Name: monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af forskningsmidler fra Institut for energi biologisk og miljømæssig forskning (DOE-BER 0000217519 til E.A.S.), National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 til E. A. S). SLH blev også støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship program. Vi takker Dr. Jeffery Dangl for at give bakterielle stammer og uvurderlig indsigt. Vi takker Dr. Andrew Klein og Matthew J. Powers for eksperimentelle forslag. Endelig vil SLH gerne takke forbindelserne på de sociale medier for at minde os om, at udbredelse af videnskab er et privilegium og et ansvar, især gennem kreative og tilgængelige midler.

Bemærk: den eksperimentelle opsætning er beskrevet for klarhed og bruges til at generere de repræsentative resultater, der er inkluderet i denne rapport, men betingelserne kan ændres som ønsket. Alle trin skal udføres ved hjælp af PV og efter institutionelle og føderale reccomendations for sikkerhed, i henhold til BSL status for de anvendte bakterier.
1. karakterisering af bakterier
<ol><li>Bestem morfologien af bakterier på vækstmedium agar pladen. Gensuspender cellerne med en omt...

<ol>
	<li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+disease:+a+threat+to+global+food+security.">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li><li>Cook, A. M., Grossenbacher, H., H&#252;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+microbes+with+biodegradative+potential.">Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential.</a> Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).</li><li>Vacheron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+and+root+system+functioning.">Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning.</a> Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).</li><li>Backer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Growth-Promoting+Rhizobacteria:+Context,+Mechanisms+of+Action,+and+Roadmap+to+Commercialization+of+Biostimulants+for+Sustainable+Agriculture.">Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture.</a> Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).</li><li>Zamioudis, C., Pieterse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+immunity+by+beneficial+microbes.">Modulation of host immunity by beneficial microbes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).</li><li>Kr&#246;ber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+strain+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+on+the+microbial+community+in+the+rhizosphere+of+lettuce+under+field+conditions+analyzed+by+whole+metagenome+sequencing.">Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Strategies+to+Separate+Root-Associated+Microbial+Communities:+A+Crucial+Choice+in+Rhizobiome+Research.">Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).</li><li>Woodward, A. W., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+in+Bloom:+A+Primer+on+the+Arabidopsis+thaliana+Model+System.">Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System.</a> Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).</li><li>Alatorre-Cobos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved,+low-cost,+hydroponic+system+for+growing+Arabidopsis+and+other+plant+species+under+aseptic+conditions.">An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions.</a> BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).</li><li>Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+with+rhizosphere+bacteria+can+confer+an+adaptive+advantage+to+plants.">Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants.</a> Nature Plants. 1 (6), (2015).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-AMP+Acts+as+an+Extracellular+Signal+That+Impacts.">Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts.</a> MBio. 9 (2), (2018).</li><li>Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+biofilm+induction+by+plant+polysaccharides.">Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Bacteria+to+Plant+Surfaces+Measured+in+the+Laboratory.">Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory.</a> Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> Journal of Visual Experiments. (60), (2012).</li><li>Cole, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+bacterial+plant+colonization+genes.">Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes.</a> PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirated+Siderophores+Promote+Sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).</li><li>Gange, A. C., Gadhave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+promote+plant+size+inequality.">Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality.</a> Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+bacterial+adaptation+to+plants.">Genomic features of bacterial adaptation to plants.</a> Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).</li><li>Mart&#237;nez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+root+microbiomes+for+healthier+crops+and+soils+using+beneficial,+environmentally+safe+bacteria.">Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria.</a> Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).</li><li>Niu, B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+Composition+Dynamics+of+a+Maize+Root-associated+Simplified+Bacterial+Community+and+Evaluation+of+Its+Biological+Control+Effect.">Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect.</a> Bio Protocol. 8 (12), (2018).</li></ol>

Planter i alle miljøer interagerer med tusinder til millioner af forskellige bakterier og svampe5,7. Disse interaktioner kan enten have en negativ og positiv indvirkning på plantesundheden med potentielle virkninger på afgrødeudbyttet og fødevareproduktionen. Det seneste arbejde antyder også, at variabel kolonisering af afgrøder fra PGPBs kan være en uforudsigelig plante størrelse og afgrødeudbytte i feltforsøg22. Forståelse me...

Afgrøde ødelæggelse af bakterielle og svampesygdomme resulterer i sænket fødevareproduktion og kan alvorligt forstyrre den globale stabilitet1. Baseret på opdagelsen af, at mikrober i suppressiv jord er ansvarlige for at øge plantesundheden2, har forskerne spurgt, om plante mikrobiomet kan udnyttes til at støtte plantevækst ved at ændre tilstedeværelsen og overflod af særlige bakteriearter3. Bakterier fundet at støtte i plantevækst eller udvikling er kollektivt betegnes plantevækst fremmende bakterier (PGPB). For nylig har undersøgelser skiftet fra blot at identificere potentielle PGPB til at forstå, hvordan interkingdom interaktioner i jorden, omkring rødder, eller i rhizosfæren (området direkte omgivende og herunder rodoverfladen) kan påvirke PGPB aktivitet4.
Rhizosphere kolonisering af PGPB kan øge sundheden eller udviklingen af værtsplanter som reaktion på forskellige stressorer i forhold til uncolonized planter5. Men, resultaterne er ofte mere variabel i indfødte jordforhold sammenlignet med dem, der er observeret i de nøje kontrollerede drivhus og laboratorie indstillinger6. En hypotese for denne forskel er, at vækst eller opførsel af pgpb kan hæmmes af indfødte jord bakterier eller svampe i markerne7,8. Gavnlige virkninger af rhizosfæren bakterier generelt afhænge af bakteriernes evne til 1) lokalisere og bevæge sig mod roden, 2) kolonisere roden gennem biofilm dannelse, og 3) interagere med værts planten eller patogener via produktion af små molekyle metabolitter7,9. Enhver af disse kolonisering adfærd kan blive påvirket af tilstedeværelsen og aktiviteten af tilstødende mikrober10.
Vi har designet et system til at kvantificere og visualisere disse særskilte bakterielle kolonisation stadier af rhizosfæren (figur 1). Denne fremgangsmåde vil gøre det lettere at undersøge, hvorfor langtids vedligeholdelse af PGPB undertiden ikke observeres efter overførsel af planter til nye miljøer, såsom ved plantning af præ-inokulerede planter. Arabidopsis thaliana som blev valgt som en plante model på grund af sin omfattende brug i laboratorieundersøgelser samt de rigelige data tilgængelige om dens mikrobielle interaktioner11. Der er tre stadier i systemet: 1) A. thaliana vækst, 2) bakteriel kolonisering, og 3) bakteriel vedligeholdelse (Se figur 1). Fordi a. thaliana er et jordbaseret anlæg, var det vigtigt at sikre, at det ikke var udsat for unødig vand stress i det hydroponiske system12. Inspireret af de metoder, der anvendes af Haney et al.13, dyrkes frøplanterne på plastik mesh for at adskille skuddet fra det flydende vækstmedium. Dette system synes ikke at kompromittere sundhed og udvikling af anlægget vært, og det forbedrer en. thaliana vækst i flydende11. Som planten skyde flyder over overfladen, rødderne er fuldt udsat for kolonisering af bakterier inokuleret i den flydende bakterielle vækstmedium. Dette tillader bakterier af interesse at blive undersøgt for kolonisering i næringsstoffer, der er mest befordrende for vækst, mens derefter skiftende betingelser for at gøre det muligt for planten at fortsætte med at vokse i et næringsstof medium designet til at støtte sin vækst. Begge stadier omfatter konstant rystning for at forhindre anoxia af roden13. Bakterier kan visualiseres eller kvantificeres fra plantens rødder efter overførsel fra enten koloniserings mediet eller vedligeholdelses mediet. Dette hydroponiske system er meget fleksibelt, hvilket tillader eksperimentelle betingelser og anvendte belastninger, der let kan ændres afhængigt af forskernes interesser.
Denne beskrevne metode er vigtig i forbindelse med den større mængde litteratur om plante mikrobe interaktioner, fordi den giver et robust system til at studere disse interaktioner på rodoverfladen, samtidig med at de kan tilpasses til vækst præferencerne for forskellige bakterier. Plant biologi Labs ofte udføre plante-Microbe kolonisering eksperimenter på solid agar, giver mulighed for kun planar bevægelse (hvis det) af bakterier, samtidig med at der kræves en potentielt destruktiv manipulation af planter under efterfølgende overførsel. I modsætning hertil har mikrobiologiske laboratorier ofte prioriteret sundhed bakterier i deres eksperimenter, til skade for planterne14,15. Disse forskellige prioriteringer af plante-og Mikrobiologi-fokuserede laboratorier har historisk gjort det vanskeligt at sammenligne resultater mellem disse grupper, da hver typisk optimerer eksperimentelle betingelser for at optimere deres organisme af interesse15. Den flydende-mesh-plante-vækst system, der er beskrevet her forhindrer fuld plante nedsænkning, en bemærkelsesværdig fordel til tidligere mikrobiologiske-orienterede undersøgelser, mens også midlertidigt at optimere vækst og overlevelse af bakterier til at lette kolonisering. Således kan den analyse, vi præsenterer her, behandle bekymringer fra både plante biologer (om over-hydrering og taktile manipulation af planten), mens opfylder kriterierne for mikrobiologer (giver mulighed for forskellige bakterielle vækstbetingelser og flere Arts interaktioner)7. Denne protokol er designet til at kunne tilpasses til brug med forskellige bakterier, planter og miljøforhold.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>1801343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeraseal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>BE255A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria of Interest</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stored at -80&#730;C in 40% glycerol preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoAgar</td>
			<td>BD</td>
			<td>2306428; REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 &#181;moles/m&#178;/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21&#730;C, with inner power outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator Jar: glass or heavy plastic</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flame</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>At optimal temperature for growth of specified bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetters</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Volumes 5 &#181;L to 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (preferably fluorescence)</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Could be light if best definition not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Salts + MES</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M70300-50.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Plate Shaker</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL total volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Hole Punch</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Approximately 7mm punch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>MMM1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Mesh</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1100t41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>x4281c</td>
			<td>other vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suggested Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Prong Ultrasonicator attachment</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sonicating multiple samples at once. Can be done individually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumaseal II</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>FE124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipetter/Repetter</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well plates</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Materials Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana seeds</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arthrobacter nicotinovorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curtobacterium oceanosedimentum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbacterium oleivorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas simiae WCS417r</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system

Bakterier danner komplekse rhizosfæren mikrobiomer formet ved at interagere mikrober, større organismer, og det abiotiske miljø. Under laboratorieforhold, rhizosfæren kolonisering af plantevækst fremmende bakterier (pgpb) kan øge sundheden eller udviklingen af værtsplanter i forhold til uncolonized planter. Men i Feltindstillinger, bakterie behandlinger med PGPB ofte ikke giver betydelige fordele for afgrøder. En forklaring er, at dette kan skyldes tab af PGPB under interaktioner med endogene jord mikrober i løbet af anlæggets levetid. Denne mulighed har været vanskeligt at bekræfte, da de fleste undersøgelser fokuserer på den oprindelige kolonisering snarere end vedligeholdelse af pgpb inden rhizosfæren samfund. Det er en hypotese her, at forsamlingen, sameksistens, og vedligeholdelse af bakterie samfund er formet af deterministiske funktioner i rhizosfæren mikromiljø, og at disse interaktioner kan påvirke pgpb overlevelse i native indstillinger. For at studere disse adfærd, en hydroponiske plante-vækst assay er optimeret ved hjælp af Arabidopsis thaliana at kvantificere og visualisere den rumlige fordeling af bakterier under indledende kolonisering af planterødder og efter overførsel til forskellige vækst Miljøer. Dette Systems reproducerbarhed og anvendelighed valideres derefter med den studerede pgpb Pseudomonas simiae prosimiae. At undersøge, hvordan tilstedeværelsen af flere bakterielle arter kan påvirke kolonisering og vedligeholdelse dynamik på planten roden, en model samfund fra tre bakterielle stammer (en Arthrobacter, Curtobacterium, og microbacterium arter) oprindeligt isoleret fra a. thaliana rhizosfæren er konstrueret. Det er påvist, at tilstedeværelsen af disse forskellige bakteriearter kan måles ved hjælp af denne hydroponiske plante-maintanence assay, som giver et alternativ til Sequencing-baserede bakterielle fællesskabsundersøgelser. Fremtidige undersøgelser ved hjælp af dette system kan forbedre forståelsen af bakteriel adfærd i multi arter plante mikrobiomer over tid og i skiftende miljømæssige forhold.

Den velkarakteriserede pgpb P. simiae prosimiae WCS417r er kendt for at kolonisere rødderne af A. thaliana i hydroponiske kultur. Denne naturligt fluorescerende bakterie kan nemt visualiseres ved hjælp af mikroskopi på rødderne af frøplanter efter kolonisering (figur 2). Selv om det er muligt at billede den fulde længde af disse A. thaliana frøplanter ' (4 – 6 mm længde) rødder, gør det for mange planter ville tage en pr...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Her beskriver vi en hydroponiske plantevækst assay til at kvantificere arter tilstedeværelse og visualisere den rumlige fordeling af bakterier under indledende kolonisering af planterødder og efter deres overførsel i forskellige vækst miljøer.

Overvågning bakteriel kolonisering og vedligeholdelse på Arabidopsis thaliana rødder i en flydende hydroponiske system

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

De fleste eksperimenter studere plante-mikrobe interaktioner ved at fokusere på kolonisering, men vores protokol er designet til at se både på kolonisering og vedligeholdelse af bakterier på roden. Vi kan ændre eksperimentet, så det passer til forskellige bakterier og planter, og vi kan endda teste flere bakterier i hver 24-brønds plade. Til at begynde, skal du bruge en standard hulning til at skabe diske af plast mesh.Opsaml diskene i en glasbeholder, og dæk dem løst. Steriliser ved hjælp af en autoklave indstillet til en 20-minutters tør cyklus. Brug flammesteriliserede pincet til at distribuere ca. 40 steriliserede netdiske i et enkelt lag på tværs af overfladen af tidligere forberedt plantevækstmedium agarplade.Placer to tidligere steriliserede frø i midten af hver maske. Seal pladen med kirurgisk tape, og inkubere i to til seks dage ved fire grader Celsius i mørke for at vernalisere frøene. Derefter placere pladen agar-side ned i en plante vækstkammer i otte til 10 dage under korte dage indstillinger af ni timers lys ved 21 grader Celsius og 15 timers mørke ved 18 grader Celsius at spire og vokse planter.Tilføj en milliliter bakterievækst medium til hver brønd af en steril 24-brønd plade. For at overføre de spirede planter indlejret i mesh, skal du bruge flamme-steriliserede kraftbetoner til forsigtigt at skrælle mesh, der indeholder to spirede, lige store, og ubeskadigede planter op og ud af agar pladen. Overfør en flyde med planter til hver brønd af bakterievækst væske, root-side ned.Dernæst resuspend bakterier dyrket natten over på agar plader i flydende bakteriel vækst medium. Tilføj 10 mikroliter af bakteriel suspension til hver brønd, bortset fra medie-only kontrol brønde, for en endelig koncentration af en million kolonidannende enheder af bakterier pr brønd. For at forsegle pladen for steril vækst skal du forsigtigt trykke på gaspermeable film hen over pladen uden at røre ved den klistrede side.Tryk omkring hver af ringene lavet af brøndene for at sikre, at hver brønd er blevet individuelt forseglet. Luk derefter pladen med sit plastiklåg lunt over den gaspermeable film. Placer pladen i en plante vækstkammer på en orbital plade shaker sat til 220 rpm, og inkubere i 18 timer under de samme betingelser som planter oprindeligt blev spiret.For at skylle alle flåd med planter, tilsæt en milliliter sterilt vand til hver brønd af en ny 24-brønd plade. Fjern gas-gennemtrængelig film fra pladen med planter, og bruge sterile kraftbefængte til at overføre flåd til brønde med vand, og inkubere i 10 minutter ved stuetemperatur uden omrøring. Derefter fylde hver brønd af en ny 24-brønd plade med en milliliter plantevækst medium.Overfør en maske til hver brønd, og dæk med en gas-gennemtrængelig forsegling. Inkubere i 72 timer på orbital plade shaker på 220 rpm i plantevækst kammer. Efter inkubationen skylles planterne som tidligere gjort.Efter skylningen fjernes planterne fra masken ved forsigtigt at placere flammesteriliserede snævner under bladene på maskens bladside. Let knibe stilken, og vrikke planter op og væk fra masken til at løsne roden uden at bryde den. For at fjerne bakterier fra planterødder, overføre planter fra hvert mesh i individuelle brønde af en 24-brønd sonikering plade, der indeholder en milliliter dobbelt-destilleret vand.Sonikere alle prøver i pladen på én gang ved hjælp af en flerstrenget soniker som beskrevet i manuskriptet. For at kvantificere bakterierne udføres serielle 10-foldte fortyndinger af de sonikerede prøver i bakterievækstmedium. Spred ved hjælp af sterile glasperler, og inkubere ved den optimale temperatur for bakterier, indtil de enkelte kolonier er tællelige.For at indsamle intakt planterod, skal du bruge krafterne til at fjerne planterne fra masken. Derefter overføre hver plante til et mikroskop dias ved at placere spidsen af roden på diaset og trække den væk fra spidsen for at indstille skyde ned flush med diaset, hvilket sikrer en rettet rod for bedste billeddannelse. Tilføj en dråbe vand eller steril plante vækstmedium til hver prøve til at fugte grænseflader mellem coverslips og dias.Placer et glas coverslip lige over roden kronen og under skyde blade for at undgå skrånende af coverslip, og tryk forsigtigt ned. Derefter billede bakterierne ved hjælp af passende excitation / emission filtre til at skelne bakterier fra hinanden og planten roden. Pseudomonas simiae, naturligt fluorescerende bakterie, koloniserede Arabidopsis thaliana rødder og blev opretholdt på roden efter overførsel til plantevækst medium.Root krone, mid-længde, og tip viser fluorescens på grund af kolonisering af Pseudomonas simiae. Den no-bakterier negativ kontrol viste ingen kolonisering. Når Pseudomonas simiae på Arabidopsis thaliana rødder blev kvantificeret efter 18 timers kolonisering eller 72 timers vedligeholdelse, samlede antal kolonidannende enheder pr kimplanter på begge tidspunkter viste god reproducerbarhed på tværs af biologiske replikater udført på forskellige dage.Der var en stigning i antallet af kolonidannende enheder pr. kimplante efter 72 timer i vedligeholdelsesmediet sammenlignet med de tal, der blev observeret på tiden efter koloniseringen, hvilket indikerer, at aktiv vækst af de koloniserede bakterier på planteroden fandt sted i vedligeholdelsesfasen. Tre arter af bakterier isoleret fra Arabidopsis thaliana dyrket i naturlig jord under laboratorieforhold blev brugt til at overvåge sammenslutningen af flere arter på planterødder. De var klart differentieret på medier, der indeholder X-gal på grund af forskelle i koloni morfologi og farve, som tillod tælle kolonidannende enheder pr sætteplante af hver art uden antibiotika udvælgelse, selv i multi-art coculture.Disse tre arter af bakterier blev alle koloniseret og vedligeholdt på roden, enten alene eller i bakteriel coculture. Hver art viste tendenser, der var ens på tværs af forskellige biologiske og tekniske replikater, hvilket viser, at denne protokol kan bruges til at måle både relative eller samlede kolonidannende enheder pr. rod af hver art. Når de dyrkes alene, ingen individuelle arter viste en betydelig stigning i overflod i løbet af vedligeholdelsesfasen, men den samlede koloni-dannende enheder pr roden af det kombinerede samfund steg i cocultures, hvilket indikerer, at disse bakterier ikke forbyder kolonisering af de andre stammer.De sværeste skridt er dem, der kræver fjernelse af intakte planter fra mesh diske. At være tålmodig og blid vil gøre dette muligt. Hvis bakteriecellerne lyser, kan prøverne sorteres efter flowcytometri for at bestemme det relative antal celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersøge effekterne af probiotika på Pneumokok Colonization Brug af en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adhærenceprøven

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Vurdering bakteriel invasion af hjerteceller i kultur og hjerte kolonisering i inficerede mus ved hjælp af Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bakteriel Leaf Infiltration Assay til Fin karakterisering af Plant Defense Responses ved hjælp af<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementering af en permeabel membran Insert-baserede infektion System at studere virkningerne af udskilt bakterielle toksiner på pattedyrværtsceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisning af Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisering i Murine vært ved Non-invasiv In Vivo bioluminescens System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høj overførselshastighed Shigella-specifikke bakteriedræbende Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Mønster-udløst oxidativ Burst og Seedling væksthæmning assays i Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Screening af kemiske forbindelser med høj gennemstrømning for at belyse deres virkninger på bakteriel persistens

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...