Name: monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Forschungsmittel des Department of Energy Biological and Environmental Research (DOE-BER 0000217519 to E.A.S.), der National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 to E.A.S), unterstützt. SLH wurde auch vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program unterstützt. Wir danken Dr. Jeffery Dangl für die Bereitstellung von Bakterienstämmen und unschätzbareEinblicke. Wir danken Dr. Andrew Klein und Matthew J. Powers für experimentelle Vorschläge. Schließlich möchte sLH sich bei den Verbindungen in den sozialen Medien dafür bedanken, dass sie uns daran erinnert haben, dass die Verbreitung von Wissenschaft ein Privileg und eine Verantwortung ist, insbesondere durch kreative und zugängliche Mittel.

HINWEIS: Der Versuchsaufbau wird aus Gründen der Übersichtlichkeit beschrieben und verwendet, um die repräsentativen Ergebnisse in diesem Bericht zu generieren, aber die Bedingungen können nach Belieben geändert werden. Alle Schritte sollten mit PSA und folgenden institutionellen und föderalen Rückforderungen für die Sicherheit durchgeführt werden, entsprechend dem BSL-Status der verwendeten Bakterien.
1. Charakterisierung von Bakterien
<ol><li>Bestimmen Sie die Morphologie von Bakt...

<ol>
	<li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+disease:+a+threat+to+global+food+security.">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li><li>Cook, A. 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Pflanzen in allen Umgebungen interagieren mit Tausenden bis Millionen von verschiedenen Bakterien und Pilzen5,7. Diese Wechselwirkungen können sich entweder negativ und positiv auf die Pflanzengesundheit auswirken, mit möglichen Auswirkungen auf den Ernteertrag und die Nahrungsmittelproduktion. Jüngste Arbeiten deuten auch darauf hin, dass eine variable Besiedlung von Kulturen durch PGPBs für unvorhersehbare Pflanzengröße und Ernteerträge in Feldversuchen ...

Die Zerstörung von Pflanzen durch bakterielle und Pilzkrankheiten führt zu einer geringeren Nahrungsmittelproduktion und kann die globale Stabilität stark stören1. Basierend auf der Entdeckung, dass Mikroben in unterdrückenden Böden für die Erhöhung der Pflanzengesundheit verantwortlich sind2, haben Wissenschaftler gefragt, ob das Pflanzenmikrobiom genutzt werden kann, um das Pflanzenwachstum zu unterstützen, indem das Vorhandensein und die Fülle bestimmter Bakterienarten3. Bakterien, die beim Pflanzenwachstum oder bei der Entwicklung helfen, werden kollektiv als pflanzenwachstumsfördernde Bakterien (PGPB) bezeichnet. In jüngerer Zeit haben sich Studien von der einfachen Identifizierung potenzieller PGPB zu dem Verständnis verschoben, wie Interkingdom-Wechselwirkungen im Boden, um Wurzeln oder in der Rhizosphäre (das Gebiet, das direkt um die Wurzeloberfläche liegt) DIE PGPB beeinflussen können. Aktivität4.
Rhizosphäre Kolonisation durch PGPB kann die Gesundheit oder die Entwicklung von Wirtspflanzen als Reaktion auf verschiedene Stressoren im Vergleich zu unkolonisierten Pflanzenerhöhen 5. Allerdings sind die Ergebnisse bei einheimischen Bodenverhältnissen oft variabler als in den eng kontrollierten Gewächshäusern und Laborumgebungen6. Eine Hypothese für diesen Unterschied ist, dass das Wachstum oder Verhalten von PGPB durch einheimische Bodenbakterien oder Pilze in den Feldern7,8gehemmt werden kann. Günstige Effekte von RhizosphäreBakterien hängen in der Regel von der Fähigkeit der Bakterien ab, 1) zu lokalisieren und sich in Richtung der Wurzel zu bewegen, 2) die Wurzel durch Biofilmbildung zu besiedeln und 3) mit der Wirtspflanze oder Krankheitserregern über die Produktion kleiner Moleküle zu interagieren Metaboliten7,9. Jedes dieser Kolonisierungsverhalten kann durch das Vorhandensein und die Aktivität benachbarter Mikroben beeinflusst werden10.
Wir haben ein System entwickelt, um diese ausgeprägten bakteriellen Besiedlungsstadien der Rhizosphäre zu quantifizieren und zu visualisieren (Abbildung 1). Dieser Ansatz wird Studien erleichtern, die untersuchen, warum die langfristige PGPB-Wartung nach der Übertragung von Pflanzen in neue Umgebungen, wie z. B. bei der Anpflanzung von vorgeimpften Sämlingen, manchmal nicht beobachtet wird. Arabidopsis thaliana als Pflanzenmodell aufgrund seiner umfangreichen Verwendung in Laborstudien sowie der umfangreichen verfügbaren Daten über seine mikrobiellen Wechselwirkungen11. Es gibt drei Stufen im System: 1) A. thaliana Wachstum, 2) bakterielle Besiedlung und 3) bakterielle Erhaltung (siehe Abbildung 1). Da A. thaliana eine terrestrische Pflanze ist, war es wichtig sicherzustellen, dass sie nicht übermäßigen Wasserstress im hydroponischen System erlitt12. Inspiriert von den Methoden von Haney et al.13,werden die Sämlinge auf Kunststoffgitter numeriert, um den Trieb vom flüssigen Wachstumsmedium zu trennen. Dieses System scheint die Gesundheit und Entwicklung des Pflanzenwirts nicht zu beeinträchtigen, und es verbessert das A. thaliana Wachstum in flüssigen11. Während der Pflanzentrieb über der Oberfläche schwebt, werden die Wurzeln vollständig der Besiedlung durch Bakterien ausgesetzt, die in das flüssige bakterielle Wachstumsmedium eingeimpft werden. Dies ermöglicht es Bakterien von Interesse auf die Besiedlung in Nährstoffen untersucht werden, die am meisten förderlich für das Wachstum sind, während dann die Bedingungen verschieben, damit die Pflanze weiterhin in einem Nährstoffmedium wachsen, das entwickelt wurde, um sein Wachstum zu unterstützen. Beide Stadien beinhalten stetiges Schütteln, um Anoxie der Wurzel13zu verhindern. Bakterien können aus den Pflanzenwurzeln nach dem Transfer aus dem Besiedlungsmedium oder dem Pflegemedium visualisiert oder quantifiziert werden. Dieses hydroponische System ist sehr flexibel, so dass experimentelle Bedingungen und angewandte Spannungen je nach Interessen der Forscher leicht verändert werden können.
Diese beschriebene Methode ist im Kontext des größeren Literaturkörpers über Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen wichtig, da sie ein robustes System zur Untersuchung dieser Wechselwirkungen an der Wurzeloberfläche bietet und gleichzeitig an die Wachstumspräferenzen von verschiedenen Bakterien. Pflanzenbiologie-Labore führen oft Pflanzen-Mikroben-Kolonisationsexperimente an festen Agarn durch, sodass nur eine planare Bewegung (wenn dies) von Bakterien möglich ist, während gleichzeitig die potenziell destruktive Manipulation von Pflanzen während der späteren Übertragung erforderlich ist. Im Gegensatz dazu haben mikrobiologische Labore häufig die Gesundheit der Bakterien in ihren Experimenten priorisiert, zum Nachteil der Pflanzen14,15. Diese unterschiedlichen Prioritäten pflanzen- und mikrobiologischer Labore haben es in der Vergangenheit schwierig gemacht, die Ergebnisse zwischen diesen Gruppen zu vergleichen, da jede in der Regel experimentelle Bedingungen optimiert, um ihren Organismus von Interesse zu optimieren15. Das hier beschriebene Floating-Mesh-Pflanzen-Wachstumssystem verhindert das vollständige Eintauchen von Pflanzen, ein bemerkenswerter Vorteil früherer mikrobiologisch-orientierter Studien, während gleichzeitig das Wachstum und Überleben von Bakterien vorübergehend optimiert wird, um die Kolonisation zu erleichtern. So kann der Test, den wir hier vorstellen, Bedenken sowohl von Pflanzenbiologen (über Überfeuchtung und taktile Manipulation der Pflanze) als auch die Erfüllung der Kriterien von Mikrobiologen (die unterschiedliche bakterielle Wachstumsbedingungen und mehrere Wechselwirkungen der Arten)7. Dieses Protokoll ist so konzipiert, dass es für den Einsatz mit verschiedenen Bakterien, Pflanzen und Umweltbedingungen anpassungsfähig ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>1801343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeraseal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>BE255A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria of Interest</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stored at -80&#730;C in 40% glycerol preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoAgar</td>
			<td>BD</td>
			<td>2306428; REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 &#181;moles/m&#178;/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21&#730;C, with inner power outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator Jar: glass or heavy plastic</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flame</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>At optimal temperature for growth of specified bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetters</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Volumes 5 &#181;L to 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (preferably fluorescence)</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Could be light if best definition not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Salts + MES</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M70300-50.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Plate Shaker</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL total volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Hole Punch</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Approximately 7mm punch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>MMM1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Mesh</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1100t41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>x4281c</td>
			<td>other vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suggested Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Prong Ultrasonicator attachment</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sonicating multiple samples at once. Can be done individually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumaseal II</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>FE124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipetter/Repetter</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well plates</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Materials Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana seeds</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arthrobacter nicotinovorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curtobacterium oceanosedimentum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbacterium oleivorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas simiae WCS417r</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system

Bakterien bilden komplexe Rhizosphären-Mikrobiome, die durch interagierende Mikroben, größere Organismen und die abiotische Umgebung geformt werden. Unter Laborbedingungen kann die Besiedlung der Rhizosphäre durch pflanzenwachstumsfördernde Bakterien (PGPB) die Gesundheit oder die Entwicklung von Wirtspflanzen im Vergleich zu nicht kolonisierten Pflanzen erhöhen. In Feldumgebungen bieten bakterielle Behandlungen mit PGPB jedoch oft keine wesentlichen Vorteile für Die Kulturen. Eine Erklärung ist, dass dies auf den Verlust der PGPB während der Wechselwirkungen mit endogenen Bodenmikroben über die Lebensdauer der Pflanze zurückzuführen sein kann. Diese Möglichkeit war schwer zu bestätigen, da sich die meisten Studien auf die anfängliche Kolonisierung konzentrieren und nicht auf die Aufrechterhaltung von PGPB innerhalb von Rhizosphärengemeinschaften. Es wird hier vermutet, dass die Montage, Koexistenz und Aufrechterhaltung von Bakteriengemeinschaften durch deterministische Merkmale der Rhizosphäre Mikroumgebung geformt sind, und dass diese Wechselwirkungen das ÜBERLEBEN von PGPB in nativen Umgebungen beeinflussen können. Um diese Verhaltensweisen zu untersuchen, wird ein hydroponischer Pflanzenwachstumstest mit Arabidopsis thaliana optimiert, um die räumliche Verteilung von Bakterien während der anfänglichen Besiedlung von Pflanzenwurzeln und nach der Übertragung auf verschiedene Wachstumsergebnisse zu quantifizieren und zu visualisieren. Umgebungen. Die Reproduzierbarkeit und nützlichkeit dieses Systems werden dann mit dem gut untersuchten PGPB Pseudomonas simiaevalidiert. Um zu untersuchen, wie das Vorhandensein mehrerer Bakterienarten die Besiedlungs- und Erhaltungsdynamik auf der Pflanzenwurzel beeinflussen kann, eine Modellgemeinschaft aus drei Bakterienstämmen (ein Arthrobacter, Curtobacteriumund Microbacterium Ursprünglich aus der A. thaliana Rhizosphäre isoliert, ist konstruiert. Es wird gezeigt, dass das Vorhandensein dieser verschiedenen Bakterienarten mit diesem hydroponischen Pflanzen-Maintanence-Assay gemessen werden kann, der eine Alternative zu Sequenzierungsbasierten bakteriellen Gemeinschaftsstudien bietet. Zukünftige Studien mit diesem System können das Verständnis des bakteriellen Verhaltens in Mehrarten-Pflanzenmikrobiomen im Laufe der Zeit und in sich verändernden Umweltbedingungen verbessern.

Die gut charakterisierte PGPB P. simiae WCS417r ist dafür bekannt, die Wurzeln von A. thaliana in der hydroponischen Kultur zu besiedeln. Dieses natürlich fluoreszierende Bakterium kann leicht mit Hilfe der Mikroskopie an den Wurzeln von Sämlingen nach der Besiedlung visualisiert werden (Abbildung 2). Obwohl es möglich ist, die volle Länge der Wurzeln dieser A. thaliana Sämlinge (4-6 mm Länge) abzubilden, würde dies für vie...

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Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Hier beschreiben wir einen hydroponischen Pflanzenwachstumstest zur Quantifizierung des Artenvorkommens und zur Visualisierung der räumlichen Verteilung von Bakterien während der anfänglichen Besiedlung von Pflanzenwurzeln und nach deren Übertragung in verschiedene Wachstumsumgebungen.

Überwachung der bakteriellen Kolonisation und Erhaltung von Arabidopsis thaliana Roots in einem schwimmenden Hydroponischen System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Die meisten Experimente untersuchen Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen, indem sie sich auf die Kolonisation konzentrieren, aber unser Protokoll wurde entwickelt, um sowohl die Besiedlung als auch die Erhaltung der Bakterien an der Wurzel zu untersuchen. Wir können das Experiment an verschiedene Bakterien und Pflanzen anpassen, und wir können sogar mehrere Bakterien in jeder 24-Well-Platte testen. Verwenden Sie zunächst einen Standardlochstanzer, um Scheiben aus Kunststoffgewebe zu erstellen.Sammeln Sie die Scheiben in einem Glasbehälter, und decken Sie lose. Sterilisieren Sie mit einem Autoklaven, der auf einen 20-minütigen Trockenzyklus eingestellt ist. Verwenden Sie eine flammensterilisierte Pinzette, um etwa 40 sterilisierte Netzscheiben in einer einzigen Schicht über die Oberfläche der zuvor vorbereiteten Pflanzenwachstumsmedium-Agarplatte zu verteilen.Legen Sie zwei zuvor sterilisierte Samen in die Mitte jedes Netzes. Versiegeln Sie die Platte mit chirurgischem Klebeband und bebrüten Sie für zwei bis sechs Tage bei vier Grad Celsius in der Dunkelheit, um die Samen zu vernalisieren. Dann legen Sie die Platte Agar-Seite nach unten in einer Pflanzenwachstumskammer für acht bis zehn Tage unter kurztägigen Einstellungen von neun Stunden Licht bei 21 Grad Celsius und 15 Stunden Dunkelheit bei 18 Grad Celsius zu keimen und Zusaitlinge anzubauen.Fügen Sie einen Milliliter bakterielles Wachstumsmedium zu jedem Brunnen einer sterilen 24-Well-Platte hinzu. Um die in Mesh eingebetteten keimten Sämlinge zu übertragen, verwenden Sie flammensterilisierte Zangen, um das Netz mit zwei keimenden, gleich großen und unbeschädigten Sämlingen vorsichtig auf und von der Agarplatte zu schälen. Übertragen Sie einen Schwimmer mit Sämlingen auf jeden Brunnen der bakteriellen Wachstumsflüssigkeit, Wurzelseite nach unten.Als nächstes, resuspend Bakterien über Nacht auf Agar-Platten in flüssigen bakteriellen Wachstumsmedium gewachsen. Fügen Sie 10 Mikroliter bakterielle Suspension zu jedem Brunnen, mit Ausnahme von Medien-only Kontrollbrunnen, für eine endgültige Konzentration von einer Million koloniebildenden Einheiten von Bakterien pro Brunnen. Um die Platte für steriles Wachstum zu versiegeln, drücken Sie vorsichtig gasdurchlässige Folie über die Platte, ohne die klebrige Seite zu berühren.Setzen Sie druckauf jeden der Von den Brunnen hergestellten Ringe, um sicherzustellen, dass jeder Brunnen einzeln versiegelt wurde. Dann schließen Sie die Platte mit ihrem Kunststoffdeckel kuschelig über die gasdurchlässige Folie. Legen Sie die Platte in eine Pflanzenwachstumskammer auf einem Orbitalplatten-Shaker, der auf 220 U/min eingestellt ist, und brüten Sie 18 Stunden unter den gleichen Bedingungen, wie die Sämlinge ursprünglich gekeimt wurden.Um alle Schwimmer mit Pflanzen zu spülen, fügen Sie einen Milliliter steriles Wasser zu jedem Brunnen einer neuen 24-Well-Platte hinzu. Gasdurchlässige Folie mit Pflanzen von der Platte entfernen und mit sterilen Zangen Schwimmer in Brunnen mit Wasser übertragen und 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Rührung inkubieren. Dann füllen Sie jeden Brunnen einer neuen 24-Well-Platte mit einem Milliliter Pflanzenwachstumsmedium.Übertragen Sie ein Netz auf jeden Brunnen und decken Sie mit einer gasdurchlässigen Dichtung ab. 72 Stunden auf dem Orbitalplatten-Shaker bei 220 Umdrehungen pro Minute in der Pflanzenwachstumskammer inkubieren. Nach der Inkubation spülen Sie die Pflanzen wie bisher.Entfernen Sie nach dem Spülen die Sämlinge aus dem Netz, indem Sie die flammensterilisierten Zangen vorsichtig unter die Blätter auf der Blattseite des Netzes legen. Kneifen Sie den Stiel leicht und wackeln Sie die Sämlinge nach oben und weg aus dem Netz, um die Wurzel zu lösen, ohne sie zu brechen. Um Bakterien von Pflanzenwurzeln zu entfernen, übertragen Sie Sämlinge aus jedem Netz in einzelne Brunnen einer 24-Well-Beschallungsplatte, die einen Milliliter doppelt destilliertes Wasser enthält.Beschallen Sie alle Proben innerhalb der Platte auf einmal mit einem mehrgleisigen Beschallungsgerät, wie im Manuskript beschrieben. Um die Bakterien zu quantifizieren, führen Sie serielle 10-fache Verdünnungen der beschallten Proben in bakteriellem Wachstumsmedium durch. Mit sterilen Glasperlen verteilen und bei der optimalen Temperatur für Bakterien bebrüten, bis einzelne Kolonien zählbar sind.Um intakte Pflanzenwurzel zu sammeln, verwenden Sie Zangen, um die Sämlinge aus dem Netz zu entfernen. Übertragen Sie dann jede Pflanze auf ein Mikroskop-Dia, indem Sie die Spitze der Wurzel auf dem Dia platzieren und sie von der Spitze wegziehen, um den Abschuss bündig mit dem Dia zu setzen, um eine begradigte Wurzel für beste Bildgebung zu gewährleisten. Fügen Sie jeder Probe einen Tropfen Wasser oder ein steriles Pflanzenwachstumsmedium hinzu, um die Schnittstellen zwischen den Abdeckungen und Rutschen zu hydratisieren.Legen Sie einen Glasdeckel direkt über der Wurzelkrone und unter den Triebblättern, um eine Schräglage des Deckels zu vermeiden, und drücken Sie vorsichtig nach unten. Dann stellen Sie die Bakterien mit geeigneten Anregungs-/Emissionsfiltern ab, um Bakterien voneinander und der Pflanzenwurzel zu unterscheiden. Pseudomonas simiae, natürlich fluoreszierendes Bakterium, kolonisierte Arabidopsis thaliana Wurzeln und wurde auf der Wurzel nach dem Transfer auf Pflanzenwachstumsmedium beibehalten.Wurzelkrone, mittellange und Spitze zeigen Fluoreszenz durch Besiedlung von Pseudomonas simiae. Die no-bacteria negative Kontrolle zeigte keine Besiedlung. Wenn Pseudomonas simiae auf Arabidopsis thaliana Wurzeln nach 18 Stunden Kolonisation oder 72 Stunden Wartung quantifiziert wurden, zeigte die Gesamtzahl der koloniebildenden Einheiten pro Sämling zu einem oder anderen Zeitpunkt eine gute Reproduzierbarkeit über biologische Repliken hinweg, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden.Es gab einen Anstieg der Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Sämling nach 72 Stunden im Pflegemedium, im Vergleich zu den Zahlen, die am 18-Stunden-Zeitpunkt nach der Kolonisation beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass das aktive Wachstum der kolonisierten Bakterien auf der Pflanzenwurzel während der Erhaltungsphase auftrat. Drei Arten von Bakterien isoliert aus Arabidopsis thaliana in natürlichen Boden unter Laborbedingungen gewachsen wurden verwendet, um die Assoziation von mehreren Arten auf Pflanzenwurzeln zu überwachen. Sie wurden auf Medien, die X-gal enthalten, aufgrund von Unterschieden in der Koloniemorphologie und Farbe deutlich unterschieden, was es erlaubte, die koloniebildenden Einheiten pro Sämling jeder Art ohne Antibiotikaauswahl zu zählen, selbst in der Mehrartenkokultur.Diese drei Bakterienarten wurden alle besiedelt und an der Wurzel gehalten, ob allein oder in bakterieller Kokultur. Jede Art zeigte Trends, die in verschiedenen biologischen und technischen Replikationen ähnlich waren, was zeigt, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um sowohl relative als auch vollständige koloniebildende Einheiten pro Wurzel jeder Art zu messen. Wenn sie allein angebaut wurden, zeigte keine einzelne Art während der Erhaltungsphase einen erheblichen Anstieg des Überflusses, aber die gesamten koloniebildenden Einheiten pro Wurzel der kombinierten Gemeinschaft nahmen in Kokulturen zu, was darauf hindeutet, dass diese Bakterien die Besiedlung der anderen Stämme nicht verbieten.Die schwierigsten Schritte sind diejenigen, die das Entfernen intakter Pflanzen aus den Netzscheiben erfordern. Geduldig und sanft zu sein, wird dies möglich machen. Wenn die Bakterienzellen fluoreszierend sind, könnten die Proben nach Durchflusszytometrie sortiert werden, um die relative Anzahl der Zellen zu bestimmen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Einem orthotopen Modell des seröse Ovarialkarzinom in immunkompetenten Mäusen für In vivo Tumor Imaging und Überwachung der Tumor Immunantworten

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Überwachung der Montage einer sezernierte bakterielle Virulenz-Faktor mit Site-spezifische Vernetzung

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

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Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

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Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Hochdurchsatz-Screening chemischer Verbindungen zur Aufklärung ihrer Auswirkungen auf die bakterielle Persistenz

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...