Name: monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler levert av Department of Energy biologiske og miljømessige forskning (DOE-BER 0000217519 til E.A.S.), National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 til E. A. S). SLH ble også støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. Vi takker Dr. Jeffery Dangl for å gi bakterielle stammer og uvurderlig innsikt. Vi takker Dr. Andrew Klein og Matthew J. Powers for eksperimentelle forslag. Til slutt, SLH ønsker å takke tilkoblinger på sosiale medier for påminner oss om at formidling av vitenskap er et privilegium og et ansvar, spesielt gjennom kreative og tilgjengelige midler.

Merk: det eksperimentelle oppsettet er beskrevet for klarhet og brukes til å generere representative resultater inkludert i denne rapporten, men forholdene kan endres etter ønske. Alle trinn bør utføres ved hjelp av PPE og følgende institusjonelle og føderale varmeste for sikkerhet, i henhold til BSL status for bakteriene som brukes.
1. karakterisering av bakterier
<ol><li>Bestem morfologi av bakterier på veksten medium agar plate. Resuspend celler på en omtrentlig OD600 =...

<ol>
	<li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+disease:+a+threat+to+global+food+security.">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li><li>Cook, A. M., Grossenbacher, H., H&#252;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+microbes+with+biodegradative+potential.">Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential.</a> Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).</li><li>Vacheron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+and+root+system+functioning.">Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning.</a> Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).</li><li>Backer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Growth-Promoting+Rhizobacteria:+Context,+Mechanisms+of+Action,+and+Roadmap+to+Commercialization+of+Biostimulants+for+Sustainable+Agriculture.">Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture.</a> Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).</li><li>Zamioudis, C., Pieterse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+immunity+by+beneficial+microbes.">Modulation of host immunity by beneficial microbes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).</li><li>Kr&#246;ber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+strain+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+on+the+microbial+community+in+the+rhizosphere+of+lettuce+under+field+conditions+analyzed+by+whole+metagenome+sequencing.">Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Strategies+to+Separate+Root-Associated+Microbial+Communities:+A+Crucial+Choice+in+Rhizobiome+Research.">Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).</li><li>Woodward, A. W., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+in+Bloom:+A+Primer+on+the+Arabidopsis+thaliana+Model+System.">Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System.</a> Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).</li><li>Alatorre-Cobos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved,+low-cost,+hydroponic+system+for+growing+Arabidopsis+and+other+plant+species+under+aseptic+conditions.">An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions.</a> BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).</li><li>Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+with+rhizosphere+bacteria+can+confer+an+adaptive+advantage+to+plants.">Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants.</a> Nature Plants. 1 (6), (2015).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-AMP+Acts+as+an+Extracellular+Signal+That+Impacts.">Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts.</a> MBio. 9 (2), (2018).</li><li>Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+biofilm+induction+by+plant+polysaccharides.">Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Bacteria+to+Plant+Surfaces+Measured+in+the+Laboratory.">Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory.</a> Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> Journal of Visual Experiments. (60), (2012).</li><li>Cole, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+bacterial+plant+colonization+genes.">Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes.</a> PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirated+Siderophores+Promote+Sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).</li><li>Gange, A. C., Gadhave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+promote+plant+size+inequality.">Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality.</a> Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+bacterial+adaptation+to+plants.">Genomic features of bacterial adaptation to plants.</a> Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).</li><li>Mart&#237;nez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+root+microbiomes+for+healthier+crops+and+soils+using+beneficial,+environmentally+safe+bacteria.">Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria.</a> Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).</li><li>Niu, B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+Composition+Dynamics+of+a+Maize+Root-associated+Simplified+Bacterial+Community+and+Evaluation+of+Its+Biological+Control+Effect.">Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect.</a> Bio Protocol. 8 (12), (2018).</li></ol>

Planter i alle miljøer samhandle med tusener til millioner av forskjellige bakterier og sopp5,7. Disse interaksjoner kan enten negativt og positivt påvirke plante helse, med potensielle effekter på avling yield og matproduksjon. Nyere arbeid tyder også på at variabel kolonisering av avlinger av PGPBs kan gjøre rede for uforutsigbare plante størrelse og beskjære yield i feltet prøvelser22. Forstå mekanismene bak disse interaksjone...

Crop ødeleggelse av bakterielle og Fungal sykdommer resulterer i senket matproduksjon og kan sterkt forstyrre global stabilitet1. Basert på oppdagelsen av at mikrober i undertrykkende jordsmonn er ansvarlig for å øke plante helse2, har forskere spurt om anlegget mikrobiomet kan utnyttes til å støtte plantevekst ved å endre tilstedeværelsen og overflod av spesielle bakteriearter3. Bakterier funnet å hjelpe i plantevekst eller utvikling er kollektivt betegnet plantevekst-fremme bakterier (PGPB). Flere nylig har studier forskjøvet fra bare identifisere potensielle PGPB å forstå hvordan interkingdom interaksjoner i jorda, rundt røtter, eller i rhizosphere (området direkte rundt og med roten overflaten) kan påvirke PGPB aktivitet4.
Rhizosphere kolonisering av PGPB kan øke helsen eller utviklingen av verts anlegg som svar på ulike stressfaktorer i forhold til uncolonized planter5. Men resultatene er ofte mer variabel i native jord forhold sammenlignet med de som er observert i de nøye kontrollerte drivhus og laboratorie innstillinger6. En hypotese for denne forskjellen er at veksten eller atferden til PGPB kan være hemmet av innfødte jord bakterier eller sopp i feltene7,8. Gunstige effekter av rhizosphere bakterier generelt avhenge av evnen til bakterier til 1) finne og bevege seg mot roten, 2) kolonisere roten gjennom biofilm formasjon, og 3) samhandle med verten plante eller patogener via produksjon av små molekyl metabolitter7,9. Noen av disse kolonisering atferd kan påvirkes av tilstedeværelsen og aktiviteten til nærliggende mikrober10.
Vi utviklet et system for å kvantifisere og visualisere disse distinkte bakteriell kolonisering stadier av rhizosphere (figur 1). Denne tilnærmingen vil lette studier undersøker hvorfor langsiktige PGPB vedlikehold er noen ganger ikke observert etter overføring av planter i nye miljøer, for eksempel under planting av pre-inokulert frøplanter. Arabidopsis thaliana AS ble valgt som en plante modell på grunn av sin omfattende bruk i laboratoriestudier, samt rikelig data tilgjengelig om sin mikrobielle interaksjoner11. Det er tre stadier i systemet: 1) A. thaliana vekst, 2) bakteriell kolonisering og 3) bakteriell vedlikehold (se figur 1). Fordi A. thaliana er en bakkenett plante, var det viktig å sikre at det ikke var lider unødig vann stress i hydroponic system12. Inspirert av metodene som brukes av Haney et al.13, er frøplanter dyrket på plast Mesh for å skille skyte fra væsken vekstmedium. Dette systemet ser ikke ut til å kompromittere helsen og utviklingen av anlegget vert, og det forbedrer A. thaliana vekst i flytende11. Som anlegget skyter flyter over overflaten, røttene er fullt eksponert for kolonisering av bakterier inokulert inn i væsken bakteriell vekstmedium. Dette tillater bakterier av interesse å bli undersøkt for kolonisering i næringsstoffer som er mest bidrar til vekst, samtidig som skiftende forhold slik at anlegget til å fortsette å vokse i et nærings medium utviklet for å støtte sin vekst. Begge stadier inkluderer jevn risting for å hindre Anoxia av roten13. Bakterier kan visualisere eller kvantifisert fra planterøttene etter overføring fra enten kolonisering medium eller vedlikehold medium. Dette hydroponic systemet er svært fleksibelt, slik at eksperimentelle forhold og anvendt påkjenninger for å være lett endres avhengig av interessene til forskerne.
Denne beskrevne metoden er viktig i sammenheng med den større kroppen av litteratur om plante-mikrobe interaksjoner fordi det gir et robust system for å studere disse interaksjoner på roten overflaten samtidig som tilpasses til vekst preferanser av forskjellige bakterier. Plant biologi laboratorier ofte utføre plante-mikrobe kolonisering eksperimenter på solid agar, slik at for bare Planar bevegelse (hvis det) av bakterier samtidig krever potensielt ødeleggende manipulering av planter under påfølgende overføring. I kontrast, mikrobiologi Labs har ofte prioritert helsen til bakteriene i sine eksperimenter, til skade for plantene14,15. Disse ulike prioriteringer av plante-og mikrobiologi-fokuserte laboratorier har historisk gjort det vanskelig å sammenligne resultatene mellom disse gruppene, siden hver typisk optimaliserer eksperimentelle forhold for å optimalisere sin organisme av interesse15. Den flytende-mesh-plante-vekst system beskrevet her hindrer full plante nedsenking, en betydelig fordel for tidligere mikrobiologi-orienterte studier, samtidig som midlertidig optimalisere vekst og overlevelse av bakterier for å lette kolonisering. Dermed analysen vi presenterer her kan adressen bekymringer fra både plante biologer (om over-hydration og taktil manipulasjon av anlegget), mens tilfredsstiller kriteriene for mikrobiologer (som tillater ulike bakterielle vekstforhold og flere Arts interaksjoner)7. Denne protokollen er utformet for å kunne tilpasses for bruk med ulike bakterier, planter og miljøforhold.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>1801343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeraseal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>BE255A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria of Interest</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stored at -80&#730;C in 40% glycerol preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoAgar</td>
			<td>BD</td>
			<td>2306428; REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 &#181;moles/m&#178;/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21&#730;C, with inner power outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator Jar: glass or heavy plastic</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flame</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>At optimal temperature for growth of specified bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetters</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Volumes 5 &#181;L to 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (preferably fluorescence)</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Could be light if best definition not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Salts + MES</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M70300-50.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Plate Shaker</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL total volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Hole Punch</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Approximately 7mm punch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>MMM1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Mesh</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1100t41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>x4281c</td>
			<td>other vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suggested Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Prong Ultrasonicator attachment</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sonicating multiple samples at once. Can be done individually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumaseal II</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>FE124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipetter/Repetter</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well plates</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Materials Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana seeds</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arthrobacter nicotinovorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curtobacterium oceanosedimentum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbacterium oleivorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas simiae WCS417r</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system

Bakterier danner komplekse rhizosphere microbiomes formet av samspill mikrober, større organismer, og abiotiske miljøet. Under laboratorieforhold, rhizosphere kolonisering av plantevekst-fremme bakterier (PGPB) kan øke helsen eller utviklingen av verts anlegg i forhold til uncolonized planter. Men i feltet innstillinger, bakteriell behandlinger med PGPB ofte ikke gir betydelige fordeler til avlinger. En forklaring er at dette kan skyldes tap av PGPB under interaksjoner med endogene Jord mikrober over levetiden til anlegget. Denne muligheten har vært vanskelig å bekrefte, siden de fleste studier fokus på den første kolonisering snarere enn vedlikehold av PGPB innen rhizosphere samfunn. Det er hypotetisk gjennomsnitt her at forsamlingen, sameksistens, og vedlikehold av bakterielle samfunn er formet av deterministisk funksjoner i rhizosphere mikromiljøet, og at disse interaksjoner kan påvirke PGPB overlevelse i native Settings. Å studere disse atferd, en hydroponic plante-vekst analysen er optimalisert ved hjelp Arabidopsis thaliana å kvantifisere og visualisere den romlige fordelingen av bakterier under første kolonisering av planterøtter og etter overføring til annen vekst Miljøer. Dette systemets reproduserbarhet og nytte blir deretter validert med godt studert PGPB Pseudomonas simiae. For å undersøke hvordan tilstedeværelsen av flere bakterielle arter kan påvirke kolonisering og vedlikehold dynamikk på anlegget roten, en modell samfunn fra tre bakterielle stammer (en Arthrobacter, Curtobacterium, og Microbacterium arter) som opprinnelig ble isolert fra A. thaliana rhizosphere er konstruert. Det er vist at tilstedeværelsen av disse ulike bakterielle arter kan måles ved hjelp av denne hydroponic plante-vedlikehold analysen, som gir et alternativ til sekvensering-baserte bakterielle samfunnet studier. Fremtidige studier ved hjelp av dette systemet kan forbedre forståelsen av bakteriell atferd i multispecies anlegget microbiomes over tid og i skiftende miljøforhold.

Den godt preget PGPB P. simiae WCS417r er kjent for å kolonisere røttene av A. thaliana i hydroponic kultur. Dette naturlig fluorescerende bakterien kan lett bli visualisere ved hjelp av mikroskopi på røttene av frøplanter etter kolonisering (figur 2). Selv om det er mulig å avbilde hele lengden av disse A. thaliana frøplanter ' (4-6 mm lengde) røtter, gjør det for mange planter ville ta en uoverkommelige tid. Fordi de fles...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Her beskriver vi en hydroponic plantevekst analysen å kvantifisere arter tilstedeværelse og visualisere den romlige fordelingen av bakterier under første kolonisering av planterøtter og etter deres overføring til ulike vekst miljøer.

Overvåking bakteriell kolonisering og vedlikehold på Arabidopsis thaliana røtter i en flytende hydroponic system

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

De fleste eksperimenter studerer plante-mikrobe interaksjoner ved å fokusere på kolonisering, men vår protokoll er utformet for å se både på kolonisering og vedlikehold av bakteriene på roten. Vi kan endre eksperimentet slik at det passer til forskjellige bakterier og planter, og vi kan til og med teste flere bakterier i hver 24-brønnsplate. For å begynne, bruk en standard hullpuncher til å lage disker av plastnett.Samle diskene i en glassbeholder, og dekk løst. Steriliser ved hjelp av en autoklav satt til en 20-minutters tørr syklus. Bruk flammesteriliserte pinsett til å fordele ca. 40 steriliserte nettingskivene i ett enkelt lag over overflaten av tidligere forberedt plantevekst medium agar plate.Plasser to tidligere steriliserte frø i midten av hvert nett. Forsegle platen med kirurgisk tape, og inkuber i to til seks dager ved fire grader Celsius i mørket for å vernalisere frøene. Deretter plasserer platen agar-side ned i et plantevekstkammer i åtte til 10 dager under kortdagsinnstillinger på ni timers lys ved 21 grader Celsius og 15 timer med mørkt ved 18 grader Celsius for å spire og vokse frøplanter.Tilsett en milliliter bakteriell vekst medium til hver brønn av en steril 24-brønns plate. For å overføre de spirede plantene som er innebygd i mesh, bruk flammesteriliserte tang til å forsiktig skrelle nettet som inneholder to spirede, like store og uskadede frøplanter opp og av agarplaten. Overfør en flyte med frøplanter til hver brønn av bakteriell vekst væske, rot-side ned.Deretter gjenbruker bakterier dyrket over natten på agarplater i flytende bakteriell vekst medium. Tilsett 10 mikroliter bakteriell suspensjon til hver brønn, med unntak av bare kontrollbrønner kun for medier, for en endelig konsentrasjon av en million kolonidannende enheter av bakterier per brønn. For å forsegle platen for steril vekst, trykk forsiktig gassgjennomtrengelig film over platen uten å berøre den klebrige siden.Påfør trykk rundt hver av ringene laget av brønnene for å sikre at hver brønn er individuelt forseglet. Lukk deretter platen med plastlokket tett over den gassgjennomtrengelige filmen. Plasser platen i et plantevekstkammer på en orbital plateshaker satt til 220 rpm, og inkuber i 18 timer under samme forhold som plantene opprinnelig ble spiret.For å skylle alle flyter med planter, tilsett en milliliter sterilt vann til hver brønn av en ny 24-brønnsplate. Fjern gassgjennomtrengelig film fra platen med planter, og bruk sterile tang til å overføre flyter til brønner med vann, og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur uten agitasjon. Deretter fyller du hver brønn av en ny 24-brønns plate med en milliliter plantevekstmedium.Overfør ett nett til hver brønn, og dekk med en gassgjennomtrengelig forsegling. Inkuber i 72 timer på orbital plate shaker på 220 rpm i plantevekst kammer. Etter inkubasjonen, skyll plantene som tidligere gjort.Etter skyllingen fjerner du plantene fra nettet ved å forsiktig plassere flammesteriliserte tang under bladene på bladsiden av nettet. Klyp stammen lett, og vrikke plantene opp og bort fra nettet for å løsne roten uten å bryte den. For å fjerne bakterier fra planterøtter, overfør frøplanter fra hvert nett til individuelle brønner på en 24-brønns sonikeringsplate som inneholder en milliliter dobbeltdestillert vann.Sonicate alle prøver i platen på en gang ved hjelp av en multipronged sonicator som beskrevet i manuskriptet. For å kvantifisere bakteriene, utfør serielle 10-ganger fortynninger av de sonikerte prøvene i bakteriell vekstmedium. Spred ved hjelp av sterile glassperler, og inkuber ved optimal temperatur for bakterier til individuelle kolonier er tellbare.For å samle intakt planterot, bruk tang for å fjerne plantene fra nettet. Deretter overfører du hver plante til et mikroskop lysbilde ved å plassere spissen av roten på lysbildet og dra den bort fra spissen for å sette skyte ned flush med lysbildet, noe som sikrer en rettet rot for best bildebehandling. Tilsett en dråpe vann eller steril plantevekst medium til hver prøve for å hydrere grensesnitt mellom dekslepper og lysbilder.Plasser en glassdeksle like over rotkronen og under skytebladene for å unngå skråstreking av dekkslippen, og trykk forsiktig ned. Deretter kan du se for deg bakteriene ved hjelp av passende eksitasjons-/utslippsfiltre for å skille bakterier fra hverandre og planteroten. Pseudomonas simiae, naturlig fluorescerende bakterie, kolonisert Arabidopsis thaliana røtter og ble opprettholdt på roten etter overføring til plantevekst medium.Root krone, mid-lengde, og tips viser fluorescens på grunn av kolonisering av Pseudomonas simiae. Den negative kontrollen uten bakterier viste ingen kolonisering. Når Pseudomonas simiae på Arabidopsis thaliana røtter ble kvantifisert etter 18 timer med kolonisering eller 72 timers vedlikehold, totalt antall kolonidannende enheter per frøplante på begge tidspunktene viste god reproduserbarhet på tvers av biologiske repliker utført på forskjellige dager.Det var en økning i antall kolonidannende enheter per frøplante etter 72 timer i vedlikeholdsmedium, sammenlignet med tallene observert ved postkolonisering 18-timers tidspunkt, noe som indikerer at aktiv vekst av de koloniserte bakteriene på plantroten skjedde under vedlikeholdsstadiet. Tre arter av bakterier isolert fra Arabidopsis thaliana dyrket i naturlig jord under laboratorieforhold ble brukt til å overvåke foreningen av flere arter på planterøtter. De var tydelig differensiert på medier som inneholder X-gal på grunn av forskjeller i kolonimorfologi og farge, noe som tillot å telle kolonidannende enheter per frøplante av hver art uten antibiotikavalg, selv i multi-arts kokultur.Disse tre bakterieartene ble alle kolonisert og opprettholdt på roten, enten alene eller i bakteriell kokultur. Hver art viste trender som var like på tvers av ulike biologiske og tekniske repliker, som viser at denne protokollen kan brukes til å måle både relative eller totale kolonidannende enheter per rot av hver art. Når de dyrkes alene, viste ingen individuelle arter betydelig økning i overflod under vedlikeholdsstadiet, men de generelle kolonidannende enhetene per rot av det kombinerte samfunnet økte i kokulturer, noe som indikerer at disse bakteriene ikke forbyr kolonisering av de andre stammene.De vanskeligste trinnene er de som krever fjerning av intakte planter fra mesh-diskene. Å være tålmodig og forsiktig vil gjøre dette mulig. Hvis bakteriecellene er fluorescerende, kan prøvene sorteres etter strømningscytometri for å bestemme det relative antallet celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en<em&gt; In Vitro</em&gt; Overholdelse analysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Vurdering av bakterieinvasjon av hjerteceller i kultur og hjertekolonisering hos infiserte mus ved hjelp av Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bakteriell Leaf Infiltrasjon analysen for Fine Karakterisering av Plant forsvar svar bruker<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudo syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementering av en gjennomtrengelig membran Insert-baserte infeksjon System for å studere effekter av utskilt toksiner på Pattedyrvertsceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisning av enterohemorrhagiske Escherichia Coli kolonisering i Murine vert av ikke-invasiv i Vivo bioluminescens System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høy gjennomstrømming Shigella-spesifikke bakteriedrepende analysen

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Mønster-utløst oksidativt burst og frøplante Veksthemming analyser i Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Høy gjennomstrømning screening av kjemiske forbindelser for å belyse deres effekter på bakteriell utholdenhet

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...