Name: monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

この研究は、エネルギー生物環境研究省(DOE-BER 0000217519 to E.A.S.)、国立科学財団(INSPIRE IOS-1343020 to E.A.S.)が提供する研究資金によって支援されました。SLHはまた、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによって支援されました。私たちは、細菌株と貴重な洞察力を提供するためにジェフリー・ダングル博士に感謝します。アンドリュー・クライン博士とマシュー・J・パワーズ博士に実験的な提案をいただいただいたことに感謝します。最後に、SLHは、特に創造的でアクセス可能な手段を通じて、科学を広めることが特権と責任であることを私たちに思い出させるためのソーシャルメディア上の接続に感謝したいと思います。

注: 実験セットアップはわかりやすく説明されており、このレポートに含まれる代表的な結果を生成するために使用されますが、条件は必要に応じて変更できます。使用される細菌のBSLステータスに従って、すべてのステップはPPEを使用し、安全のための機関および連邦の再調整に従って行われるべきである。
1. 細菌の特性
<ol><li>成長培地寒天プレート上の細菌の形態?...

<ol>
	<li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+disease:+a+threat+to+global+food+security.">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li><li>Cook, A. M., Grossenbacher, H., H&#252;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+microbes+with+biodegradative+potential.">Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential.</a> Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).</li><li>Vacheron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+and+root+system+functioning.">Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning.</a> Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).</li><li>Backer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Growth-Promoting+Rhizobacteria:+Context,+Mechanisms+of+Action,+and+Roadmap+to+Commercialization+of+Biostimulants+for+Sustainable+Agriculture.">Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture.</a> Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).</li><li>Zamioudis, C., Pieterse, C. 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N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Strategies+to+Separate+Root-Associated+Microbial+Communities:+A+Crucial+Choice+in+Rhizobiome+Research.">Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).</li><li>Woodward, A. W., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+in+Bloom:+A+Primer+on+the+Arabidopsis+thaliana+Model+System.">Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System.</a> Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).</li><li>Alatorre-Cobos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved,+low-cost,+hydroponic+system+for+growing+Arabidopsis+and+other+plant+species+under+aseptic+conditions.">An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions.</a> BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).</li><li>Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+with+rhizosphere+bacteria+can+confer+an+adaptive+advantage+to+plants.">Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants.</a> Nature Plants. 1 (6), (2015).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-AMP+Acts+as+an+Extracellular+Signal+That+Impacts.">Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts.</a> MBio. 9 (2), (2018).</li><li>Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+biofilm+induction+by+plant+polysaccharides.">Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Bacteria+to+Plant+Surfaces+Measured+in+the+Laboratory.">Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory.</a> Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> Journal of Visual Experiments. (60), (2012).</li><li>Cole, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+bacterial+plant+colonization+genes.">Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes.</a> PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirated+Siderophores+Promote+Sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).</li><li>Gange, A. C., Gadhave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+promote+plant+size+inequality.">Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality.</a> Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+bacterial+adaptation+to+plants.">Genomic features of bacterial adaptation to plants.</a> Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).</li><li>Mart&#237;nez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+root+microbiomes+for+healthier+crops+and+soils+using+beneficial,+environmentally+safe+bacteria.">Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria.</a> Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).</li><li>Niu, B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+Composition+Dynamics+of+a+Maize+Root-associated+Simplified+Bacterial+Community+and+Evaluation+of+Its+Biological+Control+Effect.">Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect.</a> Bio Protocol. 8 (12), (2018).</li></ol>

すべての環境の植物は、異なる細菌や真菌の数百万に数千人と相互作用5,7.これらの相互作用は、作物の収量と食糧生産に潜在的な影響を及ぼす植物の健康にマイナスと肯定的な影響を与えることができます。最近の研究はまた、PGPUによる作物の可変植民地化が、フィールドトライアル22における予測不可能な植物サイズと作物収?...

細菌や真菌性疾患による作物の破壊は、食糧生産の低下を引き起こし、世界的な安定性を著しく破壊する可能性があります1.抑制土壌中の微生物が植物の健康を増大させる原因であるという発見に基づいて、科学者は、植物の微生物叢が特定の存在と豊富さを修正することによって植物の成長をサポートするために利用することができるかどうか尋ねました。細菌種3.植物の成長または発達を助けるために見出された細菌は、総称して植物成長促進細菌(PGPB)と呼ばれています。最近では、潜在的なPGPBを特定するだけの研究から、土壌、根の周り、根間(根表面を含む直接周囲および根表面を含む領域)における王国間相互作用がPGPBにどのように影響しているかを理解することにシフトしています。アクティビティ4.
PGPBによる根圏の植民地化は、未植民地化された植物に対する多様なストレスに応じて宿主植物の健康または発達を増加させることができる5.しかし、結果は、多くの場合、密接に制御された温室および実験室の設定6で観察されるものと比較して、ネイティブ土壌条件でより可変である。この違いの1つの仮説は、PGPBの増殖または挙動が、フィールド7、8における天然土壌細菌または真菌によって阻害されうるということです。根間細菌による有益な効果は、一般に、1)根に向かって移動する細菌の能力に依存し、2)バイオフィルム形成を通じて根を植民地化し、3)小分子の産生を介して宿主植物または病原体と相互作用する。代謝産物7,9.これらの植民地化行動のいずれも、隣接する微生物10の存在および活性の影響を受ける可能性がある。
我々は、根圏のこれらの異なる細菌の植民地化段階を定量化し、視覚化するシステムを設計した(図1)。このアプローチは、接種前の苗の植え付け中など、植物を新しい環境に移した後に、長期的なPGPB維持が観察されない理由を調査する研究を容易にする。アラビドプシスタリアナは、実験室研究における広範な使用だけでなく、その微生物相互作用に関する利用可能な十分なデータ11のために植物モデルとして選ばれました。システムには3つの段階があります:1)A.タリアナ増殖、2)細菌の植民地化、および3)細菌の維持(図1参照)。A.タリアナは陸上植物であるため、水耕系12において過度の水ストレスに苦しんでいないことを確認することが重要であった。Haney et al.13によって使用される方法に触発され、苗は液体成長媒体から芽を分離するためにプラスチックメッシュ上で成長する。このシステムは、植物宿主の健康と発達を損なっているようには見えず、液体11におけるA.タリアナの成長を改善する。植物の芽が表面の上に浮かぶと、根は液体細菌増殖培地に接種された細菌によって植民地化に完全にさらされる。これにより、成長に最も役立つ栄養素の植民地化を調べ、その後、植物がその成長をサポートするように設計された栄養培地で成長し続けられるように条件をシフトすることができます。両方の段階は、根13の無酸素症を防ぐために安定した揺れを含む。細菌は、コロニー化媒体または維持培地のいずれかからの転移後に植物根から可視化または定量することができる。この水耕栽培システムは非常に柔軟であり、研究者の興味に応じて実験条件や適用応力を容易に変更することができます。
この説明された方法は、植物微生物の相互作用に関するより大きな文献の文脈において重要である。異なる細菌。植物生物学研究室は、多くの場合、固体寒天に植物微生物の植民地化実験を行い、細菌の平面移動(もしそうなら)のみを可能にする一方で、その後の移植中に植物の潜在的に破壊的な操作を必要とします。対照的に、微生物学研究室は、頻繁に彼らの実験内の細菌の健康を優先し、植物14、15の不利益に。植物および微生物に焦点を当てたラボのこれらの異なる優先順位は、これらのグループ間の結果を比較することが歴史的に困難になってきた, それぞれが通常、関心のある彼らの生物を最適化するために実験条件を最適化するので15.ここで説明するフローティングメッシュ植物成長システムは、これまでの微生物学指向の研究に顕著な利点である完全な植物の浸漬を防ぎ、同時に、コロニー化を容易にするために細菌の成長と生存を一時的に最適化する。したがって、ここで提示するアッセイは、微生物学者の基準を満たしながら、植物生物学者(植物の過剰水和と触覚操作に関する)の両方の懸念に対処する可能性があります(異なる細菌の増殖条件と複数を可能にする)。種の相互作用)7.このプロトコルは、様々な細菌、植物、および環境条件での使用に適応できるように設計されています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>1801343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeraseal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>BE255A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria of Interest</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stored at -80&#730;C in 40% glycerol preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoAgar</td>
			<td>BD</td>
			<td>2306428; REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 &#181;moles/m&#178;/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21&#730;C, with inner power outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator Jar: glass or heavy plastic</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flame</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>At optimal temperature for growth of specified bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetters</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Volumes 5 &#181;L to 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (preferably fluorescence)</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Could be light if best definition not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Salts + MES</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M70300-50.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Plate Shaker</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL total volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Hole Punch</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Approximately 7mm punch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>MMM1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Mesh</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1100t41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>x4281c</td>
			<td>other vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suggested Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Prong Ultrasonicator attachment</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sonicating multiple samples at once. Can be done individually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumaseal II</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>FE124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipetter/Repetter</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well plates</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Materials Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana seeds</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arthrobacter nicotinovorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curtobacterium oceanosedimentum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbacterium oleivorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas simiae WCS417r</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system

細菌は、微生物、より大きな生物、および生物学的環境との相互作用によって形成された複雑な根茎圏微生物叢を形成する。実験室条件下では、植物成長促進細菌(PGPB)による根圏コロニー化は、未植民地化された植物に対する宿主植物の健康または発達を増加させることができる。しかし、フィールド設定では、PGPBによる細菌治療は、多くの場合、作物に実質的な利益を提供しません。1つの説明は、これは植物の寿命にわたって内因性土壌微生物との相互作用中にPGPBの損失に起因する可能性があることです。ほとんどの研究は、根茎群科内のPGPBの維持よりも初期の植民地化に焦点を当てているので、この可能性を確認することは困難でした。ここでは、細菌群集の組み立て、共存、維持は根圏微小環境の決定的特徴によって形成され、これらの相互作用がネイティブ環境におけるPGPB生存に影響を与える可能性があると仮定されている。これらの行動を研究するために、水耕植物成長アッセイは、植物の根の初期植民地化中および異なる成長への転移後の細菌の空間分布を定量化し、視覚化するためにアラビドプシスタリアナを使用して最適化されています。環境。このシステムの再現性と有用性は、よく研究されたPGPBシュードモナス・シミアで検証されます。複数の細菌種の存在が植物根の植民地化と維持のダイナミクスにどのように影響するかを調べるために、3つの細菌株(Arthrobacter、Curtobacterium、およびマイクロバクテリウム)からのモデルコミュニティ種)はもともとA.タリアナ根圏から単離され構築される。これらの多様な細菌種の存在は、シーケンシングベースの細菌コミュニティ研究に代わるものとなるこの水耕植物主化アッセイを用いて測定できることが示されている。このシステムを用いた今後の研究は、多種植物微生物叢の細菌行動の理解を時間の経過と共に、環境条件の変化に改善する可能性がある。

よく特徴付けられたPGPB P.シミアエWCS417rは、水耕栽培におけるA.タリアナの根を植民地化することが知られている。この自然蛍光菌は、植民地化後の苗根の顕微鏡検査を用いて容易に可視化できる(図2)。これらのA.タリアナ苗の全長(4-6ミリメートルの長さ)の根を画像化することは可能ですが、多くの植物のためにそうするこ?...

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Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

ここでは、種の存在を定量化し、植物の根の初期植民地化時および異なる成長環境への移動後の細菌の空間分布を可視化するための水耕植物成長アッセイについて説明する。

浮遊水耕システムにおけるアラビドプシス・タリアナ根の細菌の植民地化と維持のモニタリング

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

ほとんどの実験は、植民地化に焦点を当てて植物微生物の相互作用を研究しますが、私たちのプロトコルは、根の細菌のコロニー形成と維持の両方を見るように設計されています。実験は異なる細菌や植物に合わせて変更することができ、各24ウェルプレートで複数の細菌をテストすることさえできます。まず、標準のパンチングを使用してプラスチックメッシュのディスクを作成します。ガラス容器にディスクを集め、ゆるく覆います。20分間のドライサイクルにセットしたオートクレーブを使用して滅菌します。炎滅菌されたピンセットを使用して、以前に調製した植物成長培地寒天プレートの表面全体に、1層に約40個の滅菌メッシュディスクを分配します。2つの以前に殺菌された種子を各メッシュの中心に置きます。外科用テープでプレートを密封し、暗闇の中で摂氏4度で2〜6日間インキュベートして種子を春にします。その後、プレート寒天側を植物成長室に8〜10日間置き、摂氏21度で9時間の光と18°Cの暗さの15時間を使用して苗を発芽させ、成長させます。滅菌24ウェルプレートの各ウェルに細菌増殖培地を1ミリリットル加えます。メッシュに埋め込まれた発芽した苗を転送するには、炎滅菌鉗子を使用して、2つの発芽した、等しいサイズ、損傷していない苗を含むメッシュを寒天プレートの上下に静かに剥がします。苗と一緒に1つのフロートを細菌増殖液の各ウェルに移し、根側を下にします。次に、液体細菌増殖培地中の寒天プレート上で一晩増殖した細菌を再懸濁させる。各井戸に10マイクロリットルの細菌懸濁液を加え、メディア専用の制御井戸を除き、井戸あたり100万個のコロニー形成細菌ユニットの最終濃度を得る。滅菌成長のためにプレートを密封するには、粘着面に触れることなく、慎重にプレート全体に気体透過性フィルムを押してください。各ウェルが個別に密封されていることを確認するために、ウェルによって作られたリングの周りに圧力を適用します。次に、プラスチック製の蓋をガス透過性フィルムの上にぴったりと閉じます。220rpmに設定された軌道プレートシェーカー上の植物成長室にプレートを置き、苗を発芽させたのと同じ条件で18時間インキュベートします。すべてのフロートを植物ですすいするには、新しい24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの無菌水を加えます。植物でプレートからガス透過性フィルムを取り除き、滅菌鉗子を使用して水でウェルにフロートを移し、攪拌することなく室温で10分間インキュベートします。次に、新しい24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの植物成長培地を充填します。各ウェルに1つのメッシュを転送し、ガス透過シールで覆います。植物成長チャンバーで220rpmで軌道プレートシェーカーで72時間インキュベート。インキュベーション後、前に行ったように植物をすすいでください。すすぐ後、メッシュの葉の下に炎で殺菌した鉗子をそっと置くことによって、メッシュから苗を取り除きます。茎を軽くつまみ、苗をメッシュから上下に動かし、根を壊さずに外します。植物の根から細菌を除去するには、各メッシュから苗を1ミリリットルの二重蒸留水を含む24ウェル超音波処理プレートの個々の井戸に移します。原稿に記載されているように多面的なソニケーターを使用して、一度にプレート内のすべてのサンプルを超音波処理します。細菌を定量化するには、細菌増殖培地中の超音波処理されたサンプルの連続10倍希釈を行う。滅菌ガラスビーズを使用して広がり、個々のコロニーが数えられるまで細菌の最適な温度でインキュベートする。無傷の植物の根を収集するには、フォースを使用してメッシュから苗を取り除きます。次に、各植物を顕微鏡スライドに移し、先端から引きずり出してスライドと一緒に撮影を下ろし、最良のイメージングのためにまっすぐな根を確保します。各サンプルに水または無菌植物成長培地を一滴加え、カバーリップとスライド間のインターフェースを水和します。カバースリップの傾斜を避けるために、ガラスカバースリップを根冠のすぐ上とシュートリーフの下に置き、穏やかに押し下げます。次に、適切な励起/放出フィルタを使用して細菌を画像化し、細菌同士と植物根とを区別します。シュードモナス・シミアエは、天然蛍光細菌、シロイヌナズナタリアナ根をコロニー化し、植物成長培地への移入後根上に維持した。根冠、中長、および先端はシュードモナスシミエのコロニー形成による蛍光を示す。無細菌陰性対照はコロニー形成を示さなかった。シロイナナナのシミアエを18時間の植民地化または72時間の維持後に定量化した場合、いずれの時点でも苗あたりのコロニー形成ユニットの総数は、異なる日に行われた生物学的複製全体にわたって良好な再現性を示した。維持培地中で72時間後に苗1当たりのコロニー形成単位の数が増加したところ、コロニー形成後18時間の時点で観察された数と比較して、植物根上のコロニー形成菌の活性成長が維持段階で起こったことを示す。実験室の条件下で自然土壌で成長したシロイヌナズナから分離された細菌の3種を使用して、植物の根に複数の種の関連を監視した。彼らはコロニーの形態と色の違いのためにX-galを含むメディア上で明確に区別され、多種の共同培養でも、抗生物質を選択せずに各種の苗ごとにコロニー形成単位を数えることを可能にした。これらの3種の細菌はすべてコロニー形成され、単独であれ細菌の共同培養であれ、根上で維持された。各種は、異なる生物学的および技術的複製にわたって類似した傾向を示し、このプロトコルは、各種の根元当たりの相対的または総コロニー形成ユニットの両方を測定するために使用できることを示した。単独で増殖した場合、個々の種は維持段階で豊富な量の大幅な増加を示さなかったが、結合されたコミュニティの根元当たりの全体的なコロニー形成単位は、共培養において増加し、これらの細菌が他の株のコロニー形成を禁止していないことを示している。最も困難なステップは、メッシュディスクから無傷の植物を除去する必要があるステップです。忍耐強く、穏やかであることは、これを可能にします。細菌細胞が蛍光性である場合、サンプルをフローサイトメトリーで選別して、細胞の相対数を決定することができます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

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のための免疫担当マウスにおける漿液性卵巣癌の同所性モデル in vivoで</em腫瘍免疫応答の>腫瘍イメージングとモニタリング

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

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使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ<em&gt;シロイヌナズナシュードモナスシリン</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

アラビドプシスタリアナにおけるパターン誘発酸化バーストと苗成長抑制アッセイ

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

細菌の持続性に及ぼす影響を解明するための化学化合物のハイスループットスクリーニング

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...