Name: monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

यह काम ऊर्जा जैविक और पर्यावरण अनुसंधान विभाग (DOE-BER 0000217519 से ई.ए.एस.), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (ईएएस के लिए आईएसईआरआईईआरआईओएस-1343020) द्वारा प्रदान किए गए अनुसंधान निधियों द्वारा समर्थित किया गया था। SLH भी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था. हम जीवाणु उपभेदों और अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए डॉ जेफरी डांगल धन्यवाद। हम प्रयोगात्मक सुझावों के लिए डॉ एंड्रयू क्लेन और मैथ्यू जे शक्तियों धन्यवाद. अंत में, SLH हमें याद दिलाना है कि विज्ञान के प्रसार एक विशेषाधिकार और एक जिम्मेदारी है, विशेष रूप से रचनात्मक और सुलभ साधन के माध्यम से सामाजिक मीडिया पर कनेक्शन धन्यवाद करना चाहते हैं.

नोट: प्रयोगात्मक सेटअप स्पष्टता के लिए वर्णित है और इस रिपोर्ट में शामिल प्रतिनिधि परिणाम जनरेट करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन शर्तों वांछित के रूप में संशोधित किया जा सकता है। सभी कदम PPE का उपयोग...

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	<li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+disease:+a+threat+to+global+food+security.">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li><li>Cook, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+bacterial+plant+colonization+genes.">Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes.</a> PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. 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सभी वातावरण में पौधे हजारों लोगों के साथ विभिन्न बैक्टीरिया और कवक5,7 के साथ जुड़तेहैं. ये बातचीत या तो नकारात्मक और सकारात्मक फसल उपज और खाद्य उत्पादन पर संभावित प्रभाव के साथ, सं?...

जीवाणु और फंगल रोगों के कारण फसल नष्ट होने से खाद्य उत्पादन कम होता है और यह वैश्विक स्थिरता को बुरी तरह से बाधित कर सकताहै. खोज के आधार पर कि दमनकारी मिट्टी में रोगाणुओं संयंत्र स्वास्थ्य2बढ़ाने के लिए जिम्मेदार हैं , वैज्ञानिकों ने पूछा है कि क्या संयंत्र microbiome की उपस्थिति और विशेष की बहुतायत को संशोधित करके संयंत्र के विकास का समर्थन करने के लिए leveraged किया जा सकता है जीवाणु प्रजातियों3| पौधों के विकास या विकास में सहायता करने के लिए पाए जाने वाले बैक्टीरिया को सामूहिक रूप से पौधों के विकास को बढ़ावा देने वाले बैक्टीरिया (पीजीपीबी) कहा जाता है। हाल ही में, अध्ययन बस संभावित PGPB की पहचान करने से स्थानांतरित कर दिया है समझने के लिए कैसे मिट्टी में interkingdom बातचीत, जड़ों के आसपास, या rhizosphere में (क्षेत्र सीधे आसपास और जड़ की सतह सहित) PGPB प्रभावित हो सकता है गतिविधि4|
पीजीपीबी द्वारा राइजोस्फीज उपनिवेशन से बिना उपनिवेशित पौधों के सापेक्ष विभिन्न तनावों के जवाब में मेजबान पौधों के स्वास्थ्य या विकास में वृद्धि हो सकतीहै 5. तथापि, निकट नियंत्रित ग्रीनहाउस और प्रयोगशाला सेटिंग्स6में देखे गए परिणामों की तुलना में देशी मिट्टी की स्थितियों में परिणाम प्रायः अधिक परिवर्तनशील होते हैं। इस अंतर के लिए एक परिकल्पना यह है कि पीजीपीबी के विकास या व्यवहार को खेतों में देशी मिट्टी के बैक्टीरिया या कवक द्वारा बाधित किया जा सकता है7,8. rhizosphere बैक्टीरिया द्वारा लाभकारी प्रभाव आम तौर पर बैक्टीरिया की क्षमता पर निर्भर करने के लिए 1) का पता लगाने और जड़ की ओर ले जाने के लिए, 2) biofilm गठन के माध्यम से जड़ उपनिवेश, और 3) मेजबान संयंत्र या रोगजनकों के साथ बातचीत छोटे अणु के उत्पादन के माध्यम से चयापचय7,9. इनमें से कोई भी उपनिवेशन व्यवहार पड़ोसी सूक्ष्मजीवों की उपस्थिति और गतिविधि से प्रभावित हो सकताहै.
हमने राइज़ोस्फीयर के इन विशिष्ट जीवाणु उपनिवेशन चरणों की मात्रा निर्धारित करने और कल्पना करने के लिए एक प्रणाली तैयार की है (चित्र 1)। इस दृष्टिकोण से अध्ययन की सुविधा होगी कि क्यों लंबे समय तक पीजीपीबी रखरखाव कभी-कभी पौधों को नए वातावरण में स्थानांतरित करने के बाद नहीं देखा जाता है, जैसे कि पूर्व-संपीड़ित पौध रोपण के दौरान। प्रयोगशाला अध्ययनों में इसके व्यापक उपयोग के साथ -साथ इसके माइक्रोबियल इंटरैक्शन11के बारे में उपलब्ध पर्याप्त डेटा के कारण अरबिडोप्सिस थालियाना को संयंत्र मॉडल के रूप में चुना गया . प्रणाली में तीन चरण हैं: 1) ए थालियाना वृद्धि, 2) जीवाणु उपनिवेशन, और 3) जीवाणु रखरखाव (चित्र 1देखें)। क्योंकि ए thaliana एक स्थलीय संयंत्र है, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण था कि यह hydroponic प्रणाली12में अनुचित पानी के तनाव पीड़ित नहीं था. हैनी एट अल 13 द्वाराइस्तेमाल किया तरीकों से प्रेरित होकर, अंकुर तरल विकास माध्यम से गोली मार अलग करने के लिए प्लास्टिक जाल पर बड़े हो रहे हैं। इस प्रणाली के स्वास्थ्य और संयंत्र मेजबान के विकास से समझौता करने के लिए प्रकट नहीं होता है, और यह तरल11में ए thaliana विकास में सुधार. के रूप में संयंत्र गोली मार सतह के ऊपर तैरता है, जड़ों को पूरी तरह से तरल जीवाणु विकास माध्यम में inoculated बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेशन के संपर्क में हैं. यह ब्याज के बैक्टीरिया पोषक तत्वों है कि विकास के लिए सबसे अधिक अनुकूल हैं में उपनिवेशन के लिए जांच की अनुमति देता है, जबकि फिर शर्तों स्थानांतरण संयंत्र एक पोषक तत्व अपने विकास का समर्थन करने के लिए डिज़ाइन में बढ़ रही जारी रखने के लिए अनुमति देने के लिए. दोनों अवस्थाओं में जड़13के एनॉक्सिया को रोकने के लिए लगातार झटकों का समावेश है . बैक्टीरिया कल्पना या या तो उपनिवेशन माध्यम या रखरखाव माध्यम से हस्तांतरण के बाद संयंत्र की जड़ों से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस hydroponic प्रणाली बहुत लचीला है, प्रयोगात्मक स्थितियों की अनुमति और लागू तनाव आसानी से शोधकर्ताओं के हितों के आधार पर बदला जा करने के लिए.
यह वर्णित विधि संयंत्र microbe बातचीत के बारे में साहित्य के बड़े शरीर के संदर्भ में महत्वपूर्ण है क्योंकि यह जड़ की सतह पर इन बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत प्रणाली प्रदान करता है, जबकि भी की वृद्धि वरीयताओं के लिए अनुकूलन किया जा रहा विभिन्न बैक्टीरिया. संयंत्र जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं अक्सर ठोस agar पर संयंत्र microbe उपनिवेशन प्रयोगों प्रदर्शन, केवल planar आंदोलन के लिए अनुमति देता है (यदि है कि) बैक्टीरिया की, जबकि भी बाद में हस्तांतरण के दौरान पौधों की संभावित विनाशकारी हेरफेर की आवश्यकता होती है. इसके विपरीत, सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं ने अपने प्रयोगों के भीतर बैक्टीरिया केस्वास्थ्य को अक्सर प्राथमिकता दी है , पौधों की नुकसान14,15. संयंत्र और सूक्ष्म जीव विज्ञान केंद्रित प्रयोगशालाओं की इन विभिन्न प्राथमिकताओं ने ऐतिहासिक रूप से इन समूहोंके बीच परिणामों की तुलना करना कठिन बना दिया है, क्योंकि प्रत्येक आम तौर पर अपने जीव को ब्याज के 15 का अनुकूलन करने के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों का अनुकूलन करता है। यहाँ वर्णित फ्लोटिंग-मेश-प्लांट-ग्रोथ सिस्टम पूर्ण संयंत्र जलमग्न को रोकता है, जो पिछले माइक्रोबायोलॉजी उन्मुख अध्ययनों के लिए एक उल्लेखनीय लाभ है, जबकि उपनिवेशन की सुविधा के लिए बैक्टीरिया के विकास और अस्तित्व को अस्थायी रूप से अनुकूलित करता है। इस प्रकार, परख हम यहाँ मौजूद दोनों संयंत्र जीवविज्ञानियों से चिंताओं को संबोधित कर सकते हैं (के बारे में अधिक निर्जलीकरण और संयंत्र के स्पर्श हेरफेर) जबकि microbiologists के मानदंडों को संतुष्ट (विभिन्न जीवाणु विकास की स्थिति और कई के लिए अनुमति देता है प्रजाति' बातचीत)7| इस प्रोटोकॉल के लिए विभिन्न बैक्टीरिया, पौधों, और पर्यावरण की स्थिति के साथ उपयोग के लिए अनुकूलनीय बनाया गया है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>1801343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeraseal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>BE255A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria of Interest</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stored at -80&#730;C in 40% glycerol preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoAgar</td>
			<td>BD</td>
			<td>2306428; REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 &#181;moles/m&#178;/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21&#730;C, with inner power outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator Jar: glass or heavy plastic</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flame</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>At optimal temperature for growth of specified bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetters</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Volumes 5 &#181;L to 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (preferably fluorescence)</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Could be light if best definition not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Salts + MES</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M70300-50.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Plate Shaker</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL total volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Hole Punch</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Approximately 7mm punch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>MMM1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Mesh</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1100t41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>x4281c</td>
			<td>other vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suggested Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Prong Ultrasonicator attachment</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sonicating multiple samples at once. Can be done individually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumaseal II</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>FE124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipetter/Repetter</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well plates</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Materials Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana seeds</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arthrobacter nicotinovorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curtobacterium oceanosedimentum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbacterium oleivorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas simiae WCS417r</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system

जीवाणु रोगाणुओं, बड़े जीवों और अजैविक वातावरण के बीच बातचीत करके जटिल राइज़ोस्फीयर माइक्रोबायोम बनाते हैं। प्रयोगशाला शर्तों के तहत, पौधों के विकास को बढ़ावा देने वाले बैक्टीरिया (पीजीपीबी) द्वारा राइज़ोस्फीयर उपनिवेशन बिना उपनिवेशित पौधों के सापेक्ष स्वास्थ्य या मेजबान पौधों के विकास को बढ़ा सकता है। हालांकि, क्षेत्र सेटिंग्स में, PGPB के साथ जीवाणु उपचार अक्सर फसलों के लिए पर्याप्त लाभ प्रदान नहीं करते हैं। एक स्पष्टीकरण यह है कि यह पौधे की उम्र से अधिक अंतर्जात मिट्टी रोगाणुओं के साथ बातचीत के दौरान पीजीपीबी के नुकसान के कारण हो सकता है। इस संभावना की पुष्टि करने के लिए मुश्किल हो गया है, के बाद से ज्यादातर अध्ययन ों के बजाय rhizosphere समुदायों के भीतर PGPB के रखरखाव के प्रारंभिक उपनिवेशपर ध्यान केंद्रित. यह यहाँ hypothesized है कि विधानसभा, सह-अस्तित्व, और जीवाणु समुदायों के रखरखाव rhizosphere microenvironment के नियतात्मक सुविधाओं के आकार के हैं, और है कि इन बातचीत देशी सेटिंग्स में PGPB अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं. इन व्यवहारों का अध्ययन करने के लिए, एक हाइड्रोपोनिक संयंत्र-वृद्धि परख को पौधों की जड़ों के प्रारंभिक उपनिवेशन के दौरान बैक्टीरिया के स्थानिक वितरण की मात्रा निर्धारित करने और कल्पना करने के लिए Arabidopsis thaliana का उपयोग करके अनुकूलित किया जाता है और विभिन्न विकास के लिए स्थानांतरण के बाद वातावरण. इस प्रणाली की पुन: उत्पादनीयता और उपयोगिता तो अच्छी तरह से अध्ययन PGPB Peudomonas simiaeके साथ मान्य कर रहे हैं. जांच करने के लिए कैसे कई जीवाणु प्रजातियों की उपस्थिति संयंत्र की जड़ पर उपनिवेशन और रखरखाव गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं, तीन जीवाणु उपभेदों से एक मॉडल समुदाय (एक Arthrobacter, Curtobacterium, और माइक्रोबैक्टीरियम प्रजातियों) मूल रूप से ए thaliana rhizosphere से अलग का निर्माण किया है. यह दिखाया गया है कि इन विविध जीवाणु प्रजातियों की उपस्थिति इस hydroponic संयंत्र-maintanence परख, जो अनुक्रमण आधारित जीवाणु समुदाय के अध्ययन के लिए एक विकल्प प्रदान करता है का उपयोग कर मापा जा सकता है. इस प्रणाली का उपयोग कर भविष्य के अध्ययन समय के साथ और बदलते पर्यावरण की स्थिति में multispecies संयंत्र microbiomes में जीवाणु व्यवहार की समझ में सुधार हो सकता है.

अच्छी तरह से विशेषता PGPB पी simiae WCS417r हाइड्रोपोनिक संस्कृति में ए thaliana की जड़ों उपनिवेश के लिए जाना जाता है। यह स्वाभाविक रूप से फ्लोरोसेंट जीवाणु आसानी से उपनिवेशन के बाद अंकुर की जड़ों प?...

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Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

यहाँ हम प्रजातियों की उपस्थिति की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक hydroponic संयंत्र विकास परख का वर्णन और संयंत्र जड़ों के प्रारंभिक उपनिवेशन के दौरान बैक्टीरिया के स्थानिक वितरण कल्पना और विभिन्न विकास के वातावरण में उनके हस्तांतरण के बाद.

एक फ्लोटिंग हाइड्रोपोनिक सिस्टम में Arabidopsis thaliana जड़ें पर बैक्टीरियल उपनिवेशन और रखरखाव की निगरानी

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

अधिकांश प्रयोग उपनिवेशीकरण पर ध्यान केंद्रित करके पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन का अध्ययन करते हैं, लेकिन हमारा प्रोटोकॉल उपनिवेशीकरण और जड़ पर बैक्टीरिया के रखरखाव दोनों को देखने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हम विभिन्न बैक्टीरिया और पौधों को फिट करने के लिए प्रयोग बदल सकते हैं, और हम प्रत्येक 24-अच्छी प्लेट में कई बैक्टीरिया का परीक्षण भी कर सकते हैं। शुरू करने के लिए, प्लास्टिक जाल की डिस्क बनाने के लिए एक मानक छेद छिद्रक का उपयोग करें।एक ग्लास कंटेनर में डिस्क ले लीजिए, और शिथिल कवर। एक ऑटोक्लेव सेट का उपयोग करके 20 मिनट के शुष्क चक्र में बंध्याकरण करें। पहले से तैयार संयंत्र विकास मध्यम आगर प्लेट की सतह पर एक ही परत में लगभग 40 निष्फल जाल डिस्क वितरित करने के लिए लौ-निष्फल चिमटी का उपयोग करें।प्रत्येक जाल के केंद्र में दो पहले निष्फल बीज रखें। सर्जिकल टेप के साथ थाली सील, और अंधेरे में चार डिग्री सेल्सियस पर दो से छह दिनों के लिए बीज वसंत ी के लिए इनक्यूबेट । फिर, प्लेट एगर-साइड को आठ से 10 दिनों के लिए एक पौधे के विकास कक्ष में नीचे रखें, जो नौ घंटे के प्रकाश की कम दिन की सेटिंग्स के तहत 21 डिग्री सेल्सियस पर और 15 घंटे के अंधेरे को अंकुरित करने और अंकुरित करने के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।एक बाँझ 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में बैक्टीरियल विकास माध्यम का एक मिलीलीटर जोड़ें। जाल में एम्बेडेड अंकुरित रोपण को स्थानांतरित करने के लिए, लौ-निष्फल संदंश का उपयोग धीरे से दो अंकुरित, समान रूप से आकार, और अक्षतिग्रस्त रोपण वाले जाल को छीलने के लिए आगार प्लेट को ऊपर और बाहर करें। बैक्टीरियल ग्रोथ लिक्विड, रूट-साइड डाउन के प्रत्येक कुएं में रोपण के साथ एक फ्लोट स्थानांतरित करें।इसके बाद, तरल बैक्टीरियल विकास माध्यम में आगर प्लेटों पर रातोंरात उगाए जाने वाले बैक्टीरिया को फिर से ढिंढाएं। प्रत्येक कुएं में बैक्टीरियल सस्पेंशन के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें, मीडिया-केवल नियंत्रण कुओं को छोड़कर, प्रति अच्छी तरह से बैक्टीरिया की १,०,० कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की अंतिम एकाग्रता के लिए । बाँझ विकास के लिए थाली सील करने के लिए, ध्यान से चिपचिपा पक्ष को छूने के बिना थाली भर में गैस पारगम्य फिल्म प्रेस ।यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक कुएं को व्यक्तिगत रूप से सील कर दिया गया है, कुओं द्वारा बनाए गए प्रत्येक छल्ले के आसपास दबाव लागू करें। फिर, गैस पारगम्य फिल्म पर अपने प्लास्टिक के ढक्कन के साथ थाली बंद करो । प्लेट को एक कक्षीय प्लेट शेखर पर एक पौधे के विकास कक्ष में रखें जो 220 आरपीएम तक सेट होता है, और उसी परिस्थितियों में 18 घंटे तक इनक्यूबेट करता है क्योंकि रोपण मूल रूप से अंकुरित होते थे।पौधों के साथ सभी मंगाई कुल्ला करने के लिए, एक नई 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में बाँझ पानी की एक मिलीलीटर जोड़ें । पौधों के साथ थाली से गैस पार पार करने योग्य फिल्म निकालें, और पानी के साथ कुओं के लिए मंगाई हस्तांतरण के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें, और आंदोलन के बिना कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट । फिर, एक नई 24-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं को पौधे के विकास माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ भरें।प्रत्येक अच्छी तरह से एक जाल स्थानांतरित करें, और गैस-पारमीबल सील के साथ कवर करें। प्लांट ग्रोथ चैंबर में 220 आरपीएम पर ऑर्बिटल प्लेट शेकर पर 72 घंटे तक इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन के बाद, पौधों को पहले किया गया था।कुल्ला करने के बाद, जाल के पत्ते की ओर पत्तियों के नीचे लौ-निष्फल संदंश रखकर जाल से रोपण को हटा दें। हल्के से स्टेम चुटकी, और रोपण ऊपर और जाल से दूर wiggle इसे तोड़ने के बिना जड़ उखाड़ फेंकना । पौधों की जड़ों से बैक्टीरिया को हटाने के लिए, प्रत्येक जाल से रोपण को 24-अच्छी तरह से सोनिकेशन प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें जिसमें डबल-डिस्टिल्ड पानी का एक मिलीलीटर होता है।पांडुलिपि में वर्णित बहुआयामी सोनिकेटर का उपयोग करके एक बार में प्लेट के भीतर सभी नमूनों को सोनिकेट करें। बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए, बैक्टीरियल विकास माध्यम में सोनिकेटेड नमूनों के सीरियल 10 गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। बाँझ कांच के मोतियों का उपयोग करके फैलाएं, और बैक्टीरिया के लिए इष्टतम तापमान पर इनक्यूबेट करें जब तक कि व्यक्तिगत उपनिवेश गणनीय न हों।बरकरार पौधे की जड़ को इकट्ठा करने के लिए, जाल से रोपण को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। फिर, स्लाइड पर जड़ की नोक रखकर प्रत्येक पौधे को माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करें और स्लाइड के साथ फ्लश को सेट करने के लिए टिप से दूर खींचें, सबसे अच्छी इमेजिंग के लिए एक सीधा जड़ सुनिश्चित करें। कवरस्लिप और स्लाइड के बीच हाइड्रेट इंटरफेस के लिए प्रत्येक नमूने में पानी या बाँझ पौधे के विकास माध्यम की एक बूंद जोड़ें।कवरस्लिप के तिरछा होने से बचने के लिए रूट क्राउन के ठीक ऊपर और शूट पत्तियों के नीचे एक ग्लास कवरलिप रखें, और धीरे-धीरे दबाएं। फिर, एक दूसरे और पौधे की जड़ से बैक्टीरिया को अलग करने के लिए उचित उत्तेजन/उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करके बैक्टीरिया की छवि । स्यूडोमोनास सिमिया, स्वाभाविक रूप से फ्लोरोसेंट जीवाणु, उपनिवेश अरबीडोप्सिस थैलियाना जड़ें और पौधे के विकास माध्यम में हस्तांतरण के बाद जड़ पर बनाए रखा गया था।स्यूडोमोनास सिमिया के उपनिवेशीकरण के कारण रूट क्राउन, मध्य लंबाई और टिप फ्लोरेसेंस दिखाते हैं। नो-बैक्टीरिया निगेटिव कंट्रोल ने कोई उपनिवेशीकरण नहीं दिखाया । जब अरबीडोप्सिस थैलियाना जड़ों पर स्यूडोमोनास सिमिया को उपनिवेशीकरण के 18 घंटे या रखरखाव के 72 घंटों के बाद निर्धारित किया गया था, तो किसी भी समय बिंदु पर प्रति अंकुर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की कुल संख्या ने विभिन्न दिनों में किए गए जैविक प्रतिकृति में अच्छी प्रजनन क्षमता दिखाई।रखरखाव माध्यम में 72 घंटे के बाद प्रति अंकुर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की संख्या में वृद्धि हुई, जबकि उपनिवेशीकरण के बाद 18 घंटे के समय बिंदु पर देखी गई संख्याओं की तुलना में, यह दर्शाता है कि रखरखाव चरण के दौरान पौधे की जड़ पर उपनिवेश बैक्टीरिया का सक्रिय विकास हुआ। प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत प्राकृतिक मिट्टी में उगाए जाने वाले अरबीडोप्सिस थैलियाना से अलग बैक्टीरिया की तीन प्रजातियों का उपयोग पौधों की जड़ों पर कई प्रजातियों के सहयोग की निगरानी के लिए किया जाता था । वे स्पष्ट रूप से कॉलोनी आकृति विज्ञान और रंग में अंतर के कारण एक्स-गल युक्त मीडिया पर विभेदित थे, जिसने बहु-प्रजातियों के सहसंस्कृति में भी एंटीबायोटिक चयन के बिना प्रत्येक प्रजाति के अंकुर के प्रति कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गिनती करने की अनुमति दी।बैक्टीरिया की इन तीन प्रजातियों के सभी उपनिवेश और जड़ पर बनाए रखा गया था, चाहे अकेले या जीवाणु coculture में । प्रत्येक प्रजाति ने उन रुझानों को दिखाया जो विभिन्न जैविक और तकनीकी प्रतिकृति में समान थे, यह दिखाते हुए कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रत्येक प्रजाति की जड़ के अनुसार सापेक्ष या कुल कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों दोनों को मापने के लिए किया जा सकता है। जब अकेले उगाया जाता है, तो रखरखाव चरण के दौरान किसी भी व्यक्तिगत प्रजाति ने बहुतायत में पर्याप्त वृद्धि नहीं दिखाई, लेकिन संयुक्त समुदाय की जड़ के अनुसार समग्र कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां cocultures में बढ़ गईं, यह दर्शाता है कि ये बैक्टीरिया अन्य उपभेदों के उपनिवेशीकरण को प्रतिबंधित नहीं करते हैं।सबसे कठिन कदम वे हैं जिन्हें जाल डिस्क से बरकरार पौधों को हटाने की आवश्यकता होती है। धैर्यवान और कोमल होने से यह संभव हो जाएगा। यदि जीवाणु कोशिकाएं फ्लोरोसेंट हैं, तो नमूनों को कोशिकाओं की सापेक्ष संख्या निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा हल किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

असुरक्षित चूहे में एक तरल डिम्बग्रंथि के कैंसर के Orthotopic के लिए मॉडल Vivo में ट्यूमर और ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के इमेजिंग निगरानी

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

एक का प्रयोग न्यूमोकोकल औपनिवेशीकरण पर प्रोबायोटिक्स के प्रभाव की जांच<em&gt; इन विट्रो</em&gt; पालन परख

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन का उपयोग कर संक्रमित चूहों में संस्कृति और हृदय उपनिवेशीकरण में हृदय कोशिकाओं के जीवाणु आक्रमण का आकलन

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

का उपयोग संयंत्र रक्षा प्रतिक्रियाएँ ललित विशेषता के लिए बैक्टीरियल लीफ घुसपैठ परख<em&gt; Arabidopsis thaliana-स्यूडोमोनास syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

एक पारगम्य झिल्ली सम्मिलित आधारित संक्रमण प्रणाली के कार्यान्वयन के स्तनधारी मेजबान कोशिकाओं पर स्रावित बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Vivo Bioluminescence System में गैर-इनवेसिव द्वारा Murine होस्ट में Enterohemorrhagic ई कोलाई औपनिवेशीकरण का पता लगाना

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

एक उच्च थ्र्रपुट शिगेला-विशिष्ट जीवाणुनाशक परख

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

पैटर्न-ट्रिगर ऑक्सीडेटिव बर्स्ट और सीडिंग ग्रोथ निषेध परासास में Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

बैक्टीरियल हठ पर उनके प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए रासायनिक यौगिकों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...