
		</tr>
<tr>
<td>H-HBB-R</td>
			<td>Mer från CATTTGCTTCTGACACAACT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: primers som används i steg 4,3.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation at JoVE.com

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-medierad exakt gen redigering av Tube Electroporation

Presenteras här är ett protokoll för effektiv CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medierad gen redigering i däggdjurs celler med hjälp av rör elektroporation.

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Säkert och effektivt leverera Cas9 element i celler är avgörande för genredigering baserade terapier. De protokoll vi visar här visar en ny strategi i den riktningen. Protokollet utnyttjar en ny elektroporationsmetod som kallas rörelektroporation.Detta leder till hög cellulär överlevnad samt genredigering priser. Röret elektroporation metod är virus, drog, och reportern anrikning gratis. Dessa är att föredra i kliniska tillämpningar, så med genredigering baserade terapier.Metoden är universellt tillämplig på många celltyper. Till exempel mänskliga hematopoetiska celler, primära T-celler och andra celler kan alla redigeras med vår metod. Denna rörelektroderingsmetod använder ett tunt rör.Om du är en första gången användare, kan du prova GFP uttrycker plasmid DNA. Demonstrera förfarandet kommer att Linyuan Ma, en postdoc från mitt laboratorium. För att börja detta förfarande förvärva mänskliga iPSCs från den amerikanska typ kultursamling.Odla iPSCs på konstgjord extracellulär matris med matarfritt cellodlingsmedium i en inkubator för cellodling vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid enligt leverantörens anvisningar. Två timmar före transfection behandla iPSCs med 10 micromolar Rho-associerade spole som innehåller proteinkinashämmare Y-27632. Vid transfecting, dissociate iPSCs med cellavlossning lösning till enstaka celler vid 37 grader Celsius i fem minuter.Räkna sedan antalet celler. För att upprätta en kanin fibroblast cell kultur erhålla ett öra hud biopsi från spetsen av en kanin öra. Skölj vävnaden två gånger med DPBS som innehåller 5%penicillin-streptomycin.Överför den sköljda öronvävnaden till en ny sex centimeter vävnadskulturskål och skär vävnaden i små bitar, var och en ungefär en efter en millimeter. Tillsätt några droppar FBS för att förhindra att vävnaden torkar ut. Efter detta, sprida strimlad vävnad i en 10 centimeter vävnad kultur maträtt och tillsätt 10 milliliter av kultur medium.Inkubera cellerna i 37 grader Celsius med 5%koldioxid i tre till fem dagar. Tre till fem dagar efter plätering använda Trypsin-EDTA att smälta cellerna på 37 grader Celsius i två minuter, sedan räkna antalet celler. Efter att ha konstruerat och syntetisera gRNAs och givaren oligos, förbereda cellerna som tidigare beskrivits.Resuspend 20 till 30, 000 celler i 20 mikroliter av elektroporation buffert. Pipett upp och ner försiktigt för att producera en enda cell suspension. För Transfection av Cas9 RNP, förblanda två mikrogram Cas9 NLS-protein med 0,67 mikrogram gRNA vid rumstemperatur i 10 till 15 minuter.Blanda försiktigt det bildade RNP-komplexet med två mikrogram ssODN med celler. Med hjälp av universalpipettsspetsar från elektroporationssatsen överför du cellblandningen till ett 20 mikroliterelektroneringsrör. Placera elektroporationsröret i skåran på elektroporatorn och tryck gå till.En lyckad elektroporationscykel indikeras av pulsrapporten på elektroporatorns displayskärm. Efter den electroporation överföra de mänskliga iPS-cellerna till en milliliter av förvuppvade Y-27632 som innehåller odlingsmedium som tidigare beskrivits. Sedan platta de återanvända cellerna i en brunn av en 12-brunn cellodling tallrik.Fortsätt att odla plattan, se till att ändra kulturmediet varje dag. Y-27632 avlägsnas från den mänskliga iPSC kultur medium 24 timmar efter electroporation. 72 timmar efter elektroporation, skörda cellerna.För en kanin fibroblast celler, använd Trypsin-EDTA att smälta cellerna från odlingsplattan. För mänskliga iPSCs använda cellavlossning lösning för att smälta cellerna från odlingsplattorna. Kort centrifugera proverna på 1000 rpm i fem minuter, och återanvända cellerna med 350 milliliter lysbuffert.Inkubera över natten vid 55 grader Celsius. Nästa dag extrahera arvsmassans DNA med fenol-kloroform med hjälp av standardförfaranden. Amplify 100 till 200 baser par av DNA-fragment från geler med hjälp av antingen en kit gel extraktion eller direkt från PCR produkter med hjälp av en PCR SV mini kit.För att bestämma genen redigering effektivitet genom bakteriell koloni sekvensering, använd en TOPO-TA kloning kit för att ligate de renade PCR produkter till en PCR4-TOPO vektor. Slumpmässigt plocka upp bakteriella kloner och sekvens inläggen med hjälp av en universell sekvensering primer som tillhandahålls av TOPO-TA kloning kit. För att bestämma genredigeringseffektiviteten genom djupsekvensering, skicka de tidigare erhållna renade PCR-produkterna för CRISPR ampliconsekvensering i en DNA-sekvenseringskärna.I denna studie används en tube electroporation metod effektivt för att leverera CRISPR/Cas9 RNP och ssODNs till kanin och mänskliga celler, vilket leder till robust, exakt genredigering. Först produceras C231Y och Q235X mutationer i GENEN IL2RG, och R150G mutationen produceras i SPR genen i kanin fibroblast celler. De specifika sgRNA-konstruktionerna och de genredigeringshastigheter som bestäms av bakteriell TA-kloning visas här.IL2RG C231 locus, av de 28 kloner sekvenserade, bär man den exakta C231Y mutation, fyra bära införing eller borttagning mutationer, och de återstående 23 är vild-typ. Vid IL2RG Q235 locus, av de 27 kloner sekvenserade, två bär den exakta Q235X mutation, tre bära en indel mutation, och de återstående är vilda-typ. Vid SPG R150 locus, av de 20 kloner sekvenserade, fem bär den exakta R150 genmutation, 10 bära indel mutationer, och de återstående är vilda-typ.Tube elektroporation används sedan för att leverera Cas9 RNP och ssODNs till mänskliga iPSCs och rikta kliniskt relevant lokus i EGFR, Mybpc3, och HBB gener. Vid EGFR locus, 15,68%av alleler bära exakt punkt mutationer, 22,75%bära indel mutationer, och de återstående 61,57%är vild-typ. Vid Mybpc3 locus, 37,92%bära exakt fyra basparet TGAA borttagning, 2,24%bära indel mutationer, och de återstående 59,84%är vilda typ.Vid HBB locus, 11,5%bära den exakta E6V mutationen, 35,4%bär indel mutationer, och de återstående 65%är vild-typ. Cas9 RNP är den föredragna formen av Cas9 på grund av dess mindre storlek i jämförelse med plasmid DNA. Röret elektroporation är en effektiv metod för att leverera Cas9 RNP.Vi är särskilt intresserade av att utnyttja rörelektronation av Cas9 RNP i primära T-celler för CAR T-applikationer.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartläggning och CRISPR / Cas9 redigering för att identifiera en läkemedelsresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Urval-beroende och oberoende generering av CRISPR / Cas9-medierade genknockouts i däggdjursceller

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetod att undersöka Hotellets mutagenicitet som en funktion av punktmutation reparation katalyseras av CRISPR/Cas9 och SsODN i mänskliga celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroskop av CRISPR/Cas9 Protein till kanal havskatt, Ictalurus punctatus, embryon för Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion och identifiering av CRISPR/Cas9-genererade gen Knockouts i det modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Införa en gen knockout direkt i Amastigote skede av Trypanosoma cruzi med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Medierad genomredigering i den fintrådiga Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...