Name: monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por fundos de pesquisa fornecidos pelo departamento de pesquisa de energia biológica e ambiental (DOE-BER 0000217519 a E.A.S.), a National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 para E. A. S). O SLH também foi apoiado pelo programa de bolsas de pós-graduação da National Science Foundation. Agradecemos ao Dr. Jeffery Dangl por fornecer cepas bacterianas e uma visão inestimável. Agradecemos ao Dr. Andrew Klein e Matthew J. Powers por sugestões experimentais. Finalmente, a SLH gostaria de agradecer as ligações nas redes sociais por nos lembrares que a difusão da ciência é um privilégio e uma responsabilidade, especialmente através de meios criativos e acessíveis.

Nota: a configuração experimental é descrita para maior clareza e usada para gerar os resultados representativos incluídos neste relatório, mas as condições podem ser modificadas conforme desejado. Todos os passos devem ser realizados usando EPI e após reccomendations institucionais e federais para a segurança, de acordo com o status BSL das bactérias utilizadas.
1. caracterização de bactérias
<ol><li>Determine a morfologia das bactérias na placa de agar de médio crescimento. ...

<ol>
	<li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+disease:+a+threat+to+global+food+security.">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li><li>Cook, A. M., Grossenbacher, H., H&#252;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+microbes+with+biodegradative+potential.">Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential.</a> Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).</li><li>Vacheron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+and+root+system+functioning.">Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning.</a> Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).</li><li>Backer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Growth-Promoting+Rhizobacteria:+Context,+Mechanisms+of+Action,+and+Roadmap+to+Commercialization+of+Biostimulants+for+Sustainable+Agriculture.">Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture.</a> Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).</li><li>Zamioudis, C., Pieterse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+immunity+by+beneficial+microbes.">Modulation of host immunity by beneficial microbes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).</li><li>Kr&#246;ber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+strain+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+on+the+microbial+community+in+the+rhizosphere+of+lettuce+under+field+conditions+analyzed+by+whole+metagenome+sequencing.">Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Strategies+to+Separate+Root-Associated+Microbial+Communities:+A+Crucial+Choice+in+Rhizobiome+Research.">Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).</li><li>Woodward, A. W., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+in+Bloom:+A+Primer+on+the+Arabidopsis+thaliana+Model+System.">Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System.</a> Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).</li><li>Alatorre-Cobos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved,+low-cost,+hydroponic+system+for+growing+Arabidopsis+and+other+plant+species+under+aseptic+conditions.">An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions.</a> BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).</li><li>Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+with+rhizosphere+bacteria+can+confer+an+adaptive+advantage+to+plants.">Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants.</a> Nature Plants. 1 (6), (2015).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-AMP+Acts+as+an+Extracellular+Signal+That+Impacts.">Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts.</a> MBio. 9 (2), (2018).</li><li>Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+biofilm+induction+by+plant+polysaccharides.">Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Bacteria+to+Plant+Surfaces+Measured+in+the+Laboratory.">Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory.</a> Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> Journal of Visual Experiments. (60), (2012).</li><li>Cole, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+bacterial+plant+colonization+genes.">Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes.</a> PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirated+Siderophores+Promote+Sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).</li><li>Gange, A. C., Gadhave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+promote+plant+size+inequality.">Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality.</a> Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+bacterial+adaptation+to+plants.">Genomic features of bacterial adaptation to plants.</a> Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).</li><li>Mart&#237;nez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+root+microbiomes+for+healthier+crops+and+soils+using+beneficial,+environmentally+safe+bacteria.">Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria.</a> Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).</li><li>Niu, B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+Composition+Dynamics+of+a+Maize+Root-associated+Simplified+Bacterial+Community+and+Evaluation+of+Its+Biological+Control+Effect.">Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect.</a> Bio Protocol. 8 (12), (2018).</li></ol>

Plantas em todos os ambientes interagem com milhares a milhões de diferentes bactérias e fungos5,7. Essas interações podem impactar negativamente e positivamente a saúde das plantas, com potenciais efeitos na produção de culturas e no rendimento alimentar. Trabalhos recentes também sugerem que a colonização variável de culturas por PGPBs pode ser responsável por tamanho de planta imprevisível e produtividade de culturas em ensaios de campo<sup class=...

A destruição das culturas por doenças bacterianas e fúngicas resulta na diminuição da produção de alimentos e pode perturbar severamente a estabilidade global1. Com base na descoberta de que os micróbios em solos supressores são responsáveis pelo aumento da saúde vegetal2, os cientistas perguntaram se o microbioma vegetal pode ser aproveitado para apoiar o crescimento das plantas, modificando a presença e abundância de particular espécies bacterianas3. As bactérias encontradas para ajudar no crescimento ou no desenvolvimento de planta são denominadas coletivamente bactérias promotoras do crescimento de planta (PGPB). Mais recentemente, os estudos mudaram de simplesmente identificar potencial PGPB para compreender como interkingdom interações no solo, em torno de raízes, ou na rizosfera (a área diretamente circundante e incluindo a superfície radicular) pode estar impactando PGPB atividade4.
A colonização por rizosfera pelo PGPB pode aumentar a saúde ou o desenvolvimento de plantas hospedeiras em resposta a diversos estressores em relação às plantas não colonizadas5. Entretanto, os resultados são frequentemente mais variáveis em condições nativas do solo comparadas àquelas observadas nas configurações de estufa e de laboratório de perto controladas6. Uma hipótese para essa diferença é que o crescimento ou o comportamento do pgpb pode ser inibido por bactérias ou fungos nativos do solo nos campos7,8. Efeitos benéficos por bactérias rizosfera geralmente dependem da capacidade das bactérias para 1) localizar e mover-se para a raiz, 2) colonizar a raiz através da formação de biofilme, e 3) interagir com a planta hospedeira ou patógenos através da produção de pequenas moléculas metabolitos7,9. Qualquer um desses comportamentos de colonização pode ser afetado pela presença e atividade de micróbios vizinhos10.
Foi elaborado um sistema para quantificar e visualizar esses distintos estágios bacterianos de colonização da rizosfera (Figura 1). Essa abordagem facilitará estudos investigando por que a manutenção de PGPB a longo prazo não é, por vezes, observada após a transferência de plantas para novos ambientes, como durante o plantio de mudas pré-inoculadas. A Arabidopsis Arabidopsis thaliana foi escolhida como modelo vegetal devido ao seu uso extensivo em estudos laboratoriais, bem como aos amplos dados disponíveis sobre suas interações microbianas11. Há três estágios no sistema: 1) crescimento de A. Arabidopsis thaliana , 2) colonização bacteriana e 3) manutenção bacteriana (ver Figura 1). Porque a. Arabidopsis thaliana é uma planta terrestre, era importante assegurar-se de que não sofresse o esforço de água indevido no sistema hidropônico12. Inspirados nos métodos utilizados por Haney et al.13, as mudas são cultivadas em malha plástica para separar a parte aérea do meio de crescimento líquido. Este sistema não parece comprometer a saúde eo desenvolvimento do hospedeiro da planta, e melhora a. Arabidopsis thaliana crescimento em líquido11. À medida que a planta atira flutua acima da superfície, as raízes são totalmente expostas à colonização por bactérias inoculadas no meio de crescimento bacteriano líquido. Isto permite que as bactérias do interesse sejam examinadas para a colonização nos nutrientes que são as mais favoráveis ao crescimento, ao então desloc condições para permitir que a planta continue crescendo em um meio nutriente projetado suportar seu crescimento. Ambos os estágios incluem agitação constante para prevenir a anóxia da raiz13. As bactérias podem ser visualizadas ou quantificadas a partir das raízes da planta após a transferência do meio de colonização ou do meio de manutenção. Este sistema hidropônico é muito flexível, permitindo que as condições experimentais e as tensões aplicadas sejam facilmente alteradas, dependendo dos interesses dos pesquisadores.
Este método descrito é importante no contexto do corpo maior da literatura sobre interações planta-micróbe porque fornece um sistema robusto para estudar estas interações na superfície da raiz ao igualmente ser customizável às preferências do crescimento de bactérias diferentes. Laboratórios de biologia vegetal muitas vezes executam experimentos de colonização de planta-micróbe em ágar sólido, permitindo apenas movimento planar (se isso) de bactérias, exigindo também a manipulação potencialmente destrutiva de plantas durante a transferência subsequente. Em contrapartida, os laboratórios de microbiologia têm freqüentemente priorizado a saúde das bactérias dentro de seus experimentos, em detrimento das plantas14,15. Essas diferentes prioridades de laboratórios centrados em plantas e Microbiologia têm historicamente dificultado a comparação de resultados entre esses grupos, uma vez que cada um tipicamente otimiza as condições experimentais para otimizar seu organismo de interesse15. O sistema de flutuação-malha-planta-crescimento descrito aqui impede a submersão completa da planta, uma vantagem notável aos estudos microbiologia-orientados precedentes, ao igualmente otimizar temporariamente o crescimento e a sobrevivência das bactérias para facilitar a colonização. Assim, o ensaio que apresentamos aqui pode abordar as preocupações de ambos os biólogos de plantas (sobre a hidratação e manipulação tátil da planta), satisfazendo os critérios dos microbiologistas (permitindo diferentes condições de crescimento bacteriano e múltiplas interações de espécies)7. Este protocolo é projetado ser adaptável para o uso com várias bactérias, plantas, e condições ambientais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>1801343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeraseal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>BE255A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria of Interest</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stored at -80&#730;C in 40% glycerol preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoAgar</td>
			<td>BD</td>
			<td>2306428; REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 &#181;moles/m&#178;/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21&#730;C, with inner power outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator Jar: glass or heavy plastic</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flame</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>At optimal temperature for growth of specified bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetters</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Volumes 5 &#181;L to 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (preferably fluorescence)</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Could be light if best definition not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Salts + MES</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M70300-50.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Plate Shaker</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL total volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Hole Punch</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Approximately 7mm punch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>MMM1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Mesh</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1100t41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>x4281c</td>
			<td>other vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suggested Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Prong Ultrasonicator attachment</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sonicating multiple samples at once. Can be done individually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumaseal II</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>FE124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipetter/Repetter</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well plates</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Materials Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana seeds</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arthrobacter nicotinovorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curtobacterium oceanosedimentum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbacterium oleivorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas simiae WCS417r</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system

As bactérias formam microbiomas complexos de rizosfera em forma de micróbios interagindo, organismos maiores e o ambiente abiótico. Em condições laboratoriais, a colonização por rizosfera por bactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPB) pode aumentar a saúde ou o desenvolvimento de plantas hospedeiras em relação às plantas não colonizadas. No entanto, em configurações de campo, os tratamentos bacterianos com PGPB muitas vezes não fornecem benefícios substanciais para as culturas. Uma explanação é que esta pode ser devido à perda do PGPB durante interações com os micróbios endógenos do solo sobre o tempo da planta. Essa possibilidade tem sido difícil de confirmar, uma vez que a maioria dos estudos se concentra na colonização inicial e não na manutenção do PGPB dentro das comunidades de rizosfera. É a hipótese de que a montagem, a coexistência e a manutenção de comunidades bacterianas são moldadas por características determinísticas do microambiente da rizosfera, e que essas interações podem impactar a sobrevida do PGPB em ambientes nativos. Para estudar esses comportamentos, um ensaio hidropônico de crescimento vegetal é otimizado usando Arabidopsis Arabidopsis thaliana para quantificar e visualizar a distribuição espacial de bactérias durante a colonização inicial das raízes das plantas e após a transferência para o crescimento diferente Ambientes. A reprodutibilidade e utilidade deste sistema são então validadas com o bem estudado PGPB Pseudomonas Simiae. Para investigar como a presença de múltiplas espécies bacterianas pode afetar a colonização e a dinâmica de manutenção na raiz da planta, uma comunidade modelo de três cepas bacterianas (um Arthrobacter, Curtobacteriume microbacterium espécies) originalmente isoladas da rhizofera a . Arabidopsis thaliana é construída. Mostra-se que a presença destas espécies bacterianas diversas pode ser medida usando este ensaio hidropônico da planta-maintanence, que fornece uma alternativa aos estudos de comunidade bacterianos de sequenciamento-baseados. Estudos futuros que utilizam este sistema podem melhorar a compreensão do comportamento bacteriano em microbiomas de plantas multiespécies ao longo do tempo e em mudanças nas condições ambientais.

O bem caracterizado PGPB P. Simiae WCS417r é conhecido por colonizar as raízes de a. Arabidopsis thaliana na cultura hidropônica. Esta bactéria naturalmente fluorescente pode ser facilmente visualizada usando microscopia nas raízes das mudas após a colonização (Figura 2). Embora seja possível a imagem do comprimento total dessas mudas de a. Arabidopsis thaliana ' (4 – 6 mm de comprimento) raízes, fazê-lo para muitas pla...

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Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Aqui nós descrevemos um ensaio hidropônico do crescimento de planta para quantificar a presença da espécie e para visualizar a distribuição espacial das bactérias durante a colonização inicial de raizes de planta e após sua transferência em ambientes diferentes do crescimento.

Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

A maioria dos experimentos estuda interações entre plantas e micróbios focando na colonização, mas nosso protocolo foi projetado para olhar tanto para a colonização quanto para a manutenção das bactérias na raiz. Podemos mudar o experimento para caber diferentes bactérias e plantas, e podemos até testar várias bactérias em cada placa de 24 poços. Para começar, use um perfurador de furo padrão para criar discos de malha plástica.Colete os discos em um recipiente de vidro e cubra livremente. Esterilize usando uma autoclave definida para um ciclo seco de 20 minutos. Use pinças esterilizadas por chamas para distribuir aproximadamente 40 discos de malha esterilizados em uma única camada através da superfície de placa de ágar média de crescimento vegetal previamente preparada.Coloque duas sementes previamente esterilizadas no centro de cada malha. Sele a placa com fita cirúrgica, e incubar por dois a seis dias a quatro graus Celsius na escuridão para vernalizar as sementes. Em seguida, coloque a placa do lado do ágar para baixo em uma câmara de crescimento de plantas por oito a 10 dias sob configurações de dia curto de nove horas de luz a 21 graus Celsius e 15 horas de escuro a 18 graus Celsius para germinar e cultivar mudas.Adicione um mililitro de meio de crescimento bacteriano a cada poço de uma placa estéril de 24 poços. Para transferir as mudas germinadas embutidas na malha, use fórceps esterilizados por chamas para descascar suavemente a malha contendo duas mudas germinadas, igualmente dimensionadas, e mudas intactas para cima e para fora da placa de ágar. Transfira um carro alegórico com mudas para cada poço de líquido de crescimento bacteriano, lado raiz para baixo.Em seguida, bactérias resuspend cultivadas durante a noite em placas de ágar em meio de crescimento bacteriano líquido. Adicione 10 microliters de suspensão bacteriana a cada poço, exceto para poços de controle somente de mídia, para uma concentração final de um milhão de unidades formadoras de colônias de bactérias por poço. Para selar a placa para crescimento estéril, pressione cuidadosamente o filme permeável a gás através da placa sem tocar no lado pegajoso.Aplique pressão em torno de cada um dos anéis feitos pelos poços para garantir que cada poço tenha sido selado individualmente. Em seguida, feche a placa com sua tampa de plástico aconchegante sobre o filme permeável a gás. Coloque a placa em uma câmara de crescimento vegetal em um agitador de placa orbital definido a 220 rpm, e incubar por 18 horas sob as mesmas condições que as mudas foram originalmente germinadas.Para enxaguar todos os carros alegóricos com plantas, adicione um mililitro de água estéril a cada poço de uma nova placa de 24 poços. Remova o filme permeável a gás da placa com plantas e use fórceps estéreis para transferir boias para poços com água, e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Em seguida, encha cada poço de uma nova placa de 24 poços com um mililitro de meio de crescimento vegetal.Transfira uma malha para cada poço e cubra com um selo permeável a gás. Incubar por 72 horas no agitador de placa orbital a 220 rpm na câmara de crescimento da planta. Após a incubação, enxágue as plantas como feito anteriormente.Após a lavagem, remova as mudas da malha colocando suavemente fórceps esterilizados por chamas abaixo das folhas no lado da folha da malha. Belisque levemente a haste, e mexa as mudas para cima e para longe da malha para desalojar a raiz sem quebrá-la. Para remover bactérias das raízes vegetais, transfira as mudas de cada malha para poços individuais de uma placa de sônica de 24 poços contendo um mililitro de água dupla destilada.Sonicate todas as amostras dentro da placa ao mesmo tempo usando um sônico multifacetado como descrito no manuscrito. Para quantificar as bactérias, realize diluições 10 vezes mais vezes das amostras sonicadas em meio de crescimento bacteriano. Espalhe usando contas de vidro estéreis e incubar na temperatura ideal para bactérias até que colônias individuais sejam contáveis.Para coletar raízes intactas da planta, use fórceps para remover as mudas da malha. Em seguida, transfira cada planta para um slide de microscópio colocando a ponta da raiz no slide e arrastando-a para longe da ponta para definir o tiro para baixo com o slide, garantindo uma raiz endireitada para melhor imagem. Adicione uma gota de água ou meio de crescimento vegetal estéril a cada amostra para hidratar interfaces entre as tampas e slides.Coloque uma mancha de vidro logo acima da coroa raiz e abaixo das folhas de ensaio para evitar inclinação da tampa, e pressione suavemente para baixo. Em seguida, imagem as bactérias usando filtros apropriados de excitação/emissão para diferenciar bactérias entre si e a raiz da planta. Pseudomonas simiae, bactéria naturalmente fluorescente, colonizada raízes arabidopsis thaliana e foi mantida na raiz após transferência para o meio de crescimento vegetal.Coroa radicular, comprimento médio e ponta mostram fluorescência devido à colonização de Pseudomonas simiae. O controle negativo sem bactérias não mostrou colonização. Quando pseudomonas simiae sobre raízes arabidopsis thaliana foram quantificadas após 18 horas de colonização ou 72 horas de manutenção, o número total de unidades formadoras de colônias por muda em ambos os momentos mostrou boa reprodutibilidade através de réplicas biológicas realizadas em dias diferentes.Houve aumento no número de unidades formadoras de colônias por muda após 72 horas em meio de manutenção, em comparação com os números observados no ponto de tempo pós-colonização de 18 horas, indicando que o crescimento ativo das bactérias colonizadas na raiz da planta ocorreu durante a fase de manutenção. Três espécies de bactérias isoladas de Arabidopsis thaliana cultivadas em solo natural em condições laboratoriais foram utilizadas para monitorar a associação de múltiplas espécies em raízes vegetais. Eles foram claramente diferenciados em meios contendo X-gal devido a diferenças na morfologia e cor das colônias, o que permitiu contar as unidades formadoras de colônias por muda de cada espécie sem seleção de antibióticos, mesmo na cocultura de várias espécies.Estas três espécies de bactérias foram todas colonizadas e mantidas na raiz, seja sozinhas ou em cocultura bacteriana. Cada espécie mostrou tendências semelhantes em diferentes réplicas biológicas e técnicas, mostrando que este protocolo pode ser usado para medir unidades relativas ou totais de formação de colônias por raiz de cada espécie. Quando cultivadas sozinhas, nenhuma espécie individual apresentou aumento substancial em abundância durante a fase de manutenção, mas as unidades globais de formação de colônias por raiz da comunidade combinada aumentaram em coculturas, indicando que essas bactérias não proíbem a colonização das outras cepas.Os passos mais difíceis são aqueles que requerem a remoção de plantas intactas dos discos de malha. Ser paciente e gentil tornará isso possível. Se as células bacterianas forem fluorescentes, as amostras podem ser classificadas por citometria de fluxo para determinar o número relativo de células.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Um modelo ortotópico de câncer de ovário seroso em camundongos imunocompetentes para In vivo Imaging Tumor e Monitoramento de Tumor respostas imunes

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Imunologia e Infecção

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Patossistema

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementação de um Sistema de Infecção baseado em Inserir Permeável Membrana para estudar os efeitos de secretada bacterianas toxinas em células hospedeiras de mamíferos

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...