Name: monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di ricerca forniti dal Dipartimento di Ricerca Biologica e Ambientale Dell'Energia (DOE-BER 0000217519 a E.A.S.), dalla National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 a E.A.S.). SLH è stata anche sostenuta dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. Ringraziamo il Dottor Jeffery Dangl per aver fornito ceppi batterici e informazioni preziose. Ringraziamo il Dottor Andrew Klein e Matthew J. Powers per i suggerimenti sperimentali. Infine, SLH desidera ringraziare le connessioni sui social media per ricordarci che diffondere la scienza è un privilegio e una responsabilità, soprattutto attraverso mezzi creativi e accessibili.

NOTA: la configurazione sperimentale viene descritta per chiarezza e utilizzata per generare i risultati rappresentativi inclusi in questo report, ma le condizioni possono essere modificate come desiderato. Tutte le misure devono essere eseguite utilizzando PPE e seguendo le ricattie istituzionali e federali per la sicurezza, secondo lo stato BSL dei batteri utilizzati.
1. Caratterizzazione dei batteri
<ol><li>Determinare la morfologia dei batteri sulla piastra di agar medio di crescita. Ris...

<ol>
	<li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+disease:+a+threat+to+global+food+security.">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li><li>Cook, A. M., Grossenbacher, H., H&#252;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+microbes+with+biodegradative+potential.">Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential.</a> Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).</li><li>Vacheron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+and+root+system+functioning.">Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning.</a> Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).</li><li>Backer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Growth-Promoting+Rhizobacteria:+Context,+Mechanisms+of+Action,+and+Roadmap+to+Commercialization+of+Biostimulants+for+Sustainable+Agriculture.">Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture.</a> Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).</li><li>Zamioudis, C., Pieterse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+immunity+by+beneficial+microbes.">Modulation of host immunity by beneficial microbes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).</li><li>Kr&#246;ber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+strain+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+on+the+microbial+community+in+the+rhizosphere+of+lettuce+under+field+conditions+analyzed+by+whole+metagenome+sequencing.">Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Niu, B., Paulson, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).</li><li>Woodward, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+with+rhizosphere+bacteria+can+confer+an+adaptive+advantage+to+plants.">Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants.</a> Nature Plants. 1 (6), (2015).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-AMP+Acts+as+an+Extracellular+Signal+That+Impacts.">Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts.</a> MBio. 9 (2), (2018).</li><li>Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+biofilm+induction+by+plant+polysaccharides.">Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Bacteria+to+Plant+Surfaces+Measured+in+the+Laboratory.">Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory.</a> Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> Journal of Visual Experiments. (60), (2012).</li><li>Cole, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+bacterial+plant+colonization+genes.">Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes.</a> PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirated+Siderophores+Promote+Sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).</li><li>Gange, A. C., Gadhave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+promote+plant+size+inequality.">Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality.</a> Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+bacterial+adaptation+to+plants.">Genomic features of bacterial adaptation to plants.</a> Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).</li><li>Mart&#237;nez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+root+microbiomes+for+healthier+crops+and+soils+using+beneficial,+environmentally+safe+bacteria.">Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria.</a> Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).</li><li>Niu, B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+Composition+Dynamics+of+a+Maize+Root-associated+Simplified+Bacterial+Community+and+Evaluation+of+Its+Biological+Control+Effect.">Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect.</a> Bio Protocol. 8 (12), (2018).</li></ol>

Le piante in tutti gli ambienti interagiscono con migliaia a milioni di diversi batteri e funghi5,7. Queste interazioni possono avere un impatto negativo e positivo sulla salute delle piante, con potenziali effetti sulla resa delle colture e sulla produzione alimentare. Lavori recenti suggeriscono anche che la colonizzazione variabile delle colture da parte dei PGPB può spiegare le dimensioni imprevedibili delle piante e la resa delle colture nelle prove sul cam...

La distruzione delle colture da malattie batteriche e fungine comporta una riduzione della produzione alimentare e può interrompere gravemente la stabilità globale1. Sulla base della scoperta che i microbi nei suoli soppressivi sono responsabili dell'aumento della salute delle piante2,gli scienziati hanno chiesto se il microbioma vegetale possa essere sfruttato per sostenere la crescita delle piante modificando la presenza e l'abbondanza di particolari specie batteriche3. I batteri trovati per aiutare nella crescita o nello sviluppo delle piante sono collettivamente rilegati ai batteri che promuovono la crescita delle piante (PGPB). Più recentemente, gli studi sono passati dalla semplice identificazione di potenziali PGPB alla comprensione di come le interazioni interkingdome nel suolo, intorno alle radici o nella rizosfera (l'area che circonda direttamente e comprende la superficie della radice) possono avere un impatto pgPB attività4.
La colonizzazione della rizosfera da parte del PGPB può aumentare la salute o lo sviluppo di piante ospiti in risposta a diversi fattori di stress rispetto alle piante non colonizzate5. Tuttavia, i risultati sono spesso più variabili nelle condizioni del suolo nativo rispetto a quelli osservati nelle impostazioni strettamente controllate della serra e del laboratorio6. Un'ipotesi per questa differenza è che la crescita o il comportamento di PGPB può essere inibito da batteri del suolo nativo o funghi nei campi7,8. Gli effetti benefici dei batteri di rizosfera dipendono generalmente dalla capacità dei batteri a 1) individuare e spostarsi verso la radice, 2) colonizzare la radice attraverso la formazione di biofilm e 3) interagire con la pianta o gli agenti patogeni ospiti attraverso la produzione di piccole molecole metaboliti7,9. Ognuno di questi comportamenti di colonizzazione può essere influenzato dalla presenza e dall'attività dei microbi vicini10.
Abbiamo progettato un sistema per quantificare e visualizzare queste distinte fasi di colonizzazione batterica della rizosfera (Figura 1). Questo approccio faciliterà gli studi sul motivo per cui la manutenzione PGPB a lungo termine non viene talvolta osservata dopo il trasferimento di piante in nuovi ambienti, ad esempio durante la semina di piantine pre-inocupate. Arabidopsis thaliana come sono stati scelti come un modello vegetale a causa del suo ampio uso in studi di laboratorio, nonché gli ampi dati disponibili sulle sue interazioni microbiche11. Ci sono tre fasi nel sistema: 1) A. thaliana crescita, 2) colonizzazione batterica, e 3) la manutenzione batterica (vedi Figura 1). Poiché A. thaliana è una pianta terrestre, era importante assicurarsi che non soffrisse indebitamente lo stress idrico nel sistema idroponico12. Ispirate ai metodi utilizzati da Haney et al.13, le piantine vengono coltivate su rete di plastica per separare il tiro dal mezzo di crescita liquido. Questo sistema non sembra compromettere la salute e lo sviluppo dell'ospite della pianta, e migliora la crescita di A. thaliana nel liquido11. Come il germoglio pianta galleggia sopra la superficie, le radici sono completamente esposti alla colonizzazione da batteri inoculati nel mezzo di crescita batterica liquida. Questo permette ai batteri di interesse di essere esaminati per la colonizzazione in sostanze nutritive che sono più favorevoli alla crescita, mentre poi spostando le condizioni per consentire alla pianta di continuare a crescere in un mezzo nutritivo progettato per sostenere la sua crescita. Entrambe le fasi includono agitazione costante per prevenire l'anossia della radice13. I batteri possono essere visualizzati o quantificati dalle radici delle piante dopo il trasferimento dal mezzo di colonizzazione o dal mezzo di manutenzione. Questo sistema idroponico è molto flessibile, consentendo di modificare facilmente le condizioni sperimentali e le sollecitazioni applicate a seconda degli interessi dei ricercatori.
Questo metodo descritto è importante nel contesto della più ampia letteratura sulle interazioni pianta-microbo perché fornisce un sistema robusto per studiare queste interazioni sulla superficie della radice, pur essendo personalizzabile alle preferenze di crescita di batteri diversi. I laboratori di biologia vegetale spesso eseguono esperimenti di colonizzazione pianta-microbo su agar solido, consentendo solo il movimento planare (se questo) di batteri, richiedendo anche la manipolazione potenzialmente distruttiva delle piante durante il successivo trasferimento. Al contrario, i laboratori di microbiologia hanno spesso dato priorità alla salute dei batteri all'interno dei loro esperimenti, a scapito delle piante14,15. Queste diverse priorità dei laboratori incentrati sulle piante e la microbiologia hanno storicamente reso storicamente difficile confrontare i risultati tra questi gruppi, poiché ognuno in genere ottimizza le condizioni sperimentali per ottimizzare il loro organismo di interesse15. Il sistema di crescita delle piante a maglie galleggianti descritto qui previene l'immersione totale delle piante, un notevole vantaggio per i precedenti studi orientati alla microbiologia, ottimizzando anche temporaneamente la crescita e la sopravvivenza dei batteri per facilitare la colonizzazione. Così, il test che presentiamo qui può affrontare le preoccupazioni sia dei biologi delle piante (circa l'eccessiva idratazione e la manipolazione tattile della pianta) soddisfacendo i criteri dei microbiologi (consentendo diverse condizioni di crescita batterica e molteplici interazioni delle specie)7. Questo protocollo è progettato per essere adattabile per l'uso con vari batteri, piante e condizioni ambientali.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>1801343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeraseal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>BE255A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria of Interest</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stored at -80&#730;C in 40% glycerol preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoAgar</td>
			<td>BD</td>
			<td>2306428; REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 &#181;moles/m&#178;/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21&#730;C, with inner power outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator Jar: glass or heavy plastic</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flame</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>At optimal temperature for growth of specified bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetters</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Volumes 5 &#181;L to 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (preferably fluorescence)</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Could be light if best definition not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Salts + MES</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M70300-50.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Plate Shaker</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL total volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Hole Punch</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Approximately 7mm punch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>MMM1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Mesh</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1100t41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>x4281c</td>
			<td>other vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suggested Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Prong Ultrasonicator attachment</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sonicating multiple samples at once. Can be done individually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumaseal II</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>FE124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipetter/Repetter</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well plates</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Materials Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana seeds</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arthrobacter nicotinovorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curtobacterium oceanosedimentum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbacterium oleivorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas simiae WCS417r</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system

I batteri formano microbiomi di rizosfera complessi modellati da microbi interagenti, organismi più grandi e l'ambiente abiotico. In condizioni di laboratorio, la colonizzazione della rizosfera da batteri che promuovono la crescita delle piante (PGPB) può aumentare la salute o lo sviluppo di piante ospiti rispetto alle piante non colonizzate. Tuttavia, nelle impostazioni di campo, i trattamenti batterici con PGPB spesso non forniscono benefici sostanziali alle colture. Una spiegazione è che questo può essere dovuto alla perdita del PGPB durante le interazioni con microbi del suolo endogeni durante la durata della vita della pianta. Questa possibilità è stata difficile da confermare, dal momento che la maggior parte degli studi si concentra noto sulla colonizzazione iniziale piuttosto che sul mantenimento del PGPB all'interno delle comunità di rizosfera. Si ipotizza qui che l'assemblaggio, la coesistenza e il mantenimento delle comunità batteriche siano modellati da caratteristiche deterministiche del microambiente di rizosfera, e che queste interazioni possano influenzare la sopravvivenza di PGPB in ambienti nativi. Per studiare questi comportamenti, un saggio idroponico della crescita vegetale è ottimizzato utilizzando l'Arabidopsis thaliana per quantificare e visualizzare la distribuzione spaziale dei batteri durante la colonizzazione iniziale delle radici delle piante e dopo il trasferimento a una crescita diversa Ambienti. La riproducibilità e l'utilità di questo sistema vengono quindi convalidate con la ben studiata PGPB Pseudomonas simiae. Per studiare come la presenza di più specie batteriche può influenzare la colonizzazione e la dinamica di manutenzione sulla radice della pianta, una comunità modello da tre ceppi batterici (un Arthrobacter, Curtobacterium, e Microbacterium specie) originariamente isolata dalla rizosfera A. thaliana. È dimostrato che la presenza di queste diverse specie batteriche può essere misurata utilizzando questo saggio idroponico di pianta-maintanence, che fornisce un'alternativa agli studi della comunità batterica basata sul sequenziamento. Studi futuri che utilizzano questo sistema possono migliorare la comprensione del comportamento batterico nei microbiomi vegetali multispecie nel tempo e nelle mutevoli condizioni ambientali.

Il ben caratterizzato PGPB P. simiae WCS417r è noto per colonizzare le radici di A. thaliana nella cultura idroponica. Questo batterio naturalmente fluorescente può essere facilmente visualizzato utilizzando la microscopia sulle radici delle piantine dopo la colonizzazione (Figura 2). Anche se è possibile immaginare l'intera lunghezza di queste radici di a. thaliana (lunghezza 4-6 mm), farlo per molte piante richiederebbe una qua...

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Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Qui descriviamo un test di crescita delle piante idroponica per quantificare la presenza delle specie e visualizzare la distribuzione spaziale dei batteri durante la colonizzazione iniziale delle radici delle piante e dopo il loro trasferimento in diversi ambienti di crescita.

Monitoraggio della colonizzazione e della manutenzione batterica sull'Arabidopsis thaliana Radici in un sistema idroponico galleggiante

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

La maggior parte degli esperimenti studia le interazioni pianta-microbo concentrandosi sulla colonizzazione, ma il nostro protocollo è progettato per esaminare sia la colonizzazione che il mantenimento dei batteri sulla radice. Possiamo cambiare l'esperimento per adattarlo a diversi batteri e piante, e possiamo anche testare più batteri in ogni piastra da 24 pozzi. Per iniziare, utilizzare un perforatore a foro standard per creare dischi di rete di plastica.Raccogliere i dischi in un contenitore di vetro e coprire liberamente. Sterilizzare utilizzando un'autoclave impostata su un ciclo secco di 20 minuti. Utilizzare pinzette sterilizzate a fiamma per distribuire circa 40 dischi di rete sterilizzati in un unico strato sulla superficie di una piastra di agar media di crescita delle piante precedentemente preparata.Posizionare due semi precedentemente sterilizzati al centro di ogni rete. Sigillare il piatto con nastro chirurgico e incubare per due o sei giorni a quattro gradi Celsius nell'oscurità per vernalizzare i semi. Quindi, posizionare il lato agar piastra verso il basso in una camera di crescita delle piante per otto-10 giorni in impostazioni di breve giornata di nove ore di luce a 21 gradi Celsius e 15 ore di buio a 18 gradi Celsius per germinare e coltivare piantine.Aggiungere un millilitro di mezzo di crescita batterica ad ogni pozzo di una piastra sterile da 24 pozzetto. Per trasferire le piantine germinate incorporate nella rete, utilizzare forcep sterilizzate a fiamma per sbucciare delicatamente la rete contenente due piantine germinate, di pari dimensioni e non danneggiate su e fuori dalla piastra di agar. Trasferire un galleggiante con piantine in ogni pozzo di liquido di crescita batterica, lato radice verso il basso.Successivamente, i batteri resuspend sono cresciuti durante la notte su piastre di agar in mezzo di crescita batterico liquido. Aggiungere 10 microlitri di sospensione batterica ad ogni pozzo, ad eccezione dei pozzi di controllo solo per mezzo, per una concentrazione finale di un milione di unità di batteri che formano colonie per pozzo. Per sigillare la piastra per una crescita sterile, premere con cura la pellicola permeabile al gas sulla piastra senza toccare il lato appiccicoso.Applicare la pressione intorno a ciascuno degli anelli realizzati dai pozzi per assicurarsi che ogni pozzo sia stato sigillato individualmente. Quindi, chiudere il piatto con il coperchio di plastica rannicchiato sul film permeabile al gas. Posizionare la piastra in una camera di crescita vegetale su uno shaker orbitale impostato su 220 giri/min e incubare per 18 ore nelle stesse condizioni in cui le piantine sono state originariamente germinate.Per risciacquare tutti i galleggianti con le piante, aggiungere un millilitro di acqua sterile ad ogni pozzo di un nuovo piatto da 24 pozzetti. Rimuovere il film permeabile al gas dalla piastra con le piante e utilizzare forcep sterili per trasferire galleggianti in pozzi con acqua e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Quindi, riempire ogni pozzo di una nuova piastra da 24 pozzetti con un millilitro di mezzo di crescita vegetale.Trasferire una rete in ogni pozzo e coprire con una guarnizione permeabile al gas. Incubare per 72 ore sullo shaker orbitale a 220 giri/min nella camera di crescita delle piante. Dopo l'incubazione, sciacquare le piante come fatto in precedenza.Dopo il risciacquo, rimuovere le piantine dalla rete posizionando delicatamente le forcelle sterilizzate a fiamma sotto le foglie sul lato fogliare della rete. Pizzicare leggermente il gambo e muovere le piantine su e lontano dalla rete per spostare la radice senza romperla. Per rimuovere i batteri dalle radici delle piante, trasferire piantine da ogni rete in singoli pozzi di una piastra di sonicazione a 24 pozzetti contenente un millilitro di acqua doppia distillata.Sonicare tutti i campioni all'interno della piastra contemporaneamente usando un sonicatore multipronged come descritto nel manoscritto. Per quantificare i batteri, eseguire diluizioni seriali 10 volte dei campioni sonicati nel mezzo di crescita batterico. Distribuire utilizzando perline di vetro sterili e incubare alla temperatura ottimale per i batteri fino a quando le singole colonie sono contabili.Per raccogliere la radice vegetale intatta, utilizzare le forcep per rimuovere le piantine dalla rete. Quindi, trasferire ogni pianta su uno scivolo al microscopio posizionando la punta della radice sulla diapositiva e trascinandolo lontano dalla punta per impostare lo scarico dell'abbattura con la diapositiva, garantendo una radice raddrizzare per la migliore immagine. Aggiungere una goccia d'acqua o un mezzo sterile di crescita delle piante a ciascun campione per idratare le interfacce tra i copriscivolo e le diapositive.Posizionare una coverlip di vetro appena sopra la corona della radice e sotto le foglie di germoglio per evitare l'inclinazione del coverslip e premere delicatamente verso il basso. Quindi, immagina i batteri usando filtri di eccitazione / emissione appropriati per differenziare i batteri l'uno dall'altro e dalla radice vegetale. Pseudomonas simiae, batterio naturalmente fluorescente, radici di arabidopsis thaliana colonizzate ed è stato mantenuto sulla radice dopo il trasferimento al mezzo di crescita delle piante.La corona della radice, la lunghezza media e la punta mostrano fluorescenza a causa della colonizzazione delle Pseudomonas simiae. Il controllo negativo senza batteri non mostrò colonizzazione. Quando pseudomonas simiae sulle radici di arabidopsis thaliana sono state quantificate dopo 18 ore di colonizzazione o 72 ore di manutenzione, il numero totale di unità di formazione della colonia per piantina in entrambi i momenti ha mostrato una buona riproducibilità attraverso repliche biologiche eseguite in giorni diversi.C'è stato un aumento del numero di unità di formazione della colonia per piantina dopo 72 ore nel mezzo di manutenzione, rispetto ai numeri osservati nel momento post-colonizzazione di 18 ore, indicando che la crescita attiva dei batteri colonizzati sulla radice della pianta si è verificata durante la fase di manutenzione. Tre specie di batteri isolati dalla thaliana arabidopsis coltivata in suolo naturale in condizioni di laboratorio sono state utilizzate per monitorare l'associazione di più specie sulle radici delle piante. Erano chiaramente differenziati su supporti contenenti X-gal a causa delle differenze nella morfologia e nel colore delle colonie, che permettevano di contare le unità di formazione della colonia per piantina di ogni specie senza selezione di antibiotici, anche nella cocultura multi-specie.Queste tre specie di batteri sono state tutte colonizzate e mantenute sulla radice, da sole o in cocoltura batterica. Ogni specie ha mostrato tendenze simili in diverse repliche biologiche e tecniche, dimostrando che questo protocollo può essere utilizzato per misurare unità di formazione di colonie sia relative che totali per radice di ogni specie. Se coltivate da sole, nessuna singola specie ha mostrato un aumento sostanziale dell'abbondanza durante la fase di manutenzione, ma le unità generali di formazione delle colonie per radice della comunità combinata sono aumentate in coculture, indicando che questi batteri non vietano la colonizzazione degli altri ceppi.I passaggi più difficili sono quelli che richiedono la rimozione di piante intatte dai dischi mesh. Essere pazienti e gentili lo renderà possibile. Se le cellule batteriche sono fluorescenti, i campioni potrebbero essere ordinati per citometria del flusso per determinare il numero relativo di cellule.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Ricerca

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