Name: monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Detta arbete stöddes av forskningsmedel från Institutionen för energi biologisk och miljö forskning (DOE-BER 0000217519 till E.A.S.), National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 till E. A. S). SLH stöddes också av National Science Foundation Graduate Research Fellowship program. Vi tackar Dr Jeffery Dangl för att ge bakteriestammar och ovärderlig insikt. Vi tackar Dr Andrew Klein och Matthew J. Powers för experimentella förslag. Slutligen vill SLH tacka anslutningar på sociala medier för att påminna oss om att spridning av vetenskap är ett privilegium och ett ansvar, särskilt genom kreativa och tillgängliga medel.

Anmärkning: den experimentella installationen beskrivs för tydlighetens skull och används för att generera representativa resultat som ingår i denna rapport, men villkoren kan ändras efter behov. Alla steg bör utföras med hjälp av PPE och efter institutionella och federala reccomendations för säkerhet, enligt BSL status av de bakterier som används.
1. karakterisering av bakterier
<ol><li>Bestäm morfologin av bakterier på odlingssubstrat agar plattan. Omsuspendera cellerna vid e...

<ol>
	<li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+disease:+a+threat+to+global+food+security.">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li><li>Cook, A. M., Grossenbacher, H., H&#252;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+microbes+with+biodegradative+potential.">Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential.</a> Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).</li><li>Vacheron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+and+root+system+functioning.">Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning.</a> Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).</li><li>Backer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Growth-Promoting+Rhizobacteria:+Context,+Mechanisms+of+Action,+and+Roadmap+to+Commercialization+of+Biostimulants+for+Sustainable+Agriculture.">Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture.</a> Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).</li><li>Zamioudis, C., Pieterse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+immunity+by+beneficial+microbes.">Modulation of host immunity by beneficial microbes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).</li><li>Kr&#246;ber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+strain+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+on+the+microbial+community+in+the+rhizosphere+of+lettuce+under+field+conditions+analyzed+by+whole+metagenome+sequencing.">Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Strategies+to+Separate+Root-Associated+Microbial+Communities:+A+Crucial+Choice+in+Rhizobiome+Research.">Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).</li><li>Woodward, A. W., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+in+Bloom:+A+Primer+on+the+Arabidopsis+thaliana+Model+System.">Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System.</a> Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).</li><li>Alatorre-Cobos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved,+low-cost,+hydroponic+system+for+growing+Arabidopsis+and+other+plant+species+under+aseptic+conditions.">An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions.</a> BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).</li><li>Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+with+rhizosphere+bacteria+can+confer+an+adaptive+advantage+to+plants.">Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants.</a> Nature Plants. 1 (6), (2015).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-AMP+Acts+as+an+Extracellular+Signal+That+Impacts.">Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts.</a> MBio. 9 (2), (2018).</li><li>Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+biofilm+induction+by+plant+polysaccharides.">Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Bacteria+to+Plant+Surfaces+Measured+in+the+Laboratory.">Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory.</a> Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> Journal of Visual Experiments. (60), (2012).</li><li>Cole, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+bacterial+plant+colonization+genes.">Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes.</a> PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirated+Siderophores+Promote+Sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).</li><li>Gange, A. C., Gadhave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+promote+plant+size+inequality.">Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality.</a> Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+bacterial+adaptation+to+plants.">Genomic features of bacterial adaptation to plants.</a> Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).</li><li>Mart&#237;nez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+root+microbiomes+for+healthier+crops+and+soils+using+beneficial,+environmentally+safe+bacteria.">Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria.</a> Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).</li><li>Niu, B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+Composition+Dynamics+of+a+Maize+Root-associated+Simplified+Bacterial+Community+and+Evaluation+of+Its+Biological+Control+Effect.">Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect.</a> Bio Protocol. 8 (12), (2018).</li></ol>

Växter i alla miljöer samverkar med tusentals till miljontals olika bakterier och svampar5,7. Dessa interaktioner kan antingen negativt och positivt påverka växthälsan, med potentiella effekter på skördeavkastning och livsmedelsproduktion. Nyligen arbete tyder också på att varierande kolonisering av grödor av PGPBs kan redogöra för oförutsägbar växt storlek och skördeavkastning i fältförsök22. Förstå mekanismerna bakom...

Gröda förstörelse av bakterie-och svampsjukdomar resulterar i sänkt livsmedelsproduktion och kan allvarligt störa den globala stabiliteten1. Baserat på upptäckten att mikrober i suppressiva jordar är ansvariga för att öka växthälsan2, forskare har frågat om växten mikrobiomet kan utnyttjas för att stödja växternas tillväxt genom att ändra förekomst och överflöd av särskilda bakteriearter3. Bakterier som finns till stöd i växternas tillväxt eller utveckling benämns kollektivt växttillväxt främjande bakterier (PGPB). På senare tid har studier skiftat från att bara identifiera potentiella pgpb att förstå hur interkingdom interaktioner i jorden, runt rötter, eller i rhizosfären (området direkt omgivande och inklusive roten ytan) kan påverka pgpb verksamhet4.
Rhizosphere kolonisering av PGPB kan öka hälsan eller utvecklingen av värdväxter som svar på olika stressorer i förhållande till okoloniserade växter5. Emellertid, resultaten är ofta mer varierande i inhemska markförhållanden jämfört med de som observerats i den nära kontrollerade växthus-och laboratorie inställningar6. En hypotes för denna skillnad är att tillväxten eller beteendet hos pgpb kan hämmas av infödda jordbakterier eller svampar i fälten7,8. Gynnsamma effekter av rhizosfären bakterier beror i allmänhet på förmågan hos bakterierna att 1) lokalisera och gå mot roten, 2) kolonisera roten genom biofilm formation, och 3) interagera med värd växten eller patogener via produktion av små molekyl metaboliter7,9. Någon av dessa kolonisering beteenden kan påverkas av närvaron och aktiviteten av angränsande mikrober10.
Vi designade ett system för att kvantifiera och visualisera dessa distinkta bakteriella koloniseringsstadier av rhizosfären (figur 1). Detta tillvägagångssätt kommer att underlätta studier som undersöker varför långsiktigt PGPB underhåll ibland inte observeras efter överföring av växter till nya miljöer, såsom vid plantering av pre-inokulerade plantor. Arabidopsis thaliana som valdes som en växt modell på grund av dess omfattande användning i laboratoriestudier samt de rikliga data som finns om dess mikrobiella interaktioner11. Det finns tre stadier i systemet: 1) A. thaliana Growth, 2) bakteriell kolonisering, och 3) bakterie underhåll (se figur 1). Eftersom a. thaliana är en markbunden anläggning, var det viktigt att se till att det inte var lidande onödig vattenstress i hydroponiska systemet12. Inspirerad av de metoder som används av Haney et al.13, plantorna odlas på plast mesh för att separera skott från flytande odlingssubstrat. Detta system verkar inte äventyra hälsan och utvecklingen av anläggningen värd, och det förbättrar en. thaliana tillväxt i flytande11. När anläggningen skjuter flyter över ytan, rötterna är fullt utsatta för kolonisering av bakterier inokuleras i flytande bakterietillväxt medium. Detta tillåter bakterier av intresse som skall undersökas för kolonisering i näringsämnen som är mest gynnsam för tillväxt, medan sedan skiftande förhållanden för att tillåta växten att fortsätta växa i ett näringsämne medium som utformats för att stödja dess tillväxt. Båda stegen inkluderar stadig skakning för att förhindra anoxia av roten13. Bakterier kan visualiseras eller kvantifieras från växternas rötter efter överföring från antingen koloniseringsmediet eller underhålls mediet. Detta hydroponiska systemet är mycket flexibelt, vilket gör att experimentella förhållanden och tillämpade spänningar lätt kan ändras beroende på intressen av forskarna.
Denna beskrivna metod är viktig i samband med den större kroppen av litteratur om växt-Microbe interaktioner eftersom det ger ett robust system för att studera dessa interaktioner på roten ytan samtidigt som den är anpassningsbar till tillväxt preferenser olika bakterier. Växtbiologi Labs utför ofta växt-Microbe kolonisering experiment på fast agar, vilket möjliggör endast planar rörelse (om det) av bakterier samtidigt som kräver potentiellt destruktiva manipulation av växter under efterföljande överföring. I kontrast, mikrobiologi Labs har ofta prioriterat hälsan hos bakterierna i sina experiment, till nackdel för växterna14,15. Dessa olika prioriteringar av växt-och mikrobiologi fokuserade laboratorier har historiskt gjort det svårt att jämföra resultat mellan dessa grupper, eftersom varje typiskt optimerar experimentella förhållanden för att optimera deras organism av intresse15. Den flytande-mesh-växt-tillväxtsystem som beskrivs här förhindrar full Plant nedsänkning, en anmärkningsvärd fördel för tidigare mikrobiologi orienterade studier, samtidigt också tillfälligt optimera tillväxten och överlevnaden av bakterier för att underlätta kolonisering. Sålunda, det test som vi presenterar här kan ta upp farhågor från både växt biologer (om över-hydrering och taktil manipulation av anläggningen) samtidigt som uppfyller kriterierna för mikrobiologer (möjliggör olika bakterietillväxt villkor och flera Artens interaktioner)7. Detta protokoll är utformat för att vara anpassningsbar för användning med olika bakterier, växter och miljöförhållanden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>1801343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeraseal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>BE255A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria of Interest</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stored at -80&#730;C in 40% glycerol preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoAgar</td>
			<td>BD</td>
			<td>2306428; REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 &#181;moles/m&#178;/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21&#730;C, with inner power outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator Jar: glass or heavy plastic</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flame</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>At optimal temperature for growth of specified bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetters</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Volumes 5 &#181;L to 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (preferably fluorescence)</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Could be light if best definition not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Salts + MES</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M70300-50.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Plate Shaker</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL total volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Hole Punch</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Approximately 7mm punch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>MMM1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Mesh</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1100t41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>x4281c</td>
			<td>other vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suggested Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Prong Ultrasonicator attachment</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sonicating multiple samples at once. Can be done individually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumaseal II</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>FE124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipetter/Repetter</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well plates</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Materials Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana seeds</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arthrobacter nicotinovorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curtobacterium oceanosedimentum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbacterium oleivorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas simiae WCS417r</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system

Bakterier bildar komplexa rhizosfären mikrobiomes formad av samverkande mikrober, större organismer, och den abiotiska miljön. Under laboratorieförhållanden, rhizosfären kolonisering av växttillväxt främjande bakterier (pgpb) kan öka hälsan eller utvecklingen av värdväxter i förhållande till okoloniserade växter. Men i Fältinställningar, bakteriella behandlingar med PGPB ger ofta inte betydande fördelar för grödor. En förklaring är att detta kan bero på förlust av PGPB under interaktioner med endogena jord mikrober över livslängden på växten. Denna möjlighet har varit svårt att bekräfta, eftersom de flesta studier fokuserar på den initiala koloniseringen snarare än underhåll av pgpb inom rhizosfären samhällen. Det är en hypotes här att församlingen, samexistens, och underhåll av bakteriesamhällen formas av deterministiska funktioner i rhizosfären microenvironment, och att dessa interaktioner kan påverka pgpb överlevnad i inhemska inställningar. För att studera dessa beteenden, en hydroponiska växt-Tillväxtanalys är optimerad med Arabidopsis thaliana att kvantifiera och visualisera den rumsliga fördelningen av bakterier under initial kolonisering av växtrötter och efter överföring till olika tillväxt Miljöer. Detta Systems reproducerbarhet och nytta är sedan valideras med den väl studerade PGPB Pseudomonas simiae. För att undersöka hur närvaron av flera bakteriearter kan påverka kolonisering och underhåll dynamik på växten roten, en modell gemenskap från tre bakteriestammar (en Arthrobacter, Curtobacterium, och microbacterium arter) som ursprungligen isolerats från A. thaliana rhizosfären är konstruerad. Det visas att närvaron av dessa olika bakteriearter kan mätas med hjälp av denna hydroponiska Plant-maintanence assay, som ger ett alternativ till sekvenserings-baserade bakteriella samhällsstudier. Framtida studier med detta system kan förbättra förståelsen av bakterie beteende i flerartsbaserade växt mikrobiomer över tid och i förändrade miljöförhållanden.

Den väl karaktäriserade PGPB P. simiae WCS417r är känd för att kolonisera rötterna av A. thaliana i hydroponiska kulturen. Denna naturligt fluorescerande bakterie kan enkelt visualiseras med hjälp av mikroskopi på rötterna av plantor efter kolonisation (figur 2). Även om det är möjligt att avbilda hela längden av dessa A. thaliana plantor "(4-6 mm längd) rötter, gör så för många växter skulle ta en prohibitiv tid...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Här beskriver vi en hydroponiska växttillväxt analys för att kvantifiera Art närvaro och visualisera den rumsliga fördelningen av bakterier under initial kolonisering av växtrötter och efter deras överföring till olika tillväxt miljöer.

Övervakning bakteriell kolonisering och underhåll på Arabidopsis thaliana rötter i en flytande hydroponiska system

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

De flesta experiment studerar växt-mikrob interaktioner genom att fokusera på kolonisering, men vårt protokoll är utformat för att titta både på kolonisering och underhåll av bakterierna på roten. Vi kan ändra experimentet för att passa olika bakterier och växter, och vi kan även testa flera bakterier i varje 24-brunnsplatta. Till att börja med använder en vanlig hålslagare för att skapa diskar av plastnät.Samla diskarna i en glasbehållare, och täck löst. Sterilisera med hjälp av en autoklav inställd på en 20-minuters torr cykel. Använd flamsteriliserad pincett för att distribuera cirka 40 steriliserade mesh-diskar i ett enda lager över ytan av tidigare förberedda växttillväxt medium agar platta.Placera två tidigare steriliserade frön i mitten av varje nät. Försegla plattan med kirurgisk tejp, och inkubera i två till sex dagar vid fyra grader Celsius i mörker för att vernalize fröna. Placera sedan plattan agar-sidan ner i en växttillväxtkammare i åtta till 10 dagar under korta dagar inställningar av nio timmars ljus vid 21 grader Celsius och 15 timmars mörker vid 18 grader Celsius för att gro och växa plantor.Tillsätt en milliliter bakterietillväxtmedium till varje brunn av en steril 24-brunnsplatta. För att överföra grodda plantor inbäddade i mesh, använd flamsteriliserade tövråkar för att försiktigt skala nätet som innehåller två grodda, lika stora, och oskadade plantor upp och utanför agarplattan. Överför en flottör med plantor till varje brunn av bakterietillväxtflytande, rot-sida besegrar.Därefter återanvändbara bakterier som odlas över natten på agarplattor i flytande bakterietillväxtmedium. Tillsätt 10 mikroliter bakteriell suspension till varje brunn, med undantag för media-bara kontroll brunnar, för en slutlig koncentration av en miljon koloninbildande enheter av bakterier per brunn. För att täta plattan för steril tillväxt, tryck försiktigt gas-permeabel film över plattan utan att röra den klibbiga sidan.Applicera tryck runt var och en av de ringar som görs av brunnarna för att säkerställa att varje brunn har förslutits individuellt. Stäng sedan plattan med plastlocket snuggly över den gaspermeabla filmen. Placera plattan i en växttillväxtkammare på en orbital platta shaker inställd på 220 rpm, och inkubera i 18 timmar under samma förhållanden som plantorna var ursprungligen grodda.För att skölja alla flöten med växter, tillsätt en milliliter sterilt vatten till varje brunn av en ny 24-brunnsplatta. Ta bort gaspermeabla film från plattan med växter, och använda sterila tyckor för att överföra flottor till brunnar med vatten, och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur utan agitation. Fyll sedan varje brunn av en ny 24-brunnsplatta med en milliliter växttillväxtmedium.Överför ett nät till varje brunn, och täck med en gas-permeabel tätning. Inkubera i 72 timmar på orbital plattan shaker vid 220 rpm i växter tillväxtkammare. Efter inkubationen sköljer du växterna som tidigare gjorts.Efter sköljningen, ta bort plantorna från nätet genom att försiktigt placera flamsteriliserade tynsar under bladen på bladsidan av nätet. Lätt nypa stammen, och vicka plantorna upp och bort från nätet för att rubba roten utan att bryta den. För att avlägsna bakterier från växtrötter, överför plantor från varje nät till enskilda brunnar av en 24-brunns ultraljudsbehandling platta som innehåller en milliliter dubbeldestillerat vatten.Sonikera alla prover inom plattan på en gång med hjälp av en multipronged sonicator som beskrivs i manuskriptet. För att kvantifiera bakterierna, utföra seriella 10-faldig utspädningar av sonicated proverna i bakteriell tillväxt medium. Sprid med hjälp av sterila glaspärlor, och inkubera vid den optimala temperaturen för bakterier tills enskilda kolonier är uppräckbara.För att samla intakt växtrot, använd ttyngare för att ta bort plantorna från nätet. Sedan överför varje anläggning till ett mikroskop glida genom att placera spetsen av roten på bilden och dra den bort från spetsen för att ställa in skjuta ner spola med bilden, säkerställa en uträtad rot för bästa bildbehandling. Tillsätt en droppe vatten eller sterilt växttillväxtmedium till varje prov för att hydratgränssnitt mellan täcken och rutschkanorna.Placera ett glas coverslip strax ovanför roten kronan och under fotograferingen blad för att undvika snedställning av täckskydd, och tryck ner försiktigt. Sedan, bild bakterierna med hjälp av lämpliga excitation / utsläpp filter för att skilja bakterier från varandra och växtroten. Pseudomonas simiae, naturligt fluorescerande bakterie, koloniserade Arabidopsis thaliana rötter och bibehölls på roten följande överföring till växt tillväxt medium.Rotkrona, mitten av längd, och spets visa fluorescens på grund av kolonisering av Pseudomonas simiae. Den negativa kontrollen utan bakterier visade ingen kolonisering. När Pseudomonas simiae på Arabidopsis thaliana rötter kvantifierades efter 18 timmars kolonisering eller 72 timmars underhåll, totalt antal kolonibildande enheter per plantor vid endera tidspunkten visade god reproducerbarhet över biologiska replikat utförs på olika dagar.Det fanns en ökning av antalet kolonibildande enheter per planta efter 72 timmar i underhållsmedium, jämfört med de siffror som observerades vid tiden efter koloniseringen 18-timmars tid, vilket indikerar att aktiv tillväxt av de koloniserade bakterierna på växtroten inträffade under underhållsstadiet. Tre arter av bakterier isolerade från Arabidopsis thaliana odlas i naturlig jord under laboratorieförhållanden användes för att övervaka associeringen av flera arter på växtrötter. De var klart differentierade på massmedia som innehåller X-gal tack vare skillnader i kolonimorfologi och färgar, som tillåtet att räkna de bilda enheterna för koloni per planta av varje art utan antibiotikumval, även i multi-species coculture.Dessa tre arter av bakterier var alla koloniserade och underhålls på roten, vare sig ensam eller i bakteriell kokultur. Varje art visade trender som var liknande mellan olika biologiska och tekniska replikat, som visar att detta protokoll kan användas för att mäta både relativa eller totala kolonibildande enheter per rot av varje art. När odlas ensam, inga enskilda arter visade betydande ökning av överflöd under underhållsstadiet, men den totala kolonibildande enheter per roten av den kombinerade gemenskapen ökade i kokulturer, vilket tyder på att dessa bakterier inte förbjuder kolonisering av de andra stammarna.De svåraste stegen är de som kräver avlägsnande av intakta växter från nätskivorna. Att vara tålmodig och mild kommer att göra detta möjligt. Om bakteriecellerna är fluorescerande, kan proverna sorteras efter flödescytometri för att bestämma det relativa antalet celler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

En Orthotopic Modell av serös äggstockscancer hos immunkompetenta möss In vivo Bildgivande och övervakning av tumör Immunsvar

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adherensanalysen

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Bedömning av bakteriell invasion av hjärtceller i kultur och hjärtkolonisering hos infekterade möss med hjälp av Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bakteriell Leaf Infiltration analys för Fine karakterisering av växt Defense Svar använder<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Genomförande av ett permeabelt membran Insert-baserade Infection System för att studera effekterna av utsöndrade bakteriella toxiner på däggdjursvärdceller

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisande av entrohemoragiska Escherichia Coli koloniseringen i murina mottagande av icke-invasiva In Vivo Mareld System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Mönster-utlöst oxidativ burst och Groddplanta tillväxthämning i Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Screening av kemiska föreningar med hög genomströmning för att belysa deras effekter på bakteriell persistens

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...