Name: monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Bu çalışma, enerji biyolojik ve çevresel araştırmalar bölümü (DOE-BER 0000217519 için E.A.S.), Ulusal Bilim Vakfı (E. A. S için IOS-1343020 Ilham) tarafından sağlanan araştırma fonları tarafından destekleniyordu. SLH Ayrıca Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu programı tarafından destekleniyordu. Dr. Jeffery Dangl 'a, bakteriyel suşlar ve paha biçilmez bir anlayış sağlamak için teşekkür ederiz. Biz deneysel öneriler için Dr Andrew Klein ve Matthew J. Powers teşekkür ederiz. Son olarak, SLH bize bilim yaymak bir ayrıcalık ve bir sorumluluk, özellikle yaratıcı ve erişilebilir yollarla olduğunu hatırlatan için sosyal medya bağlantıları teşekkür etmek istiyorum.

Not: deneysel kurulum, netlik için açıklanmıştır ve bu rapora dahil edilen temsili sonuçları oluşturmak için kullanılır, ancak koşullar istediğiniz gibi değiştirilebilir. Kullanılan bakterilerin BSL durumuna göre, tüm adımlar KKD kullanılarak ve güvenlik için kurumsal ve Federal kaldığımız aşağıdaki yapılmalıdır.
1. bakterilerin karakterizasyonu
<ol><li>Büyüme orta agar plaka üzerinde bakterilerin morfolojisi belirleyin. Yaklaşık bir OD600 = 0...

<ol>
	<li>Strange, R. N., Scott, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+disease:+a+threat+to+global+food+security.">Plant disease: a threat to global food security.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).</li><li>Cook, A. M., Grossenbacher, H., H&#252;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+microbes+with+biodegradative+potential.">Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential.</a> Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).</li><li>Vacheron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+and+root+system+functioning.">Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning.</a> Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).</li><li>Backer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+Growth-Promoting+Rhizobacteria:+Context,+Mechanisms+of+Action,+and+Roadmap+to+Commercialization+of+Biostimulants+for+Sustainable+Agriculture.">Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture.</a> Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).</li><li>Zamioudis, C., Pieterse, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+immunity+by+beneficial+microbes.">Modulation of host immunity by beneficial microbes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).</li><li>Kr&#246;ber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+strain+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+on+the+microbial+community+in+the+rhizosphere+of+lettuce+under+field+conditions+analyzed+by+whole+metagenome+sequencing.">Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Strategies+to+Separate+Root-Associated+Microbial+Communities:+A+Crucial+Choice+in+Rhizobiome+Research.">Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).</li><li>Woodward, A. W., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+in+Bloom:+A+Primer+on+the+Arabidopsis+thaliana+Model+System.">Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System.</a> Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).</li><li>Alatorre-Cobos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved,+low-cost,+hydroponic+system+for+growing+Arabidopsis+and+other+plant+species+under+aseptic+conditions.">An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions.</a> BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).</li><li>Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+with+rhizosphere+bacteria+can+confer+an+adaptive+advantage+to+plants.">Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants.</a> Nature Plants. 1 (6), (2015).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-AMP+Acts+as+an+Extracellular+Signal+That+Impacts.">Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts.</a> MBio. 9 (2), (2018).</li><li>Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+biofilm+induction+by+plant+polysaccharides.">Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Bacteria+to+Plant+Surfaces+Measured+in+the+Laboratory.">Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory.</a> Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> Journal of Visual Experiments. (60), (2012).</li><li>Cole, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+bacterial+plant+colonization+genes.">Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes.</a> PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pirated+Siderophores+Promote+Sporulation+in+Bacillus+subtilis.">Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis.</a> Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).</li><li>Gange, A. C., Gadhave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+promote+plant+size+inequality.">Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality.</a> Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+bacterial+adaptation+to+plants.">Genomic features of bacterial adaptation to plants.</a> Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).</li><li>Mart&#237;nez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+root+microbiomes+for+healthier+crops+and+soils+using+beneficial,+environmentally+safe+bacteria.">Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria.</a> Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).</li><li>Niu, B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+Composition+Dynamics+of+a+Maize+Root-associated+Simplified+Bacterial+Community+and+Evaluation+of+Its+Biological+Control+Effect.">Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect.</a> Bio Protocol. 8 (12), (2018).</li></ol>

Tüm ortamlarda bitkiler milyonlarca farklı bakteri ve mantar5,7ile etkileşim. Bu etkileşimler, bitki sağlığını olumsuz ve olumlu yönde etkileyebilir, ürün verimi ve gıda üretiminde potansiyel etkilere neden olabilir. Son çalışmalar ayrıca PGPBs tarafından bitkileri değişken kolonizasyon öngörülemeyen bitki boyutu ve alan denemeleri22ürün verimi için hesap olabileceğini göstermektedir. Bu etkileşimlerin arkası...

Bakteriyel ve mantar hastalıklarla mahsul imha azaltılan gıda üretimi ile sonuçlanır ve ciddi küresel istikrar bozabilir1. Bastırıcı topraklarda mikropların bitki sağlığı artırmak için sorumlu olduğunu keşif dayanarak2, bilim adamları bitki mikrobiome varlığı ve belirli bolluğu değiştirerek bitki büyümesini desteklemek için yararlanarak olup olmadığını sordu bakteriyel türler3. Bitki büyüme veya gelişim yardım bulundu bakteri topluca bitki büyüme teşvik bakteri (PGPB) olarak adlandırılır. Daha yakın zamanda, çalışmalar sadece potansiyel pgpb tanımlamak için nasıl toprak, kökleri etrafında veya rizosfer 'de (bölge doğrudan çevreleyen ve kök yüzeyi dahil) pgpb etkileyebilir nasıl interkingdom etkileşimleri anlamak için kaymıştır Etkinlik4.
PGPB tarafından Rhizosphere kolonizasyonu, kolonize edilmemiş tesislere göre çeşitli streslere yanıt olarak ev sahibi tesislerin sağlığını veya gelişimini artırabilir5. Ancak, sonuçlar sıklıkla doğal toprak koşullarında yakından kontrollü sera ve laboratuar ayarlarında gözlenen göre daha değişkendir6. Bu fark için bir hipotez, pgpb 'nin büyüme veya davranışının7,8' deki yerli toprak bakterileri veya mantarları tarafından önlenmesi olabilir. Rizosfer 'de bakterilerin yararlı etkileri genellikle 1 bakteri yeteneğine bağlıdır) bulmak ve köküne doğru hareket, 2) biyofilm oluşumu ile kök kolonize, ve 3) küçük molekül üretimi ile ev sahibi bitki veya patojenler ile etkileşim metabolitler7,9. Bu kolonizasyon davranışları herhangi komşu mikropların varlığı ve aktivite etkilenebilir10.
Rizosfer 'de 'in bu farklı bakteriyel kolonizasyon aşamalarını ölçmek ve görselleştirecek bir sistem tasarladık (Şekil 1). Bu yaklaşım, uzun vadeli PGPB bakımının bazen bitkilerin önceden inoculated Fide dikimi sırasında olduğu gibi yeni ortamlar içine aktarılması sonrasında nasıl gözlemlendiği konusunda araştırmalar yapmayı kolaylaştıracaktır. Arabidopsis thaliana olarak laboratuvar çalışmalarında geniş kullanımı yanı sıra mikrobiyal etkileşimleri hakkında mevcut geniş veri nedeniyle bir bitki modeli olarak seçildi11. Sistemde üç aşama vardır: 1) A. thaliana büyüme, 2) bakteriyel kolonizasyon, ve 3) bakteriyel bakım (bkz. Şekil 1). Çünkü a. thaliana bir karasal bitki, bu Hydroponic sistemi12içinde gereksiz su stres acı olmadığını sağlamak için önemliydi. Haney ve el.13tarafından kullanılan yöntemlerden esinlenerek, fide sıvı büyüme ortamından çekimi ayırmak için plastik mesh üzerinde yetiştirilen. Bu sistem sağlık ve bitki Konağı gelişimi tehlikeye görünmüyor ve sıvı11 bir. thaliana büyüme geliştirir. Bitki çekimi yüzeyin üzerinde yüzen gibi, kökleri tamamen sıvı bakteriyel büyüme ortamına aşı bakteriler tarafından kolonizasyon maruz kalır. Bu ilgi bakteriler en büyüme için elverişli besin kolonizasyon için incelenmesini sağlar, daha sonra bitki büyüme desteklemek için tasarlanmış bir besin ortamında büyüyen devam etmek için koşullar değişen süre. Her iki aşamada da kök13kanda oksijen azlığı önlemek için sabit sallayarak içerir. Bakteriler, kolonizasyon ortamından veya bakım ortamına transfer edildikten sonra bitki köklerinden görüntülenebilir veya niceleyilebilir. Bu hidroponik sistem çok esnektir, deneysel koşullara izin verir ve uygulamalı stresler araştırmacılar ilgi alanlarına bağlı olarak kolayca değiştirilecektir.
Bu tanımlanan yöntem, bitki-mikrobe etkileşimleri hakkında literatürde daha büyük gövde bağlamında önemlidir, çünkü kök yüzeyinde bu etkileşimlerin incelenmesi için sağlam bir sistem sağlar, çünkü aynı zamanda büyüme tercihlerine göre özelleştirilebilir farklı bakteriler. Bitki biyoloji laboratuvarları genellikle katı agar bitki mikrobe kolonizasyon denemeleri gerçekleştirmek, sadece düzlemsel hareket için izin (Eğer bu) bakteri de sonraki transfer sırasında bitkilerin potansiyel olarak yıkıcı manipülasyon gerektirirken. Buna karşılık, Mikrobiyoloji laboratuvarları genellikle onların deneyler içinde bakterilerin sağlığını önceliklenmiş, bitkilerin zarar için14,15. Bitki ve Mikrobiyoloji odaklı laboratuvarlar bu farklı öncelikleri tarihsel zor bu gruplar arasında sonuçları karşılaştırmak için yapılmış, çünkü her genellikle ilgi organizmalarını optimize etmek için deneysel koşulları optimize15. Burada açıklanan yüzen Mesh-bitki-büyüme sistemi tam bitki dalgıç, önceki Mikrobiyoloji odaklı çalışmalar için önemli bir avantaj önler, aynı zamanda geçici kolonizasyon kolaylaştırmak için bakteri büyüme ve hayatta kalma optimize ederken. Böylece, biz burada mevcut tahlil her iki bitki biyologlar (aşırı hidrasyon ve bitki dokunsal manipülasyon hakkında) mikrobiyologlar kriterleri tatmin ederken (farklı bakteriyel büyüme koşulları ve birden fazla izin kaygıları adres olabilir tür etkileşimleri)7. Bu protokol çeşitli bakteriler, bitkiler ve çevresel koşullar ile kullanılmak üzere uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Required Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>1801343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeraseal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>BE255A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria of Interest</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stored at -80&#730;C in 40% glycerol preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BactoAgar</td>
			<td>BD</td>
			<td>2306428; REF 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bleach</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conviron</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 &#181;moles/m&#178;/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21&#730;C, with inner power outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator Jar: glass or heavy plastic</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flame</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>At optimal temperature for growth of specified bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox LB Broth</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetters</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Volumes 5 &#181;L to 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (preferably fluorescence)</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Could be light if best definition not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Salts + MES</td>
			<td>RPI</td>
			<td>M70300-50.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Plate Shaker</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL total volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reservoirs</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Hole Punch</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Approximately 7mm punch diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>MMM1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Mesh</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1100t41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>x4281c</td>
			<td>other vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suggested Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Prong Ultrasonicator attachment</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For sonicating multiple samples at once. Can be done individually</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumaseal II</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>FE124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipetter/Repetter</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well plates</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Materials Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana seeds</td>
			<td>any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arthrobacter nicotinovorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curtobacterium oceanosedimentum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbacterium oleivorans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Levy, et al. 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas simiae WCS417r</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring bacterial colonization and maintenance on arabidopsis thaliana roots in a floating hydroponic system

Bakteriler, etkileşen mikroplar, daha büyük organizmalar ve Abiotik çevre ile şekillendirilen kompleks rizosfer 'de microbiomes oluşturur. Laboratuvar koşullarında, bitki büyüme teşvik bakteri (pgpb) tarafından rizosfer 'de kolonizasyon sağlığını veya kolonize bitkiler göreli ev sahibi bitkilerin gelişimini artırabilir. Ancak, alan ayarlarında, PGPB ile bakteriyel tedaviler genellikle bitkileri için önemli faydalar sağlamaz. Bir açıklama bu bitki ömrü boyunca endojen toprak mikroplar ile etkileşimler sırasında PGPB kaybı nedeniyle olabilir olmasıdır. Bu olasılık, çoğu çalışmada rizosfer 'de topluluklar içinde pgpb bakım yerine ilk kolonizasyon odaklanmak beri, onaylamak zor olmuştur. Burada hipotez, montaj, birlikte olma ve bakteriyel toplulukların Bakımı rizosfer 'de mikroortamın deterministic özellikleri ile şekillendirilir ve bu etkileşimlerin yerel ayarlarında pgpb hayatta kalma etkileyebilir. Bu davranışları incelemek için, bir hidroponik bitki büyüme tahlil ölçmek ve bitki kökleri ilk kolonizasyon sırasında bakterilerin uzamsal dağılımı görselleştirmek ve farklı büyüme transfer sonra Arabidopsis thaliana kullanılarak optimize edilmiştir Ortam. Bu sistemin yeniden üretilebilirliği ve yarar daha sonra iyi okudu PGPB Pseudomonas simiaeile doğrulanır. Birden fazla bakteriyel türün varlığının bitki kökü üzerinde kolonizasyon ve bakım dinamiklerini nasıl etkileyebileceğini araştırmak için, üç bakteriyel sudan bir model topluluğu (bir Arthrobacter, Curtobacteriumve microbacterium türleri) aslen A. thaliana rizosfer 'de 'den izole edilmiştir. Bu farklı bakteriyel türlerin varlığı bu Hidroponik bitki-bakım tahlil kullanılarak ölçülebilir gösterilmiştir, hangi sıralama tabanlı bakteriyel toplum çalışmaları için bir alternatif sağlar. Bu sistemi kullanarak gelecekteki çalışmalar multispecies bitki mikrobiomes zaman içinde ve değişen çevresel koşullarda bakteriyel davranışlar anlayışını artırabilir.

İyi karakterize PGPB P. simiae WCS417r hidroponik kültürde A. thaliana kökleri kolonize bilinmektedir. Bu doğal floresan bakterisi, kolonizasyon sonrasında fidanların kökleri üzerindeki mikroskobik kullanarak kolayca görselleştirilebilir (Şekil 2). Bu a. thaliana fide ' (4 – 6 mm uzunluğunda) köklerinin tam uzunluğu görüntü mümkün olmasına rağmen, birçok bitki için bunu yaparken zaman yasak bir miktar alaca...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System at JoVE.com

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Burada bir hidroponik bitki büyüme tahlil türler varlığı ölçmek ve bitki kökleri ilk kolonizasyon ve farklı büyüme ortamları içine transfer edildikten sonra bakterilerin uzamsal dağılımı görselleştirmek için açıklanmaktadır.

Yüzen hidroponik sistemde Arabidopsis thaliana kökleri üzerinde bakteriyel kolonizasyon ve bakım izleme

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Çoğu deney kolonizasyona odaklanarak bitki-mikrop etkileşimlerini inceler, ancak protokolümüz kökteki bakterilerin hem kolonizasyonuna hem de bakımına bakmak için tasarlanmıştır. Deneyi farklı bakteri ve bitkilere uyacak şekilde değiştirebiliriz ve hatta her 24 kuyuluk tabakta birden fazla bakteriyi test edebiliriz. Başlamak için, plastik örgü diskleri oluşturmak için standart bir delik zımba kullanın.Bir cam kapta diskleri toplamak ve gevşek kapağı. 20 dakikalık kuru bir döngü ye ayarlanmış bir otoklav kullanarak sterilize edin. Daha önce hazırlanmış bitki büyüme orta agar plaka yüzeyinde tek bir tabaka içinde yaklaşık 40 steril örgü diskler dağıtmak için alev sterilize cımbız kullanın.Her kafesin ortasına önceden sterilize edilmiş iki tohum yerleştirin. Tabağı cerrahi bantla kapatın ve tohumları eritmek için karanlıkta dört derece lik bir sıcaklıkta 2-6 gün kuluçkaya yat. Daha sonra, çimlenme ve fide büyümek için 21 santigrat derece ve 15 saat karanlık 15 saat ışık dokuz saat kısa gün ayarları altında sekiz ila 10 gün boyunca bir bitki büyüme odasında aşağı plaka agar tarafı yerleştirin.Steril 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya bir mililitre bakteri büyüme ortamı ekleyin. Mesh gömülü çimlenmiş fideaktarmak için, yavaşça iki çimlenmiş içeren örgü soymak için alev steril leştirilmiş çiflikler kullanın, eşit büyüklükte, ve zarar görmemiş fideler yukarı ve agar plaka kapalı. Bir float ile fide ile bakteriyel büyüme sıvı her kuyuya, kök tarafı aşağı aktarın.Daha sonra, sıvı bakteri büyüme orta agar plakaları üzerinde bir gecede yetiştirilen bakterileri resuspend. Her kuyuya 10 mikrolitre bakteriyel süspansiyon ekleyin, sadece medya kontrol kuyuları hariç, her kuyuda bir milyon koloni oluşturan bakteri birimlerinin son konsantrasyonu için. Plakayı steril büyüme için mühürlemek için, yapışkan tarafa dokunmadan gaz geçirilebilir filmi plaka boyunca dikkatlice bastırın.Her kuyunun ayrı ayrı mühürlenmiş olduğundan emin olmak için kuyular tarafından yapılan halkaların her birinin etrafına basınç uygulayın. Daha sonra, gaz geçirilebilir film üzerinde snuggly plastik kapağı ile plaka kapatın. 220 rpm olarak ayarlanmış bir yörünge plaka shaker bir bitki büyüme odasına plaka yerleştirin ve fideler başlangıçta çimlenmiş olduğu gibi aynı koşullar altında 18 saat kuluçka.Tüm bitkileri ile yüzer durulamak için, yeni bir 24-well plaka her kuyuya steril su bir mililitre ekleyin. Bitkilerle birlikte plakadan gaz geçirilebilir filmi çıkarın ve su ile kuyulara yüzen aktarmak için steril forseps kullanın ve ajitasyon olmadan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Daha sonra, bitki büyüme orta bir mililitre ile yeni bir 24-well plaka her kuyu doldurun.Her kuyuya bir örgü aktarın ve gaz geçirilebilir bir mühürle kaplayın. Bitki büyüme odasında 220 rpm orbital plaka shaker üzerinde 72 saat kuluçka. Kuluçkadan sonra, daha önce yapıldığı gibi bitkileri durula.Duruladıktan sonra, kafesin yaprak tarafındaki yaprakların altına alevle sterilize edilmiş ençeleri yavaşça yerleştirerek fideleri örgüden çıkarın. Sapı hafifçe çimdikle ve fideleri kırmadan kökü yerinden çıkarmak için örgüden yukarı ve uzağa doğru çekin. Bitki köklerinden bakterileri uzaklaştırmak için, her bir kafesten fidelerin bir mililitre çift distile su içeren 24 kuyuluk bir sonication plakasının ayrı kuyularına aktarılması.El yazmasında açıklandığı gibi çok yönlü bir sonicator kullanarak plaka içindeki tüm örnekleri aynı anda sonicate. Bakterileri ölçmek için, bakteri büyüme ortamında sonicated örneklerinin seri 10 kat seyreltme gerçekleştirin. Steril cam boncuklar kullanarak yayılır ve tek tek koloniler sayılabilir olana kadar bakteriler için en uygun sıcaklıkta kuluçkaya yat.Bozulmamış bitki kökü toplamak için, örgü fideler kaldırmak için forceps kullanın. Daha sonra, her bitkiyi kökün ucunu slayta yerleştirerek ve uçtan uzağa sürükleyerek slaytla çekimi aşağı doğru ayarlayarak en iyi görüntüleme için düzleştirilmiş bir kök sağlayarak bir mikroskop slaytına aktarın. Kapaklar ve slaytlar arasındaki arayüzleri nemlendirmek için her numuneye bir damla su veya steril bitki büyüme ortamı ekleyin.Kapak kaymasının eğimini önlemek için kök taç ve sürgün yapraklarının altına cam bir kapak kaydırın ve hafifçe bastırın. Daha sonra, bakterileri birbirinden ve bitki kökünden ayırt etmek için uygun uyarma/emisyon filtrelerini kullanarak bakterileri görüntüleyin. Pseudomonas simiae, doğal floresan bakteri, kolonize Arabidopsis thaliana kökleri ve bitki büyüme ortamınakil aşağıdaki kök üzerinde muhafaza edildi.Kök taç, orta uzunlukta, ve ucu Pseudomonas simiae kolonizasyonu nedeniyle floresan göstermektedir. No-bakteri negatif kontrol hiçbir kolonizasyon gösterdi. Arabidopsis thaliana köklerindeki Pseudomonas simiae'si 18 saatlik kolonizasyon veya 72 saatlik bakımdan sonra ölçüldüğünde, her iki zaman noktasında da fide başına koloni oluşturan birimlerin toplam sayısı farklı günlerde yapılan biyolojik kopyalar arasında iyi bir tekrarlanabilirlik göstermiştir.Bakım aşamasında 72 saat sonra fidan başına koloni oluşturan birimlerin sayısında bir artış yaşandı, kolonizasyon sonrası 18 saatlik zaman diliminde gözlenen sayılarla karşılaştırıldığında, bitki kökündeki kolonileşmiş bakterilerin aktif büyümesi bakım aşamasında meydana geldi. Laboratuvar koşullarında doğal toprakta yetişen Arabidopsis thaliana'dan izole edilen üç bakteri türü, bitki kökleri üzerinde birden fazla türün ilişkisini izlemek için kullanılmıştır. Koloni morfolojisi ve rengindeki farklılıklar nedeniyle X-gal içeren medyada açıkça ayırt edildiler ve bu da çok türlü bir kültürde bile antibiyotik seçimi olmaksızın her türün fidebaşına koloni oluşturan birimlerin saymasına olanak sağladı.Bu üç bakteri türünün hepsi tek başına ya da bakteri kokültüründe kolonize edildi ve köküzerinde muhafaza edildi. Her tür farklı biyolojik ve teknik kopyalar arasında benzer eğilimler göstererek, bu protokolün her türün kökü başına göreceli veya toplam koloni oluşturan birimleri ölçmek için kullanılabileceğini göstermiştir. Tek başına yetiştirildiğinde, hiçbir tür bakım aşamasında bollukta önemli bir artış göstermedi, ancak birleşik toplumun kökü başına genel koloni oluşturan birimler, bu bakterilerin diğer suşların kolonizasyonunu yasaklamadığını göstererek, ortak kültürlerde arttı.En zor adımlar, kafes disklerinden sağlam bitkilerin kaldırılmasını gerektiren adımlardır. Sabırlı ve nazik olmak bunu mümkün kılar. Bakteri hücreleri floresan ise, örnekler hücrelerin göreli sayısını belirlemek için akış sitometri tarafından sıralanmış olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Immünkompetan Fare Seröz Yumurtalık Kanseri bir Ortotopik Model In vivo</emTümör Bağışıklık Yanıtları> Tümör Görüntüleme ve İzleme

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...