Name: use of a linear accelerator for conducting in vitro radiobiology experiments
Uploaded: 2019-05-26T13:00:00
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Wir danken der Cleveland Clinic Department of Radiation Oncology für den Einsatz der Linearbeschleuniger. Wir danken Dr. Jeremy Rich für sein großzügiges Geschenk an Gliom-Stammzellen. Diese Forschung wurde von der Cleveland Clinic unterstützt.

1. Zellpräparat zur Suspensionszellkultur
<ol><li>Kulturgliom-Stammzellen in Stammzellkulturmedien bei ca. 5 x 106 Zell/10 cm Platten in einem Zellkultur-Inkubator mit 5% CO2, 95% relativer Luftfeuchtigkeit bei 37 °C. HINWEIS: Die Zellkulturbedingung ist in allen Prozeduren gleich. Die im Protokoll verwendeten Medien sind vollständige Medien.</li>
	<li>Zwei Tage vor der geplanten Bestrahlung sammeln Gliom-Stammzellen von der Kulturplatte mit einer sterilen 5 ml Pipette in ein 15 ml Zentrifug...

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+radiotherapy+with+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+versus+radiotherapy+alone+on+survival+in+glioblastoma+in+a+randomised+phase+III+study:+5-year+analysis+of+the+EORTC-NCIC+trial.">Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial.</a> The Lancet Oncology. 10 (5), 459-466 (2009).</li><li>Tao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+imaging+in+upper+gastrointestinal+tumors+and+application+to+radiation+therapy.">Hypoxia imaging in upper gastrointestinal tumors and application to radiation therapy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1044-1053 (2018).</li><li>Gajiwala, S., Torgeson, A., Garrido-Laguna, I., Kinsey, C., Lloyd, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+immunotherapy+and+radiation+therapy+strategies+for+pancreatic+cancer-targeting+multiple+steps+in+the+cancer+immunity+cycle.">Combination immunotherapy and radiation therapy strategies for pancreatic cancer-targeting multiple steps in the cancer immunity cycle.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1014-1026 (2018).</li><li>Liney, G. P., Whelan, B., Oborn, B., Barton, M., Keall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI-Linear+accelerator+raiotherapy+systems.">MRI-Linear accelerator raiotherapy systems.</a> Clinical Oncology Journal | The Royal College of Radiologists. 30 (11), 686-691 (2018).</li><li>Hall, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+dose-rate:+a+factor+of+importance+in+radiobiology+and+radiotherapy.">Radiation dose-rate: a factor of importance in radiobiology and radiotherapy.</a> The British Journal of Radiology. 45 (530), 81-97 (1972).</li><li>Steel, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dose-rate+effect+in+human+tumour+cells.">The dose-rate effect in human tumour cells.</a> Radiotherapy &amp; Oncology. 9 (4), 299-310 (1987).</li><li>Ling, C. C., Gerweck, L. E., Zaider, M., Yorke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-rate+effects+in+external+beam+radiotherapy+redux.">Dose-rate effects in external beam radiotherapy redux.</a> Radiotherapy &amp; Oncology. 95 (3), 261-268 (2010).</li><li>Castro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amotosalen/UVA+treatment+inactivates+T+cells+more+effectively+than+the+recommended+gammadose+for+prevention+of+transfusion-associated+graft-versus-host+disease.">Amotosalen/UVA treatment inactivates T cells more effectively than the recommended gammadose for prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 58 (6), 1506-1515 (2018).</li><li>Gaddini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposing+primary+rat+retina+cell+cultures+to+&#947;-rays:+An+in+vitro+model+for+evaluating+radiation+responses.">Exposing primary rat retina cell cultures to &#947;-rays: An in vitro model for evaluating radiation responses.</a> Experimental Eye Research. 166, 21-28 (2018).</li><li>Simara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+reprogramming+and+long-term+in+vitro+culturing.">DNA double-strand breaks in human induced pluripotent stem cell reprogramming and long-term in vitro culturing.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 73 (2017).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+biological+effects+of+125I+seeds+continuous+low-dose-rate+radiation+and+60Co+high-dose-rate+gamma+radiation+on+non-small+cell+lung+cancer+cells.">A comparison of the biological effects of 125I seeds continuous low-dose-rate radiation and 60Co high-dose-rate gamma radiation on non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0133728 (2015).</li><li>Lasio, G., Guerrero, M., Goetz, W., Lima, F., Baulch, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+varying+dose-per-pulse+and+average+dose+rate+in+X-ray+beam+irradiation+on+cultured+cell+survival.">Effect of varying dose-per-pulse and average dose rate in X-ray beam irradiation on cultured cell survival.</a> Radiation and Environmental Biophysics. 53 (4), 671-676 (2014).</li><li>Karan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiobiological+effects+of+altering+dose+rate+in+filter-free+photon+beams.">Radiobiological effects of altering dose rate in filter-free photon beams.</a> Physics in Medicine and Biology. 58 (4), 1075-1082 (2013).</li><li>Sarojini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+high+dose+rate+(10X+FFF/2400+MU/min/10+MV+X-rays)+and+total+low+dose+(0.5+Gy)+induces+a+higher+rate+of+apoptosis+in+melanoma+cells+in+vitro+and+superior+preservation+of+normal+melanocytes.">A combination of high dose rate (10X FFF/2400 MU/min/10 MV X-rays) and total low dose (0.5 Gy) induces a higher rate of apoptosis in melanoma cells in vitro and superior preservation of normal melanocytes.</a> Melanoma Research. 25 (5), 376-389 (2015).</li><li>Hao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+extra+high+on+glioma+stem-like+cells.">The effects of extra high on glioma stem-like cells.</a> PLoS One. 13 (8), 0202533 (2018).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+G2/M+arrest+rarely+occurred+in+glioblastoma+stem-like+cells.">Radiation-induced G2/M arrest rarely occurred in glioblastoma stem-like cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (4), 394-402 (2018).</li><li>Mcdermott, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Physics and Technology of Radiation Therapy. , (2010).</li><li>Lohse, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high+dose+per+pulse+flattening+filter-free+beams+on+cancer+cell+survival.">Effect of high dose per pulse flattening filter-free beams on cancer cell survival.</a> Radiotherapy &amp; Oncology. 101 (1), 226-232 (2011).</li></ol>

Strahlentherapie ist ein integraler Bestandteil des Krebsmanagements. Die laufenden Bemühungen zielen darauf ab, die Wirksamkeit und Effizienz der Strahlenbehandlung zu verbessern. Fortschritte in der Linearbeschleunigertechnologie haben die Möglichkeit geboten, Patienten mit beispielloser Genauigkeit und Sicherheit zu behandeln. Da die meisten Patienten mit hochenergetischen Röntgenstrahlen von Linearbeschleunigern behandelt werden, können Studien, die die biologischen Auswirkungen einer großen Bandbreite von Dosis...

Strahlentherapie ist eine wirksame Behandlung für viele Arten von Krebs1,2,3,4. Die Bestrahlung mit besonders hoher Dosisrate ist relativ neu in der Strahlentherapie und wird durch die jüngsten technologischen Fortschritte bei Linearbeschleunigernermöglicht 5. Klinische Vorteile einer extra hohen Dosisrate gegenüber der Standarddosisbestrahlung sind verkürzte Behandlungszeit und verbesserte Patientenerfahrung. Linearbeschleuniger bieten auch einen klinischen Rahmen für zellkulturbasierte strahlungsbiologische Studien. Die biologischen und therapeutischen Implikationen von Strahlendosis und Dosisraten sind seit Jahrzehnten ein Schwerpunkt von Strahlenonkologen und Biologen6,7,8. Aber die Radiobiologie der extra hohen Dosisbestrahlung und Blitzbestrahlung - eine extrem hohe Strahlendosis - muss noch gründlich untersucht werden.
Gammastrahlenbestrahlung ist weit verbreitet in der zellkulturbasierten Strahlungsbiologie9,10,11. Strahlung wird durch Gammastrahlen erreicht, die aus zerfallenden radioaktiven Isotopenquellen, typischerweise Cäsium-137, emittiert werden. Die Nutzung radioaktiver Quellen ist stark reguliert und oft eingeschränkt. Mit quellenbasierter Bestrahlung ist es eine Herausforderung, eine breite Palette von Dosisraten zu testen und seinen Nutzen bei der Analyse der biologischen Wirkungen klinisch erzielbarer Dosisraten12zu begrenzen.
Es gab mehrere Studien, die sowohl Dosis- als auch Dosisrate-Effekte veranschaulichen12,13,14,15,16,17. In diesen Studien wurden sowohl Gamma-Bestrahlungen aus radioaktiven Isotopen als auch Röntgenstrahlen aus Linearbeschleunigern verwendet. Es wurden eine Vielzahl von Zelllinien verwendet, die Lungenkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Glioblastom und Melanom darstellen. Strahleneffekte auf das Zellüberleben, Zellzyklusstillstand, Apoptose und DNA-Schäden wurden als Auslesungenausgewertet 12,13,14,15,16,17 . Hier beschreiben wir eine Methode zur Definition der biologischen Auswirkungen klinisch relevanter Strahlendosis und -dosisraten durch die Bereitstellung von röntgenbasierter Strahlung mittels eines Linearbeschleunigers. Diese Studien sollten in enger Zusammenarbeit zwischen dem Biologen, Strahlenonkologen und dem medizinmedizinischen Physiker durchgeführt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:925px;" width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Material</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">glioma stem-like cell 4121</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>gift from Dr. Jeremy Rich</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">293 cells</td>
			<td style="width:269px;">ATCC</td>
			<td style="width:183px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">neuron stem cell culture media</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">21103049</td>
			<td>NeurobasalTM media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">10569044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Recombinant Human EGF Protein</td>
			<td style="width:269px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Recombinant Human FGF basic</td>
			<td style="width:269px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>4114-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">B-27&#8482; Supplement</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tripsin-EDTA</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:183px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">extracellular proten matrix</td>
			<td style="width:269px;">Corning</td>
			<td style="width:183px;">354277</td>
			<td style="width:167px;">MatrigelTM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ethanol</td>
			<td style="width:269px;">Fisher chemical</td>
			<td style="width:183px;">A4094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Equipment</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10 cm cell culture dish</td>
			<td style="width:269px;">Denville</td>
			<td style="width:183px;">T1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">3.5 cm cell culture dish</td>
			<td style="width:269px;">USA Scientific Inc.</td>
			<td style="width:183px;">CC7682-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">22x22mm glass cover slip</td>
			<td style="width:269px;">electron microscopy sciences</td>
			<td style="width:183px;">72210-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">15 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:269px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:183px;">1159M36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">50 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:269px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:183px;">1158R10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">5 ml Pipette</td>
			<td style="width:269px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">14-955-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pipet aid</td>
			<td style="width:269px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">13-681-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:269px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:183px;">5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Linear Accelerator</td>
			<td style="width:269px;">Varian</td>
			<td style="width:183px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">water equivalent material</td>
			<td style="width:269px;">Sun Nuclear corporation</td>
			<td style="width:183px;">557</td>
			<td>Solid waterTM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Reagent preparation</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:307px;">DMEM media</td>
			<td style="width:269px;">10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 &#181;g/mL streptomycin in 500 ml DMEM media</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:307px;">stem cell culture media</td>
			<td style="width:269px;">10 ml B27 supplement, 20 &#181;g hFGF, 20 &#181;g hEGF, 2 mM L-glutamine, 100 units/mL penicillin G, 100 &#181;g/mL streptomycin in 500 ml Neurobasal media</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a linear accelerator for conducting in vitro radiobiology experiments

Die Strahlentherapie bleibt einer der Eckpfeiler des Krebsmanagements. Für die meisten Krebsarten ist es die effektivste, nicht-chirurgische Therapie, um Tumore zu entwirn. Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestrahlung von Krebszellen mit einem Linearbeschleuniger. Die Weiterentwicklung der Linearbeschleunigertechnologie hat die Präzision und Effizienz der Strahlentherapie verbessert. Die biologischen Auswirkungen einer Vielzahl von Strahlendosen und -dosen sind nach wie vor ein intensives Untersuchungsgebiet. Die Verwendung von Linearbeschleunigern kann diese Studien mit klinisch relevanten Dosen und Dosisraten erleichtern.

Um den Zellzykluseffekt der Standarddosisrate und der extra hohen Dosisrate bestrahlung durch einen Linearbeschleuniger zu untersuchen, wurden mit diesem Protokoll drei Proben von glioma-stammähnlichen Zellen erstellt und 24 h nach Bestrahlung gesammelt17: eine Kontrollprobe nicht bestrahlt wurde (Abbildung 2A), eine mit 400 MU/min bestrahlte Probe (Monitoreinheit, 4,2 Gy/min Standarddosisrate, Abbildung 2B</stro...

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Use of a Linear Accelerator for Conducting In Vitro Radiobiology Experiments

Einsatz eines Linearbeschleunigers zur Durchführung von In-Vitro-Radiobiologieexperimenten

Klinische Linearbeschleuniger können verwendet werden, um biologische Wirkungen einer Vielzahl von Dosisraten auf Krebszellen zu bestimmen. Wir diskutieren, wie ein Linearbeschleuniger für zellbasierte Assays und Assays für Krebsstammzellen-ähnliche Zellen eingerichtet werden kann, die als Tumorsphären in Suspensionund und Zelllinien als anhaftende Kulturen angebaut werden.

Radiation therapy remains one of the cornerstones of cancer management. For most cancers, it is the most effective, nonsurgical therapy to debulk tumors. ...

Die Strahlentherapie wird am häufigsten mit Linearbeschleunigern geliefert. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die biologischen Auswirkungen von Strahlung auf Zellen mit einem Linearbeschleuniger zu bewerten. Der Vorteil dieser Technik ist, dass Forscher mit Hilfe eines Linearbeschleunigers eine breite Palette klinisch relevanter Dosen und Dosisraten untersuchen können.Darüber hinaus kann dieses Protokoll für alle Arten von Krebszellen verwendet werden. Diese Methode kann mit ähnlichen Geräten wie die hier gezeigten durchgeführt werden. Zum Beispiel Linearbeschleuniger, die von anderen Anbietern hergestellt werden.Personen, die nicht in der Durchführung dosimetrischer Berechnungen mit einem Linearbeschleuniger erfahren sind, können Schwierigkeiten haben, die richtige Anzahl von Monitoreinheiten zu berechnen, die erforderlich sind, um die gewünschte Dosis an die Probe zu liefern. Sie würden davon profitieren, wenn sie sich von einem erfahrenen Medizinphysiker oder Dosimetristen beraten lassen. Die genaue Abgabe der Dosis an die Probe mit einem Linearbeschleuniger erfordert eine sorgfältige Platzierung.Zwei Tage vor der geplanten Bestrahlung, die in einer Kulturhaube arbeitet, verwenden Sie eine sterile Fünf-Milliliter-Pipette, um Gliom-Stamm-ähnliche Zellen von einer Kulturplatte in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal g für drei Minuten in einer Arbeitsplatte Zentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit einem Milliliter Trypsin-EDTA wieder auf.Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten, um das Pellet zu verdauen und eine Einzelzellsuspension in Trypsin-EDTA zu machen. Alle zwei Minuten während der Verdauung, schütteln Sie vorsichtig den Boden des Zentrifugenrohrs, um sicherzustellen, dass die Zellen gründlich verdaut werden. Dann fügen Sie drei Milliliter Stammzellkulturmedien hinzu, um Trypsin zu löschen, sanft zu mischen und zentrifugieren bei 200 mal g für drei Minuten in einer Arbeitsplatte Zentrifuge.Nach dem Wegwerfen des Überstandes, setzen Sie das Zellpellet mit fünf Milliliterzellkulturmedien wieder auf und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Platte fünf Millionen Zellen in zwei 10-Zentimeter-Platten mit 10 Milliliterzellkulturmedien geteilt und inkubieren 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Unmittelbar vor der geplanten Bestrahlung die Zellen und Zentrifugen wie zuvor sammeln.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit fünf Millilitern Zellkulturmedien wieder auf. Übertragen Sie einen Milliliter Zellsuspension in eine 35-Millimeter-Platte mit zwei Milliliterzellkulturmedium, um sicherzustellen, dass das Medium eine Höhe von einem Zentimeter erreicht. Übertragen Sie die vergoldeten Zellen in einen sekundären Behälter, um das Kontaminationsrisiko zu verringern, und bringen Sie die Zellen im Behälter auf einem Gebrauchswagen zur Bestrahlungsanlage, um die Zellen zu bestrahlen.Einen Tag vor der Bestrahlung, die in der Zellkulturhaube arbeitet, verwenden Sie eine Pasteur Pipette, die mit einem Vakuum verbunden ist, um DMEM-Medium von der Zellkulturplatte an die angeschlossene Zelllinie zu entfernen. Dann waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern sterilen PBS, um Restmedium abzuspülen. Fügen Sie einen Milliliter Trypsin-EDTA in das Kulturgericht und neigen Sie die Kulturplatte vorsichtig, um sicherzustellen, dass das gesamte Gericht abgedeckt ist.Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für fünf Minuten, löschen Sie die Trypsin-EDTA-Reaktion mit drei Milliliter DMEM-Medien. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Zellen in 15 Milliliter Zentrifugenrohr, Zentrifuge zu sammeln, und kulticultureieren Sie dann die Zellen, wie im Manuskript beschrieben. Um diese zuvor vorbereiteten Zellen mit der Konsolensoftware des LINAC zu bestrahlen, stellen Sie den Beschleunigerportal und den Kollimator auf null Grad, öffnen Sie die x- und y-Kiefer auf eine symmetrische Feldgröße von fünf mal fünf Quadratzentimetern und ziehen Sie die mehrblättrigen Kollimatoren zurück.Fügen Sie mindestens fünf Zentimeter wasseräquivalentes Material auf die Behandlungscouch und legen Sie die zu bestrahlende Zellschale in die Mitte der LINAC-Fadenkreuze. Legen Sie die Zellen in einer maximalen Dosistiefe in einen sechs Megavolt-Röntgenstrahl um 1,5 Zentimeter und fügen Sie einen zusätzlichen Zentimeter wasseräquivalentes Material auf die Schale. Befestigen Sie den vorderen Zeiger am Kopf des LINAC und verlängern Sie ihn, bis er die Oberfläche des Aufbaumaterials berührt.Passen Sie die Tischhöhe an, bis der Abstand von der Quelle zur Aufbaufläche 100 Zentimeter beträgt. Verlassen Sie den Behandlungstresor, um sicherzustellen, dass alle anderen Personen gegangen sind. Stellen Sie sicher, dass sich keine anderen Zellen im Raum befinden, und schließen Sie dann die Tresortür.Bestätigen Sie die Feldgröße, überwachen Sie Einheiten und überwachen Sie Einheiten pro Minute an der Konsole, und aktivieren Sie dann den Strahl für eine Strahlungszelle. Mit diesem Protokoll wurden drei Proben von Gliom-Stammzellen hergestellt und 24 Stunden nach der Bestrahlung gesammelt. Dort wurden Zellzyklusprofile berechnet und mit den Prozentsätzen der Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus dargestellt.Der G2-Zellzyklusstillstand wurde nach Bestrahlung von Gliom-Stammzellen mit einer Standarddosisrate oder einer extra hohen Dosisrate im Vergleich zu nicht bestrahlten Kontrollzellen beobachtet. Um die richtige Dosis liefern zu lassen, ist es am wichtigsten, die Höhe der Medien im Kulturgericht zu messen, um sicherzustellen, dass sie einen Zentimeter erreicht. Nach diesem Verfahren können andere biologische Tests durchgeführt werden, wie Z. B. Immunfärbung, Western Blot und Zellzyklusanalyse.Da dieses Verfahren den Forschern klinisch relevante Dosis- und Dosisrateneinstellungen bietet, kann es verwendet werden, um die Strahlenwirkung auf vielen zellkulturbasierten Modellen zu bewerten.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Forschung

Medizin

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