Name: monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Ces travaux ont été appuyés par des fonds de recherche fournis par le Département de la recherche biologique et environnementale de l'énergie (DOE-BER 0000217519 à E.A.S.), la National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 à E.A.S). SLH a également reçu l'appui du Programme de bourses d'études supérieures de la National Science Foundation. Nous remercions le Dr Jeffery Dangl d'avoir fourni des souches bactériennes et des renseignements inestimables. Nous remercions le Dr Andrew Klein et Matthew J. Powers pour leurs suggestions expérimentales. Enfin, SLH tient à remercier les réseaux sociaux de nous rappeler que la diffusion de la science est un privilège et une responsabilité, notamment par des moyens créatifs et accessibles.

REMARQUE : La configuration expérimentale est décrite pour plus de clarté et utilisée pour générer les résultats représentatifs inclus dans ce rapport, mais les conditions peuvent être modifiées comme vous le souhaitez. Toutes les étapes doivent être effectuées à l'aide de l'EPI et en suivant les reccomendations institutionnelles et fédérales pour la sécurité, selon le statut BSL des bactéries utilisées.
1. Caractérisation des bactéries
<ol><li>Déterminer la morphologi...

<ol>
	<li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+disease:+a+threat+to+global+food+security.">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li><li>Cook, A. M., Grossenbacher, H., H&#252;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+microbes+with+biodegradative+potential.">Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential.</a> Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).</li><li>Vacheron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+and+root+system+functioning.">Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning.</a> Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).</li><li>Backer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Growth-Promoting+Rhizobacteria:+Context,+Mechanisms+of+Action,+and+Roadmap+to+Commercialization+of+Biostimulants+for+Sustainable+Agriculture.">Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture.</a> Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).</li><li>Zamioudis, C., Pieterse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+immunity+by+beneficial+microbes.">Modulation of host immunity by beneficial microbes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).</li><li>Kr&#246;ber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+strain+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+on+the+microbial+community+in+the+rhizosphere+of+lettuce+under+field+conditions+analyzed+by+whole+metagenome+sequencing.">Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Niu, B., Paulson, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).</li><li>Woodward, A. W., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+in+Bloom:+A+Primer+on+the+Arabidopsis+thaliana+Model+System.">Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System.</a> Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).</li><li>Alatorre-Cobos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved,+low-cost,+hydroponic+system+for+growing+Arabidopsis+and+other+plant+species+under+aseptic+conditions.">An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions.</a> BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).</li><li>Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+with+rhizosphere+bacteria+can+confer+an+adaptive+advantage+to+plants.">Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants.</a> Nature Plants. 1 (6), (2015).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-AMP+Acts+as+an+Extracellular+Signal+That+Impacts.">Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts.</a> MBio. 9 (2), (2018).</li><li>Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+biofilm+induction+by+plant+polysaccharides.">Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Bacteria+to+Plant+Surfaces+Measured+in+the+Laboratory.">Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory.</a> Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> Journal of Visual Experiments. (60), (2012).</li><li>Cole, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+bacterial+plant+colonization+genes.">Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes.</a> PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirated+Siderophores+Promote+Sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).</li><li>Gange, A. C., Gadhave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+promote+plant+size+inequality.">Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality.</a> Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+bacterial+adaptation+to+plants.">Genomic features of bacterial adaptation to plants.</a> Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).</li><li>Mart&#237;nez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+root+microbiomes+for+healthier+crops+and+soils+using+beneficial,+environmentally+safe+bacteria.">Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria.</a> Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).</li><li>Niu, B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+Composition+Dynamics+of+a+Maize+Root-associated+Simplified+Bacterial+Community+and+Evaluation+of+Its+Biological+Control+Effect.">Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect.</a> Bio Protocol. 8 (12), (2018).</li></ol>

Les plantes dans tous les environnements interagissent avec des milliers à des millions de bactéries et de champignons différents5,7. Ces interactions peuvent avoir un impact négatif et positif sur la santé des plantes, avec des effets potentiels sur le rendement des cultures et la production alimentaire. Des travaux récents suggèrent également que la colonisation variable des cultures par les PGPB peut expliquer la taille imprévisible des plantes et le ...

La destruction des cultures par les maladies bactériennes et fongiques entraîne une baisse de la production alimentaire et peut gravement perturber la stabilité mondiale1. Sur la base de la découverte que les microbes dans les sols suppressifs sont responsables de l'augmentation de la santé des plantes2, les scientifiques ont demandé si le microbiome végétal peut être exploité pour soutenir la croissance des plantes en modifiant la présence et l'abondance de particulier espèces bactériennes3. Les bactéries qui aident à la croissance ou au développement des plantes sont collectivement appelées bactéries favorisant la croissance des plantes (PGPB). Plus récemment, des études sont passées de la simple identification du PGPB potentiel à la compréhension de la façon dont les interactions inter-royaumes dans le sol, autour des racines ou dans la rhizosphère (la zone qui entoure directement et y compris la surface racinaire) peuvent avoir un impact sur le PGPB. activité4.
La colonisation de la rhizosphère par pgPB peut augmenter la santé ou le développement des plantes hôtes en réponse à divers facteurs de stress par rapport aux plantes non colonisées5. Cependant, les résultats sont souvent plus variables dans les conditions du sol indigène par rapport à ceux observés dans les serres et laboratoires étroitement contrôlés6. Une hypothèse pour cette différence est que la croissance ou le comportement de PGPB peut être inhibé par les bactéries indigènes du sol ou des champignons dans les champs7,8. Les effets bénéfiques des bactéries de la rhizosphère dépendent généralement de la capacité des bactéries à localiser et à se déplacer vers la racine, 2) coloniser la racine par la formation de biofilms, et 3) interagir avec la plante hôte ou des agents pathogènes par la production de petites molécules métabolites7,9. N'importe lequel de ces comportements de colonisation peut être affecté par la présence et l'activité des microbes voisins10.
Nous avons conçu un système pour quantifier et visualiser ces stades distincts de colonisation bactérienne de la rhizosphère (Figure 1). Cette approche facilitera les études sur les raisons pour lesquelles l'entretien à long terme du PGPB n'est pas parfois observé après le transfert des plantes dans de nouveaux environnements, comme lors de la plantation de semis pré-inoculés. Arabidopsis thaliana comme ont été choisis comme un modèle végétal en raison de son utilisation intensive dans les études de laboratoire ainsi que les nombreuses données disponibles sur ses interactions microbiennes11. Il y a trois étapes dans le système : 1) a. thaliana croissance, 2) la colonisation bactérienne, et 3) l'entretien bactérien (voir la figure 1). Parce que A. thaliana est une plante terrestre, il était important de s'assurer qu'il ne souffrait pas de stress hydrique indu dans le système hydroponique12. Inspirés par les méthodes utilisées par Haney et coll.13, les semis sont cultivés sur des mailles en plastique pour séparer la pousse du milieu de croissance liquide. Ce système ne semble pas compromettre la santé et le développement de l'hôte de la plante, et il améliore la croissance de A. thaliana dans le liquide11. Lorsque la pousse de la plante flotte au-dessus de la surface, les racines sont pleinement exposées à la colonisation par des bactéries inoculées dans le milieu de croissance bactérienne liquide. Cela permet d'examiner les bactéries d'intérêt pour la colonisation des nutriments qui sont les plus propices à la croissance, tout en changeant les conditions pour permettre à la plante de continuer à croître dans un milieu nutritif conçu pour soutenir sa croissance. Les deux étapes comprennent des secousses régulières pour prévenir l'anoxie de la racine13. Les bactéries peuvent être visualisées ou quantifiées à partir des racines des plantes après le transfert du milieu de colonisation ou du milieu d'entretien. Ce système hydroponique est très flexible, permettant aux conditions expérimentales et aux contraintes appliquées d'être facilement modifiées en fonction des intérêts des chercheurs.
Cette méthode décrite est importante dans le contexte de l'ensemble de la littérature sur les interactions plantes-microbe, car elle fournit un système robuste pour étudier ces interactions à la surface des racines tout en étant personnalisable aux préférences de croissance de bactéries différentes. Les laboratoires de biologie végétale effectuent souvent des expériences de colonisation des microbes végétaux sur l'agar solide, ne permettant que le mouvement planaire (si cela) des bactéries tout en exigeant la manipulation potentiellement destructrice des plantes lors du transfert ultérieur. En revanche, les laboratoires de microbiologie ont souvent donné la priorité à la santé des bactéries dans leurs expériences, au détriment des plantes14,15. Ces différentes priorités des laboratoires axés sur les plantes et la microbiologie ont historiquement rendu difficile la comparaison des résultats entre ces groupes, puisque chacun optimise généralement les conditions expérimentales pour optimiser leur organisme d'intérêt15. Le système flottant-mesh-plant-croissance décrit ici empêche la submersion complète de plante, un avantage notable aux études microbiologiques précédentes, tout en optimisant temporairement la croissance et la survie des bactéries pour faciliter la colonisation. Ainsi, l'analyse que nous présentons ici peut répondre aux préoccupations des biologistes des plantes (sur la surhydratation et la manipulation tactile de la plante) tout en répondant aux critères des microbiologistes (permettant différentes conditions de croissance bactérienne et de multiples interactions des espèces)7. Ce protocole est conçu pour être adaptable pour une utilisation avec diverses bactéries, plantes et conditions environnementales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>1801343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeraseal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>BE255A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria of Interest</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stored at -80&#730;C in 40% glycerol preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoAgar</td>
			<td>BD</td>
			<td>2306428; REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 &#181;moles/m&#178;/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21&#730;C, with inner power outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator Jar: glass or heavy plastic</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flame</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>At optimal temperature for growth of specified bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetters</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Volumes 5 &#181;L to 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (preferably fluorescence)</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Could be light if best definition not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Salts + MES</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M70300-50.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Plate Shaker</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL total volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Hole Punch</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Approximately 7mm punch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>MMM1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Mesh</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1100t41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>x4281c</td>
			<td>other vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suggested Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Prong Ultrasonicator attachment</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sonicating multiple samples at once. Can be done individually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumaseal II</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>FE124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipetter/Repetter</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well plates</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Materials Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana seeds</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arthrobacter nicotinovorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curtobacterium oceanosedimentum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbacterium oleivorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas simiae WCS417r</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system

Les bactéries forment des microbiomes rhizosphèrecomplexes façonnés par des microbes en interaction, des organismes plus gros et l'environnement abiotique. Dans des conditions de laboratoire, la colonisation de la rhizosphère par des bactéries favorisant la croissance des plantes (PGPB) peut augmenter la santé ou le développement de plantes hôtes par rapport aux plantes non colonisées. Cependant, dans les milieux de terrain, les traitements bactériens avec PGPB souvent ne fournissent pas d'avantages substantiels aux cultures. Une explication est que cela peut être dû à la perte de la PGPB lors d'interactions avec les microbes du sol endogène au cours de la durée de vie de la plante. Cette possibilité a été difficile à confirmer, puisque la plupart des études se concentrent sur la colonisation initiale plutôt que sur le maintien du PGPB dans les communautés de rhizosphère. On suppose ici que l'assemblage, la coexistence et le maintien des communautés bactériennes sont façonnés par les caractéristiques déterministes du microenvironnement de la rhizosphère, et que ces interactions peuvent avoir un impact sur la survie du PGPB dans les milieux indigènes. Pour étudier ces comportements, un analyse hydroponique de croissance des plantes est optimisée en utilisant Arabidopsis thaliana pour quantifier et visualiser la distribution spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après le transfert vers une croissance différente Environnements. La reproductibilité et l'utilité de ce système sont ensuite validées avec le PGPB Pseudomonas simiaebien étudié. Étudier comment la présence de plusieurs espèces bactériennes peut affecter la dynamique de colonisation et d'entretien sur la racine de la plante, une communauté modèle de trois souches bactériennes (un Arthrobacter, Curtobacterium, et Microbacterium espèces) à l'origine isolée de la rhizosphère A. thaliana est construite. Il est démontré que la présence de ces diverses espèces bactériennes peut être mesurée à l'aide de cet analyse hydroponique de la mainntuence des plantes, qui offre une alternative aux études communautaires bactériennes basées sur le séquençage. De futures études utilisant ce système pourraient améliorer la compréhension du comportement bactérien dans les microbiomes végétaux multispécifiques au fil du temps et dans les conditions environnementales changeantes.

Le PGPB P. simiae WCS417r bien caractérisé est connu pour coloniser les racines de A. thaliana dans la culture hydroponique. Cette bactérie naturellement fluorescente peut facilement être visualisée à l'aide de microscopie sur les racines des semis après la colonisation (figure 2). Bien qu'il soit possible d'imaginer toute la longueur de ces racines de semis A. thaliana (4 à 6 mm de longueur), cela prendrait un temps prohibi...

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Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Ici, nous décrivons un analyse de croissance des plantes hydroponiques pour quantifier la présence des espèces et visualiser la répartition spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après leur transfert dans différents environnements de croissance.

Surveillance de la colonisation bactérienne et de l'entretien des racines d'Arabidopsis thaliana dans un système hydroponique flottant

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

La plupart des expériences étudient les interactions plantes-microbes en se concentrant sur la colonisation, mais notre protocole est conçu pour examiner à la fois la colonisation et le maintien des bactéries sur la racine. Nous pouvons changer l’expérience pour s’adapter à différentes bactéries et plantes, et nous pouvons même tester plusieurs bactéries dans chaque plaque de 24 puits. Pour commencer, utilisez un poinçonneur de trou standard pour créer des disques de maille en plastique.Recueillir les disques dans un récipient en verre, et couvrir lâchement. Stériliser à l’aide d’un jeu d’autoclave sur un cycle sec de 20 minutes. Utilisez des pinces à épiler stérilisées par flamme pour distribuer environ 40 disques en maille stérilisés en une seule couche à la surface de la plaque d’agar moyenne de croissance végétale préparée précédemment.Placer deux graines précédemment stérilisées au centre de chaque maille. Sceller l’assiette avec du ruban chirurgical, et incuber pendant deux à six jours à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pour vernaliser les graines. Ensuite, placez le côté agar de la plaque dans une chambre de croissance végétale pendant huit à dix jours sous des réglages de courte journée de neuf heures de lumière à 21 degrés Celsius et 15 heures d’obscurité à 18 degrés Celsius pour germer et faire pousser des semis.Ajouter un millilitre de milieu de croissance bactérienne à chaque puits d’une plaque stérile de 24 puits. Pour transférer les semis germés enchâssés dans le maillage, utilisez des forceps stérilisés par flamme pour peler délicatement le maillage contenant deux semis germés, de taille égale et intacts, de haut en large de la plaque d’agar. Transférer un flotteur avec des semis à chaque puits de liquide de croissance bactérienne, côté racine vers le bas.Ensuite, resuspendez les bactéries cultivées du jour au lendemain sur des plaques d’agar dans le milieu de croissance bactérienne liquide. Ajouter 10 microlitres de suspension bactérienne à chaque puits, à l’exception des puits de contrôle à base de médias seulement, pour une concentration finale d’un million d’unités de formation de colonies de bactéries par puits. Pour sceller la plaque pour une croissance stérile, pressez soigneusement le film perméable au gaz sur la plaque sans toucher le côté collant.Appliquez une pression autour de chacun des anneaux fabriqués par les puits pour vous assurer que chaque puits a été scellé individuellement. Ensuite, fermez la plaque avec son couvercle en plastique confortablement sur le film perméable au gaz. Placer la plaque dans une chambre de croissance végétale sur un shaker de plaque orbitale réglé à 220 rpm, et incuber pendant 18 heures dans les mêmes conditions que les semis ont été germés à l’origine.Pour rincer tous les flotteurs avec des plantes, ajouter un millilitre d’eau stérile à chaque puits d’une nouvelle plaque de 24 puits. Retirer le film perméable au gaz de la plaque avec les plantes, et utiliser des forceps stériles pour transférer les flotteurs vers les puits avec de l’eau, et incuber pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Ensuite, remplissez chaque puits d’une nouvelle plaque de 24 puits d’un millilitre de milieu de croissance végétale.Transférer un maillage à chaque puits et couvrir d’un joint perméable au gaz. Incuber pendant 72 heures sur le shaker orbital à 220 rpm dans la chambre de croissance des plantes. Après l’incubation, rincer les plantes comme auparavant.Après le rinçage, retirer les semis du maillage en plaçant doucement des forceps stérilisés par flamme sous les feuilles du côté des feuilles du maillage. Pincez légèrement la tige et agitez les semis de haut en loin du maillage pour déloger la racine sans la casser. Pour éliminer les bactéries des racines des plantes, transférez les semis de chaque maille dans les puits individuels d’une plaque de sonication de 24 puits contenant un millilitre d’eau double distillée.Sonicate tous les échantillons dans la plaque à la fois à l’aide d’un sonicateur à plusieurs volets tel que décrit dans le manuscrit. Pour quantifier les bactéries, effectuez des dilutions périodiques 10 fois des échantillons soniques dans le milieu de croissance bactérienne. Étendre à l’aide de perles de verre stériles et incuber à la température optimale pour les bactéries jusqu’à ce que les colonies individuelles soient dé countables.Pour recueillir les racines intactes des plantes, utilisez des forceps pour enlever les semis du maillage. Ensuite, transférez chaque plante sur une lame de microscope en plaçant la pointe de la racine sur la lame et en la faisant glisser loin de la pointe pour régler la chasse d’eau avec la lame, assurant ainsi une racine redressée pour une meilleure imagerie. Ajoutez une goutte d’eau ou un milieu stérile de croissance végétale à chaque échantillon pour hydrater les interfaces entre les couvertures et les toboggans.Placez un coverslip en verre juste au-dessus de la couronne de racine et sous les feuilles de pousse pour éviter l’inclinaison du coverslip, et appuyez doucement vers le bas. Ensuite, imagez les bactéries à l’aide de filtres d’excitation/émission appropriés pour différencier les bactéries les unes des autres et la racine des plantes. Pseudomonas simiae, bactérie naturellement fluorescente, a colonisé les racines d’Arabidopsis thaliana et a été maintenue sur la racine après transfert au milieu de croissance des plantes.La couronne de racine, la mi-longueur, et la pointe montrent la fluorescence due à la colonisation de Pseudomonas simiae. Le contrôle négatif sans bactéries n’a montré aucune colonisation. Lorsque pseudomonas simiae sur les racines arabidopsis thaliana ont été quantifiés après 18 heures de colonisation ou 72 heures d’entretien, le nombre total d’unités de formation de colonies par semis à chaque point de temps a montré une bonne reproductibilité à travers les répliques biologiques effectuées à différents jours.Il y a eu une augmentation du nombre d’unités formant des colonies par semis après 72 heures dans le milieu d’entretien, par rapport aux nombres observés au point de temps de 18 heures après la colonisation, ce qui indique que la croissance active des bactéries colonisées sur la racine de la plante s’est produite pendant l’étape d’entretien. Trois espèces de bactéries isolées d’Arabidopsis thaliana cultivées en sol naturel dans des conditions de laboratoire ont été utilisées pour surveiller l’association de plusieurs espèces sur les racines des plantes. Ils ont été clairement différenciés sur les supports contenant X-gal en raison de différences dans la morphologie et la couleur des colonies, ce qui a permis de compter les unités de formation de colonies par semis de chaque espèce sans sélection d’antibiotiques, même en coculture multi-espèces.Ces trois espèces de bactéries ont toutes été colonisées et maintenues sur la racine, que ce soit seule ou en coculture bactérienne. Chaque espèce a montré des tendances similaires selon différentes répliques biologiques et techniques, montrant que ce protocole peut être utilisé pour mesurer les unités relatives ou totales de formation de colonies par racine de chaque espèce. Lorsqu’elles sont cultivées seules, aucune espèce n’a montré d’augmentation substantielle de l’abondance au cours de l’étape d’entretien, mais l’ensemble des unités de formation de colonies par racine de la communauté combinée a augmenté dans les cocultures, ce qui indique que ces bactéries n’interdisent pas la colonisation des autres souches.Les étapes les plus difficiles sont celles qui nécessitent l’enlèvement de plantes intactes des disques en maille. Être patient et doux rendra cela possible. Si les cellules bactériennes sont fluorescentes, les échantillons pourraient être triés par cytométrie d’écoulement pour déterminer le nombre relatif de cellules.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Recherche

Immunologie et infection

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