Name: atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af fakultetet mangfoldighed Scholars Award fra University of Massachusetts Medical School til T.P.-B. N.N.-T. understøttes af SEP-CONACYT, tilskud 279879. J. G. N støttes af National Science Foundation Grant DBI 0959476. Forfatterne er taknemmelige for Dr. Daryl A. Bosco for at levere N2A celle linjen og til Daniella Cangussu for hendes tekniske support.

1. mammale cellekultur
<ol><li>Generelle betragtninger
	<ol>
<li>Følg de aseptiske teknikker for pattedyr cellekultur, der tidligere gennemgik38.</li>
		<li>Vedligehold alle cellelinjer i en befuret 5% CO2 -inkubator ved 37 °c. Celle dyrkningsbetingelserne varierer for hver celletype. Det er vigtigt at opretholde passende dyrkningsbetingelser for hver cellelinje, der anvendes, da variationer af disse procedurer vil føre til afvigende fænotyper og svigt i cellekult...

Atomabsorptionsspektroskopi er en meget følsom metode til bestemmelse af Zn i små mængder/masse biologiske prøver. Den beskrevne optimering af Zn måling gør anvendelsen af denne metode enkel og garanterer ideelle analytiske betingelser. Her, ved hjælp af GF-AAS, vi bestemt koncentrationen af Zn i hele celler, og i cytosoliske og nukleare fraktioner, fra forskellige cellelinjer. Resultaterne viser, at denne teknik kan sammenlignes med den, der opnås ved fluorescerende sonder og ICP-MS. For eksempel, flere fluoresc...

Overgang og tungmetaller, såsom Zn, cu, MN, og fe, findes naturligt i miljøet i både næringsstoffer i fødevarer og forurenende stoffer. Alle levende organismer kræver forskellige mængder af disse mikronæringsstoffer; eksponering for høje niveauer er imidlertid skadelig for organismer. Metal erhvervelse er hovedsageligt gennem kosten, men metaller kan også inhaleres eller absorberes gennem huden1,2,3,4,5. Det er vigtigt at bemærke, at tilstedeværelsen af metaller i atmosfæriske partikler er stigende og har været i vid udstrækning forbundet med sundhedsrisici. På grund af menneskeskabte aktiviteter er der påvist forhøjede niveauer af tungmetaller såsom AG, AS, cd, CR, HG, ni, fe og PB i atmosfæriske partikler, regnvand og jord6,7. Disse metaller har potentialet til at konkurrere med essentielle fysiologiske sporstoffer, især Zn og fe, og de fremkalder toksiske virkninger ved at inaktivere grundlæggende enzymer til biologiske processer.
Sporstoffet Zn er Redox neutral og opfører sig som en Lewis syre i biologiske reaktioner, hvilket gør det til en grundlæggende cofaktor nødvendig for proteinfoldning og katalytisk aktivitet i over 10% af pattedyrsproteiner8,9, 10og Bull. Derfor er det afgørende for forskellige fysiologiske funktioner8,11. Men ligesom mange sporstoffer, der er en hårfin balance mellem disse metaller letter normale fysiologiske funktion og forårsager toksicitet. I pattedyr, Zn mangler føre til anæmi, vækstretardering, hypogonadisme, hud abnormiteter, diarré, alopeci, smagsforstyrrelser, kronisk betændelse, og svækket immun og neurologiske funktioner11,12, 13,14,15,16,17,18. Overskydende, Zn er cytotoksisk og svækker absorptionen af andre essentielle metaller som kobber19,20,21.
Derudover, nogle metaller som cu og fe har potentiale til at deltage i skadelige reaktioner. Produktion af reaktive oxygenarter (ros) via Fenton Chemistry kan forstyrre samlingen af jern svovl klynge proteiner og ændre lipid metabolisme22,23,24. For at forhindre denne skade, celler udnytter metal-bindende chaperoner og transportører for at forhindre toksiske virkninger. Utvivlsomt, metal homøostase skal være stramt kontrolleret for at sikre, at specifikke celletyper opretholde passende niveauer af metaller. Af denne grund er der et betydeligt behov for at fremme teknikker til nøjagtig måling af spormetaller i biologiske prøver. I udviklings-og modne organismer findes der et differentieret biologisk behov for sporstoffer på celleniveau, på forskellige udviklingsstadier og under normale og patologiske forhold. Derfor er præcis bestemmelse af væv og systemiske metal niveauer er nødvendig for at forstå organismal metal homøostase.
Grafit ovn atomabsorptionsspektrometri (GF-AAS) er en meget følsom teknik, der anvendes til små prøvevolumener, hvilket gør den ideel til at måle overgang og tungmetaller til stede i biologiske og miljømæssige prøver25,26 , 27 stk. , 28. på grund af teknikkens høje følsomhed har det desuden vist sig at være hensigtsmæssigt at studere de fine transport egenskaber for Na+/K+-ATPase og gastrisk H+/k+-ATPase ved hjælp af xenopus oocytter som modelsystem29. I GF-AAS absorberer de forzinkede elementer i en prøve en bølgelængde af stråling, der udsendes af en lyskilde, der indeholder det metalliske stof, med den absorberede stråling proportional med koncentrationen af elementet. Elementært elektronisk excitation finder sted ved absorption af ultraviolet eller synlig stråling i en kvantiseret proces, der er unik for hvert kemisk element. I en enkelt elektron proces involverer optagelsen af en fotoner en elektron, der bevæger sig fra et lavere energi niveau til et højere niveau inden for atomet, og GF-AAS afgør, hvor meget fotoner der absorberes af prøven, hvilket er proportionalt med antallet af strålings absorberende elementer forstøvet i grafit røret.
Selektiviteten af denne teknik afhænger af den elektroniske struktur af atomerne, hvor hvert element har en specifik absorption/emission spektrallinje. For Zn er absorbansbølgelængden 213,9 nm og kan skelnes nøjagtigt fra andre metaller. Generelt kan GF-AAS anvendes til at kvantificere Zn med passende detektionsgrænser (LOD) og høj følsomhed og selektivitet25. Ændringerne i absorberet bølgelængde er integreret og præsenteret som toppe af energi absorption på specifikke og isolerede bølgelængder. Koncentrationen af Zn i en given prøve beregnes sædvanligvis ud fra en standardkurve med kendte koncentrationer i henhold til øl-Lambert-loven, hvor absorbansen er direkte proportional med koncentrationen af Zn i prøven. Men, anvendelse af Beer-Lambert ligning til GF-AAS analyser også præsenterer nogle komplikationer. For eksempel kan variationer i forstøvning og/eller ikke-homogene koncentrationer af prøverne påvirke metal målingerne.
Metal forstøvning kræves for GF AAS Trace elementært analyse består af tre grundlæggende trin. Det første skridt er desolvation, hvor det flydende opløsningsmiddel er fordampet; forlader tørre forbindelser efter ovnen når en temperatur på omkring 100 °C. Derefter, stofferne er fordampet ved opvarmning dem fra 800 til 1.400 °C (afhængigt af det element, der skal analyseres) og blive en gas. Endelig, de forbindelser i gasformige tilstand er forstøvet med temperaturer, der spænder fra 1.500 til 2.500 °C. Som nævnt ovenfor, stigende koncentrationer af et metal af interesse vil gøre proportionale stigninger på absorptionen detekteret af GF-AAS, men ovnen reducerer den dynamiske vifte af analyse, som er den arbejds række af koncentrationer, der kan være bestemmes af instrumentet. Således, teknikken kræver lave koncentrationer og en omhyggelig bestemmelse af det dynamiske område af metoden ved at bestemme LOD og grænse for linearitet (LOL) af øl-Lambert lov. LOD er den minimumsmængde, der kræves for et stof, der skal påvises, defineret som tre gange standardafvigelsen for Zn i matrixen. LOL er den maksimale koncentration, der kan påvises ved hjælp af øl-Lambert lov.
I dette arbejde, beskriver vi en standardmetode til at analysere niveauerne af Zn i hele celleekstrakter, cytoplasmatiske og nukleare fraktioner, og i prolifererende og differentiere kultiverede celler (figur 1). Vi tilpassede den hurtige isolation af kerner-protokollen til forskellige cellulære systemer for at forhindre metaltab under prøveforberedelse. De anvendte cellulære modeller var primære myoblaster afledt af mus satellit celler, murine neuroblastom celler (N2A eller Neuro2A), murine 3T3 L1 adipocytter, en human ikke-tumorigen bryst epitelial cellelinje (MCF10A), og epitelial Madin-Darby canine nyre ( MDCK-celler). Disse celler blev etableret fra forskellige slægter og er gode modeller til undersøgelse af Lineage specifikke variationer af metal niveauer in vitro.
Primære myoblaster afledt af mus satellit celler udgør en velegnet in vitro model til at undersøge skeletmuskulatur differentiering. Proliferation af disse celler er hurtig, når de dyrkes under høje serum betingelser. Differentiering i den muskulære Lineage er derefter induceret af lave serum betingelser30. Den murine neuroblastom (N2A) etablerede cellelinje blev afledt fra musen neurale crest. Disse celler præsenterer neuronal og amøboid stamcelle morfologi. Ved differentiering stimulus, de N2A celler præsentere flere egenskaber af neuroner, såsom Neuro filamenter. N2A celler bruges til at undersøge Alzheimers sygdom, neurite outgrowth, og neurotoksicitet31,32,33. 3T3-L1 murine præ-adipocytter etablerede cellelinje er almindeligt anvendt til at undersøge de metaboliske og fysiologiske ændringer forbundet med adipogenesis. Disse celler præsenterer en fibroblast-lignende morfologi, men når stimuleret til differentiering, de præsenterer enzymatisk aktivering forbundet med lipid syntese og triglycerider ophobning. Dette kan observeres som morfologiske ændringer for at producere cytoplasmatiske lipid dråber34,35. MCF10A er en ikke-tumor bryst epitelial cellelinje afledt af en præmenopausal kvinde med bryst fibrocystisk sygdom36. Det har været almindeligt anvendt til biokemiske, molekylære, og cellulære undersøgelser relateret til bryst carcinogenese såsom proliferation, celle migration, og invasion. Den Madin-Darby canine nyre (MDCK) epitelial cellelinje er blevet flittigt anvendt til at undersøge de egenskaber og molekylære hændelser i forbindelse med etableringen af epitelial fænotype. Ved at nå sammenløbet, disse celler bliver polariseret og etablere celle-celle klæbestoffer, karakteristika af pattedyr epitelial væv37.
For at teste AAS evne til at måle niveauerne af Zn i pattedyrceller, vi analyserede hele og subcellulære fraktioner (cytosol og kerne) af disse fem cellelinjer. AAS målinger viste forskellige koncentrationer af Zn i disse celletyper. Koncentrationerne var lavere i prolifererende og differentierende primære myoblaster (4 til 7 nmol/mg protein) og højere i de fire etablerede cellelinjer (fra 20 til 40 nmol/mg protein). En lille ikke-signifikant stigning i Zn niveauer blev påvist i differentiere primære myoblaster og neuroblastom celler sammenlignet med prolifererende celler. Den modsatte effekt blev påvist i differentierede adipocytter. Men, prolifererende 3T3-L1-celler udstillet højere koncentrationer af metallet i forhold til differentierede celler. Vigtigt, i disse tre cellelinjer, subcellulær fraktionering viste, at Zn er differentielt fordelt i cytosol og kerne i henhold til den metaboliske tilstand af disse celler. For eksempel, i prolifererende myoblaster, N2A celler, og 3T3-L1 præ-adipocytter, et flertal af metallet er lokaliseret til kernen. Ved induktion af differentiering ved hjælp af specifikke celle behandlinger, Zn lokaliseret til cytosol i disse tre celletyper. Interessant, begge epitel cellelinjer viste højere niveauer af Zn under proliferation i forhold til når man når sammenløbet, hvor en karakteristisk stram enkeltlags blev dannet. I prolifererende epitelceller, bryst cellelinje MCF10A havde en ligelig Zn fordeling mellem cytosol og kerne, mens i den nyre-afledte cellelinje, det meste af metallet var placeret i kernen. I disse to celletyper, når cellerne nåede sammenløbet, Zn var fortrinsvis placeret til cytosol. Disse resultater viser, at GF-AAS er en meget følsom og præcis teknik til udførelse af elementært analyse i lav-udbytte prøver. GF-AAS kombineret med subcellulær fraktionering og kan tilpasses til at undersøge niveauerne af spor metal elementer i forskellige cellelinjer og væv.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1005706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brg1-antibody (G7)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnologies</td>
			<td>sc-17796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti b-tubulin-antibody (BT7R)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-16308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidemal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>51300044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid (HNO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM (Reduced Serum Media)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol (Collagen)</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retionic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648469-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 &#181;g/mL, 2% HNO3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Established Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3-L1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CL-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDK</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Absortion spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Aanalyst 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagnode</td>
			<td>UCD-200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells

Overgangsmetaller er essentielle mikronæringsstoffer for organismer, men kan være giftige for celler ved høje koncentrationer ved at konkurrere med fysiologiske metaller i proteiner og generere redox stress. Patologiske tilstande, der fører til metaldepletering eller akkumulering, er kausale agenser af forskellige sygdomme hos mennesker. Nogle eksempler omfatter anæmi, acrodermatitis enteropatiica, og Wilson's og Menkes ' sygdomme. Det er derfor vigtigt at kunne måle niveauerne og transporten af overgangsmetaller i biologiske prøver med høj følsomhed og nøjagtighed for at gøre det lettere at forske i, hvordan disse elementer bidrager til normale fysiologiske funktioner og Toksicitet. Zink (Zn), for eksempel, er en cofaktor i mange pattedyr proteiner, deltager i signalering begivenheder, og er en sekundær budbringer i celler. Overskydende, Zn er giftigt og kan hæmme absorption af andre metaller, mens i underskud, det kan føre til en række potentielt dødbringende betingelser.

Grafit ovn atomabsorptionsspektroskopi (GF-AAS) giver en meget følsom og effektiv metode til bestemmelse af Zn og andre Overgangsmetal koncentrationer i forskellige biologiske prøver. Elektro termisk forstøvning via GF-AAS kvantificerer metaller ved at forstøvning små mængder af prøver til efterfølgende selektiv absorption analyse ved hjælp af bølgelængde af excitation af elementet af interesse. Inden for grænserne af linearitet af øl-Lambert lov, absorbans af lys af metallet er direkte proportional med koncentrationen af analysand. Sammenlignet med andre metoder til bestemmelse af Zn-indhold registrerer GF-AAS både fri og kompleks bundet Zn i proteiner og muligvis i små intracellulære molekyler med høj følsomhed i små prøvevolumener. Desuden er GF-AAS også lettere tilgængelig end Induktivt koblet plasma massespektrometri (ICP-MS) eller synkrotron-baseret røntgen fluorescens. Ved denne metode beskrives den systematiske prøveforberedelse af forskellige dyrkede cellelinjer til analyser i en GF-AAS. Variationer i dette sporstof blev sammenlignet i både hele celle lysater og subcellulære fraktioner af prolifererende og differentierede celler som bevis for princippet.

Vi testede GF-AAS ' evne til at detektere minut niveauer af Zn i pattedyrsceller (figur 1). Således dyrkede vi primære myoblaster afledt af mus satellit celler, og de etablerede cellelinjer N2A (neuroblastoma afledt), 3T3 L1 (adipocytter), MCF10A (bryst epithelium), og MDCK celler (hund nyre epithelium). Først isolerede vi hele celle, cytosolic, og nukleare fraktioner af alle disse celletyper og evalueret renheden af fraktioner af vestlige blot (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomabsorptionsspektroskopi til måling af intracellulære zink puljer i pattedyrsceller

Dyrkede primære eller etablerede cellelinjer anvendes almindeligvis til at behandle grundlæggende biologiske og mekanistiske spørgsmål som en indledende tilgang, før der anvendes dyremodeller. Denne protokol beskriver, hvordan man forbereder hele celleekstrakter og subcellulære fraktioner til undersøgelser af zink (Zn) og andre sporstoffer med atomabsorptionsspektroskopi.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Overgangsmetallens rolle i udviklingen af pattedyr undervurderes i vid udstrækning. Nye beviser viser, at metal homøostase fortsætter med at ændre sig i henhold til udviklingsstadiet af celler og væv. Desuden er de specifikke cellulære destinationer af metaller også sort i udvikling, og selvfølgelig er det udfordrende at identificere deres placering.Til dato er der udviklet forskellige analyseteknikker til kvantificering af metaller, men de fleste er dyre eller utilgængelige. Intensiv forskning er fokuseret på at forbedre metalbestemmelser på en mere tilgængelig og effektiv måde. Grafit ovn atomabsorptionsspektroskopi, GF-AAS, har to største fordele.Det giver lave grænser for påvisning for zink, giver mulighed for nøjagtig spor zink analyse. Det er også en teknik, der ikke kræver store mængder af prøven, mikroliter af opløsning tendens til at være nok til at udføre analysen. Kombinationen af disse to fordele gør GF-AAS ideel til at analysere sporstoffer i prøver med lav volumen.Flere menneskelige patologiske tilstande er relateret til metal fejlbalancer. Nogle eksempler er anæmi, acrodermatitis enteropathica, og Wilson's og Menkes'sygdomme. Derfor er det vigtigt at udvikle effektive og pålidelige metoder til at måle niveauet af overgangsmetaller i biologiske prøver med høj følsomhed og nøjagtighed.GF-AAS er et glimrende eksempel på en teknologi, der letter en bestemmelse af et givet metal under normale fysiologiske forhold og i patogene tilfælde. Metoden er meget alsidig. Det kan anvendes på mange systemer og mange elementer kan analysere ved hjælp af GF-AAS.Udfordringerne er at fastsætte metodegrænsen for detektion i virkeligheden, at sikre, at prøverne falder inden for denne grænse. I betragtning af, at mængden af prøver er lav, er der ikke meget plads til test, så omhyggeligt undersøgelse af data skal finde sted siden begyndelsen. Efter den første analyse af prøver, er vi nødt til at fastslå, hvad er fortynding faktor er nødvendig for at bringe prøverne til de grænser, der kræves for kvantificering.Sørg for, at du er i stand til at fraktionere kernerne korrekt, før du går til AAS. Western blots er altid god validering forud for den spektroskopiske analyse. Mens GF-AAS kræver små mængder, er intracellulære puljer allerede i små mængder.Det giver ikke meget plads til test. De første målinger skal omhyggeligt udføres og undersøges, så prøvebehandlingen kan minimeres til blot én fortyndingsfaktor. Til at begynde, kultur celler af interesse i 55 kvadratcentimeter plader.Brug en vakuumfælde til at aspirere kulturmediet. Sørg for at fjerne alle spor af medier. Brug iskold PBS fri for calcium og magnesium til at skylle cellerne fra de ønskede tidspunkter, eller kultur betingelser, tre gange.Derefter tilsættes en milliliter iskold PBS til pladen, og skrab cellerne af pladen. Overfør cellesuspensionerne til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og hold det på is. Centrifuge i 10 sekunder ved 10,000 gange G, og fjern supernatanten ved aspiration.Hvis der ønskes metalanalyse af cytoplasmatiske og nukleare fraktioner, skal cellepellet opslænges igen i 400 mikroliter iskold PBS indeholdende 0,1% NP-40, et ikke-ionisk rengøringsmiddel. Overfør 100 mikroliter til et nyt mikrocentrifugerør som hele celleprøven, og opbevar det ved minus 20 grader celsius. For at isolere kerner skal du bruge en P1000 mikropipettespids til at pipette 400 mikrolitercelleophænget op og ned fem til 10 gange på is.Derefter udtrække fem mikroliter af cellen suspension og overføre det til et mikroskop glas dias. Placer de fem mikroliter under et let mikroskop ved hjælp af en 40 gange målsætning for at kontrollere kernerintegriteten. Centrifuge de resterende 395 mikroliter celle lysat suspension i 10 sekunder ved 10, 000 gange G.Overfør supernatant, der indeholder den cykliske fraktion til en ny mikrocentrifuge rør.Dernæst tilsættes 500 mikroliter af PBS indeholder 0,1% NP-40 for at skylle pellet med den nukleare fraktion, og centrifuge i 10 sekunder ved 10, 000 gange G.Fjern supernatant, og resuspend pellet indeholder kernen i 100 mikroliter af samme opløsning. For at lyse cellerne skal du bruge en Bioruptor til at sonikere hele cellen og kerner, der indeholder opløsningen tre gange, hver i fem minutter. Fortsæt med at udføre kvalitetskontrol af fraktionernes renhed ved western blot ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for enten de nukleare eller cykliske fraktioner.Først tilsættes et tilsvarende volumen af koncentreret salpetersyre af spormetalkvalitet til hele cellen, cytoplasmatiske og nukleare fraktioner, der indeholder 100, 500 og 100 mikroliter celleaffjedring i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og læg dem i en termisk blok ved 80 grader celsius for at mineralisere cellekulturen i en time. Derefter skal du tage rørene ud af den termiske blok og placere dem i et stativ for at fortsætte syrefordøjelsen natten over ved 20 grader celsius. Reaktionen standses ved at tilsætte 30 % af prøvemængden af hydrogenperoxid.Skærfet bringes op på 500 mikroliter med 18 mega Ohm renset vand. Dernæst i en 15 milliliter Falcon rør fortyndet analytisk kvalitet standard nitrogenoxid i renset vand ved 18 mega Ohms at forberede to volumen procent salpetersyre opløsning som den tomme opløsning under kalibrering. Brug derefter den to volumen procent salpetersyre opløsning til at fortynde en kommercielt tilgængelig 1, 000 ppm zink lager opløsning med en koncentration på 1, 000 dele per milliard.Forbered arbejdsstandardløsninger fra 1.000 del pr. million zinkstandardopløsning, 1.000-delen pr. milliard opløsning, og fortynd den derefter til 5, 8, 10, 15, 20 og 25 ppb direkte med 2 volumensyreopløsning. Placer en milliliter 0,1% magnesium nitrat matrix modifikator i polypropylen prøve kopper, og derefter indlæse kopper i autosampler karrusel. Programmer atomabsorptionsspektrometeret til automatisk at tilsætte fem mikroliter af matrixmodifikatoren til zinkstandarderne og tomen.Indstil den samme optimerede tilstand på atomabsorptionsspektrometeret for standardopløsningerne og prøverne med indføringsstrømningshastigheden på 250 milliliter pr. minut, indsprøjtningstemperatur ved 20 grader celsius og grafitovnstemperatur på 1,800 grader celsius i firetrinsprocesser. Alle standarder og prøver af et enkelt eksperiment bør måles samtidig for at undgå fejl som følge af kalibreringsforskelle eller fordampning. Optimer lampen C-HCL til en strøm på 20 ampere, bølgelængde på 213,9 nanometer, og slids af 0,7 nanometer.Pipette prøverne i polypropylenprøvekopper, og læg dem i autosamplerkarrusellen. Den nedre grænse for påvisning af zink er 0,01 dele pr. milliard. Ved at øge koncentrationen af standarderne bestemmes den øvre grænse for påvisning af zink til 20 dele pr. milliard.Når der er opnået en zinkstandardkurve, måles de mineraliserede prøver for at bestemme metalindholdet. Hvis de opnåede data ligger over detektionsgrænsen, fortyndes prøverne med 18 mega Ohm renset vand behandlet med 0,1% analytisk stamsyre. I denne hurtige isolering af kerner protokol, en repræsentativ vestlige skamplet fra differentiere primære myoblaster viser renheden af subcellulære fraktioner.Kromatin remodeler enzymet Brg1 blev brugt til at identificere den nukleare fraktion, og tubulin blev brugt til at identificere den cykliske fraktion. Denne figur viser repræsentative lys mikrografer til prolifererende og differentierede eller sammenløbet monolag af hver celletype, og det tilsvarende zinkindhold i hele celleekstrakter, cykliske og nukleare fraktioner. Alle de cellelinjer, der blev analyseret i denne undersøgelse, viste zinkkoncentrationer i nanomolarområdet.Differentierede primære myorør udviste højere niveauer af zink end prolifererende celler. En lignende subcellulær fordeling af zink blev påvist i den neuroblastom afledte cellelinje N2A. På den anden side udviste den etablerede 3T3-L1 cellelinje højere niveauer af zink, når præ-adipocytterne blev prolifereret, end da de blev induceret eller differentieret.MCF10A celler viste lige niveauer af zink mellem cykliske og nukleare fraktioner i prolifererende celler. Når MCF10A celler nå sammenløb, en 40% fald i hele celle zink niveauer blev opdaget, og metallet blev anset for at være mest koncentreret i den cykliske fraktion. Grafitovns atomabsorptionsspektrometri er en meget følsom teknik til måling af overgang og tungmetaller i biologiske og miljømæssige prøver.Der skal være særlig omhu og renlighed ved fremstillingen af delcellulære fraktioner, da minimal kontaminering sandsynligvis vil forstyrre analysen på grund af udstyrets følsomhed. I betragtning af de lave mængder og sporniveauer af metaller i hvert forsøg, er det vanskeligt at tænke på en bedre og mere præcis teknik til at måle zink end GF-AAS. Der er ingen aktuelle teknikker, der kan give grænserne for detektion og lav volumen, der kræves til de relativt lave omkostninger ved GF-AAS.Grafitovns atomabsorptionsspektrometri er nøjagtig, følsom, omkostningseffektiv og tilgængelig. Denne analytiske teknik vil fortsætte med at blive forbedret, efterhånden som elementærdetektionsteknologierne fortsætter med at udvikle sig. Den fremtidige anvendelse til påvisning af zink og andre metaller fra GF-AAS vil omfatte organer, væv fra dyremodeller og biopsier fra patienter med sygdomme i forbindelse med systemiske metalubalancer.Salpetersyre er en ekstremt ætsende syre, der kan forårsage alvorlige kemiske forbrændinger meget hurtigt. Dette kemikalie kan også reagere voldsomt med visse forbindelser såsom metallisk pulvere. På grund af faren ved salpetersyre, er det vigtigt at træffe strenge sikkerhedsforanstaltninger, når håndtering salpetersyre.Ved håndtering af salpetersyre anbefaler vi på det kraftigste, at du bruger sikkerhedskemiske briller, ansigtsskærm til stænkbeskyttelse, handsker og godkendt damprspiration, hvis ventilationen ikke er tilstrækkelig.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomar skala strukturelle undersøgelser af makromolekylære forsamlinger af Solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

En strategi til identificering af forbindelser, der påvirker cellevækst og overlevelse i dyrkede pattedyrceller ved lav til moderat gennemløb

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Tæthedsgradient ultracentrifugering til undersøgelse af endoytisk genanvendelse i pattedyrceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Dual-Color Fluorescens Krydskorrelation Spektroskopi til undersøgelse protein-protein interaktion og protein dynamik i levende celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Oprensning af allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Indre mitokondriemembranfølsomhed over for Na+ afslører delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Oxygenuafhængige assays til måling af mitokondriefunktion hos pattedyr

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...