Name: atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי פרס מגוון הפקולטה מאוניברסיטת מסצ בית הספר לרפואה ט-B. N.N.-טי. נתמך על ידי ספ-CONACYT, גרנט 279879. J. G. N נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע המענק DBI 0959476. המחברים אסירי תודה לד ר דריל א. בוסקו לאספקת הקו הN2A לדניאלה Cangussu לתמיכה הטכנית שלה.

1. תרבית תאים ממגלית
<ol><li>שיקולים כלליים
	<ol>
<li>בצע את הטכניקות אספטי עבור תרבות התא היונקים בעבר נבדקו38.</li>
		<li>שמור על כל קווי התא בתוך מחולל לחות 5%2 חממה ב 37 ° c. תנאי תרבות התא משתנים עבור כל סוג תא. חשוב לשמור על תנאי התרבות המתאימים עבור כל קו תא בשימוש, כמו וריא?...

ספקטרוסקופית בליעה אטומית היא שיטה רגישה ביותר עבור כימות Zn בדגימות ביולוגיות קטנות של נפח/המוני. אופטימיזציה תיאר של Zn מדידה עושה יישום של שיטה זו פשוטה ערבויות תנאים אנליטיים אידיאליים. כאן, באמצעות GF-AAS, קבענו ריכוז של Zn בתאים שלמים, ו ציטוסולג ושברים גרעיניים, מקווי תאים שונים. התוצאות ?...

מעבר ומתכות כבדות, כגון Zn, Cu, Mn ו-Fe, נמצאים באופן טבעי בסביבה במזון ובחומרים מזהמים. כל האורגניזמים החיים דורשים כמויות שונות של יסודות אלה מיקרו; עם זאת, החשיפה לרמות גבוהות היא מדלטרזה לאורגניזמים. רכישת מתכת היא בעיקר דרך הדיאטה, אבל מתכות יכול גם להיות שאפה או נספג דרך העור1,2,3,4,5. חשוב לציין כי הנוכחות של מתכות חלקיקים אטמוספריים הוא הולך והיה קשור בעיקר לסיכונים בריאותיים. בשל פעילויות אנתרופוגניים, רמות גבוהות של מתכות כבדות כגון Ag, כמו, Cd, Cr, Hg, Ni, Fe, ו-Pb זוהו בחומר חלקיקי אטמוספרי, מי גשמים, ואדמה6,7. מתכות אלה יש פוטנציאל להתחרות עם אלמנטים פיסיולוגיים חיוניים, במיוחד Zn ו-Fe, והם לגרום להשפעות רעילות על ידי הפעלת אנזימים בסיסיים עבור תהליכים ביולוגיים.
אלמנט המעקב zn הוא הנייטרלי מחדש ומתנהג כחומצת לואיס בתגובות ביולוגיות, מה שהופך אותו לקופקטור בסיסי הנחוץ לקיפול חלבונים ולפעילות קטליטית ביותר מ -10% מהחלבונים המיונקים8,9, . עשר מטרים כתוצאה מכך, חיוני לפונקציות פיזיולוגיות שונות8,11. עם זאת, כמו יסודות קורט רבים, יש איזון עדין בין מתכות אלה הקלה על תפקוד פיזיולוגי נורמלי גרימת רעילות. ביונקים, zn הליקויים להוביל אנמיה, הצמיחה פיגור, hypogonadism, מומים בעור, שלשול, התקרחות, הפרעות טעם, דלקת כרונית, ולקויי פונקציות החיסון הנוירולוגי11,12, 13,14,15,16,17,18. עודף, zn הוא ציטוטוקסיים ופוגע בספיגה של מתכות חיוניות אחרות כגון נחושת19,20,21.
בנוסף, כמה מתכות כמו Cu ו-Fe יש את הפוטנציאל להשתתף בתגובות מזיקות. ייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) דרך פנטון כימיה יכול להפריע הרכבה של הברזל ברזל אשכול חלבונים לשנות את חילוף החומרים של השומנים22,23,24. כדי למנוע נזק זה, תאים לנצל מתכת מחייב המלווים ומובילים כדי למנוע אפקטים רעילים. ללא ספק, הומאוסטזיס מתכת חייב להיות נשלט הדוק כדי להבטיח כי סוגי תאים ספציפיים לשמור על רמות הנכון של מתכות. מסיבה זו, יש צורך משמעותי לקדם טכניקות למדידה מדויקת של מתכות קורט בדגימות ביולוגיות. בפיתוח ואורגניזמים בוגרים קיים צורך ביולוגי משלים ברכיבי מעקב ברמה התאית, בשלבים התפתחותיים שונים ובתנאים נורמליים ופתולוגיים. לכן, קביעת מדויק של רקמות ורמות מתכת מערכתית הוא הכרחי כדי להבין אורגאיהמחלת מתכת הומאוסטזיס.
התנור גרפיט האטום האטומי ספקטרומטריה (GF-AAS) היא טכניקה רגישה מאוד בשימוש עבור כרכים מדגם קטן, מה שהופך אותו אידיאלי כדי למדוד מעבר ומתכות כבדות להציג דגימות ביולוגיות וסביבתיות25,26 , בן 27 , 28. יתר על כן, בשל רגישות גבוהה של הטכניקה, זה הוכח להיות מתאים ללמוד את תכונות התחבורה קנס של Na+/k+-Atpase ואת הקיבה H+/k+-atpase באמצעות xenopus אוציטים כמערכת מודל29. ב GF-AAS, את האלמנטים האטומיים בתוך מדגם לקלוט אורך גל של קרינה הנפלטת על ידי מקור אור המכיל את מתכת הריבית, עם הקרינה נספג ביחס לריכוז של האלמנט. עירור האלקטרוני היסודות מתרחש על קליטת הקרינה אולטרה סגולה או לעין בתהליך כימות ייחודי עבור כל אלמנט כימי. בתהליך אלקטרון בודד, ספיגת הפוטון כרוכה באלקטרון העובר מרמת אנרגיה נמוכה יותר לרמה גבוהה יותר בתוך האטום ו-GF-AAS קובע את כמות הפוטונים שנספג על ידי המדגם, אשר פרופורציונאלית למספר קליטת הקרינה רכיבים האטומיזציה בשפופרת הגרפיט.
הסלקטיביות של טכניקה זו נשענת על המבנה האלקטרוני של האטומים, שבו כל אלמנט יש שורה מסוימת ספיגה/פליטת ספקטרלית. במקרה של Zn, אורך גל ספיגת הוא 213.9 ננומטר והוא יכול להיות מכובד בדיוק ממתכות אחרות. בסך הכל, GF-AAS יכול לשמש לכמת Zn עם גבולות נאותה של זיהוי (לוד) ורגישות גבוהה ובסלקטיביות25. השינויים באורך הגל הנספג משולבים ומוצגים כפסגות ספיגת אנרגיה באורכי גל ספציפיים ומבודדים. ריכוז Zn במדגם נתון מחושב בדרך כלל מתוך עיקול רגיל של ריכוזים ידועים על פי חוק בירה-למברט, שבו ספיגת הספיגה ביחס ישיר לריכוז Zn במדגם. עם זאת, החלת משוואת בירה למברט לניתוח GF-AAS גם מציג כמה סיבוכים. למשל, וריאציות בריכוזים האטומזציה ו/או הלא-הומוגניים של הדגימות יכולות להשפיע על מדידות המתכת.
האטווניזציה מתכת נדרש עבור הניתוח GF AAS מעקב היסודות מורכב משלושה צעדים יסודיים. הצעד הראשון הוא desolvation, שבו הממס הנוזלי מתאדה; השארת תרכובות יבשות לאחר שכבשן מגיע לטמפרטורה של כ-100 ° c. אז, תרכובות מתאדה על ידי חימום אותם מ 800 אל 1,400 ° צ' (בהתאם לאלמנט להיות מנותח) ולהיות גז. לבסוף, התרכובות במצב גזי מאטובות בטמפרטורות הנעות בין 1,500 ל-2,500 ° c. כפי שנדונו לעיל, הגדלת ריכוזים של מתכת עניין יהיה להפוך מגדיל פרופורציונלי על ספיגת שזוהו על ידי GF-AAS, עדיין הכבשן מפחית את טווח דינמי של ניתוח, אשר הוא מגוון העבודה של ריכוזים שיכולים להיות נקבעת על-ידי הכלי. לפיכך, הטכניקה דורשת ריכוזים נמוכים ונחישות זהירה של הטווח הדינמי של השיטה על-ידי קביעת לוד והגבלת יניאריות (LOL) של חוק בירה-למברט. לוד הוא הכמות המינימלית הנדרשת לזיהוי חומר, המוגדר כפי שלושה מסטיית התקן של Zn במטריצה. LOL הוא הריכוז המקסימלי שניתן לזהות באמצעות חוק בירה-למברט.
בעבודה זו, אנו מתארים שיטה סטנדרטית לנתח את רמות Zn בתמציות תאים שלמים, cytoplasmic ושברים גרעיניים, ו בתוך מתרבים ומבדילים תאים מתורבתים (איור 1). התאמתי את הבידוד המהיר של פרוטוקול גרעיני למערכות סלולריות שונות כדי למנוע אובדן מתכת במהלך הכנת המדגם. הדגמים הסלולריים בשימוש היו myoblasts העיקרי נגזר מתאי לווין העכבר, מורנין בתאי נוירובלסטומה (N2A או Neuro2A), מורטין 3T3 L1 adipocytes, קו האפיתל של השד בן האדם (MCF10A), ו אפיתל דין-דארבי כליה הכלליים ( MDCK) תאים. תאים אלה הוקמו מתוך ליננים שונים הם מודלים טובים עבור חקירת וריאציות ספציפיות של השושלת של רמות מתכת מבחנה.
ראשי myoblasts נגזר מתאי לווין העכבר מהווים מתאים היטב מודל מבחנה לחקור בידול שריר השלד. התפשטות של תאים אלה הוא מהיר כאשר מתורבת בתנאי סרום גבוה. הבידול לתוך שושלת השרירים נגרמת לאחר מכן על ידי מצבים סרום נמוך30. נוירובלסטומה ממורין (N2A) הוקמה קו התא נגזר ציצה עצבי העכבר. תאים אלה מציגים מורפולוגיה של תאי גזע. ואמבות עם גירוי בידול, התאים הN2A להציג מספר תכונות של נוירונים, כגון הנוירוסיבים. N2A תאים משמשים כדי לחקור את מחלת האלצהיימר, neurite outgrowth, ו רעילות נוירו31,32,33. 3T3-L1 murine לפני adipocytes הוקמה קו התא משמש בדרך כלל כדי לחקור את השינויים מטבולית ופיסיולוגיים הקשורים adipocytes. תאים אלה להציג פיברוהפיצוץ כמו מורפולוגיה, אבל פעם מגורה עבור בידול, הם מציגים הפעלה אנזימטית הקשורים סינתזה השומנים הצטברות טריגליצרידים. זה יכול להיות נצפה כמו שינויים מורפולוגיים לייצר שומנים cytoplasmic טיפות34,35. MCF10A הוא קו האפיתל של החלב שאינם סרטניים שנגזר אישה טרום בגיל הסרטן עם מחלה פיברופיברוזיס של החלב36. הוא שימש רבות למחקרים ביוכימיים, מולקולריים וסלולאריים הקשורים לסרטן הפטמות, כגון התפשטות, העברת תאים ופלישה. דין-דארבי כליות הכלב (MDCK) הקו התא האפיתל השתמשו בהרחבה כדי לחקור את המאפיינים ואירועים מולקולריים הקשורים להקמת האפיתל פנוטיפים. בהגיעם למפגש, תאים אלה הופכים מקוטניים ומקימים הידקויות תא תא, מאפיינים של רקמות אפיתל מיונקים (37).
כדי לבדוק את היכולת של AAS למדוד את רמות Zn בתאי היונקים, ניתחנו שברים שלמים ו-subcellular (ציטוסול וגרעין) של חמש קווי תאים אלה. מדידות AAS הראה ריכוזים שונים של Zn בסוגי תאים אלה. ריכוזים היו נמוכים יותר בהתרבות ומבדילים העיקרי myoblasts (4 כדי 7 nmol/mg של חלבון) ומעלה בארבעה קווי התא הוקמה (החל מ 20 אל 40 nmol/mg של חלבון). קטן לא משמעותי עלייה ברמות Zn זוהה בהבחנה הראשי myoblasts ובתאי נוירובלסטומה בהשוואה לתאים מתרבים. האפקט המנוגד זוהה adipocytes הבדיל. עם זאת, מתרבים 3T3-L1 תאים הציגו ריכוזים גבוהים יותר של המתכת לעומת תאים הבדיל. וחשוב מכך, בשלושת קווי התאים האלה, שבירה משנית הראתה כי Zn הוא מופץ באופן מהותי בציטוסול ובגרעין לפי מצב חילוף החומרים של תאים אלה. למשל, ב מתרבים myoblasts N2A תאים, ו 3T3-L1 טרום-adipocytes, רוב המתכת היא מקומית לגרעין. עם אינדוקציה של בידול באמצעות טיפולי תאים ספציפיים, Zn מקומי הציטוזול בשלושת סוגי תאים אלה. מעניין, שני קווי האפיתל הראו רמות גבוהות יותר של Zn במהלך התפשטות לעומת כאשר הגיע המפגש, שבו נוצר מונאולייר הדוק מאפיין. בתאי האפיתל מתרבים, קו החלב MCF10A היה התפלגות Zn שווה בין הציטוסול והגרעין, בעוד בתוך קו הכליה-נגזר התאים, רוב המתכת היתה ממוקמת בגרעין. בשני סוגי תאים אלה, כאשר התאים הגיעו למפגש, Zn היה ממוקם בעיקר לציטוסול. תוצאות אלה מוכיחים כי GF-AAS היא טכניקה רגישה מאוד מדויק לביצוע ניתוח אלמנטלים בדגימות תשואה נמוכה. GF-AAS בשילוב עם השבר הסלולר והוא יכול להיות מותאם כדי לחקור את הרמות של מעקב רכיבי מתכת קווי תאים שונים ורקמות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1005706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brg1-antibody (G7)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnologies</td>
			<td>sc-17796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti b-tubulin-antibody (BT7R)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-16308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidemal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>51300044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid (HNO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM (Reduced Serum Media)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol (Collagen)</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retionic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648469-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 &#181;g/mL, 2% HNO3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Established Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3-L1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CL-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDK</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Absortion spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Aanalyst 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagnode</td>
			<td>UCD-200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells

מתכות מעבר הם יסודות חיוניים לאורגניזמים אך יכולים להיות רעילים לתאים בריכוזים גבוהים על ידי התמודדות עם מתכות פיסיולוגיים בחלבונים ויצירת סטרס מחדש. מצבים פתולוגיים המובילים לדלדול מתכות או להצטברות הם סוכנים סיבתיים של מחלות אנושיות שונות. מספר דוגמאות כוללות אנמיה, אקרודרמטיטיס enteropathica, ווילסון ומחלות מנקס. לכן חשוב להיות מסוגל למדוד את רמות והובלה של מתכות מעבר בדגימות ביולוגיות עם רגישות גבוהה ודיוק על מנת להקל על המחקר לחקור כיצד גורמים אלה תורמים פונקציות פיזיולוגיות נורמלית רעילות. אבץ (Zn), למשל, הוא קופקטור במספר רב של חלבונים היונקים, משתתפת באירועים איתות, והוא שליח משני בתאים. בנוסף, Zn הוא רעיל והוא יכול לעכב את ספיגת מתכות אחרות, בעוד בגרעון, זה יכול להוביל למגוון של מצבים קטלניים פוטנציאלי.

התנור גרפיט ספקטרוסקופיית הקליטה האטומית (GF-AAS) מספק שיטה מאוד רגישה ויעילה לקביעת Zn ומעבר ריכוזי מתכת אחרים בדגימות ביולוגיות מגוונות. אלקטרוטרזציה האטומיות דרך GF-AAS ככמת מתכות על ידי הפחתת כמויות קטנות של דגימות עבור ניתוח בליעה סלקטיבית העוקבות באמצעות אורך הגל של עירור של אלמנט העניין. בגבולות היניאריות של חוק בירה-למברט, ספיגת האור על ידי המתכת מידתית באופן ישיר לריכוז האנליטה. לעומת שיטות אחרות של קביעת תוכן Zn, GF-AAS מזהה הן חינם, משלימה Zn בחלבונים ואולי במולקולות תאיים קטנות עם רגישות גבוהה בנפחים מדגם קטן. יתר על כן, GF-AAS הוא גם יותר נגיש בקלות מאשר השראה מצמידים פלזמה מסה מאסיבי (הקאמרי-MS) או סינכרוטרון-רנטגן מבוסס רנטגן. בשיטה זו, ההכנה לדוגמה שיטתית של קווי תאים מתורבתים שונים לניתוחים ב-GF-AAS מתוארת. וריאציות באלמנט מעקב זה הושוו בשני ליטים תא שלם ושברים subcellular של תאים מתרבים והבדיל כהוכחה לעיקרון.

בדקנו את היכולת של GF-AAS כדי לזהות רמות דקה של Zn בתאי היונקים (איור 1). לכן, אנו מתורבתים העיקרי myoblasts נגזר מתאי לווין העכבר, ואת קווי התא הוקמה N2A (נוירובלסטומה הנגזרת), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (אפיתל השד), ו MDCK תאים (אפיתל כליה הכלב). ראשית, בודדנו את כל התאים, ציטוסולג וש?...

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים

קווי תאים ראשוניים או מבוססים משמשים בדרך כלל לטיפול בשאלות ביולוגיות ומכניסטיות בסיסיות כגישה ראשונית לפני השימוש במודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין תמציות תאים שלמות ושברים תת-סלולאריים למחקרים של אבץ (Zn) ורכיבי מעקב אחרים עם ספקטרוסקופיה לספיגת האטום.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

תפקידן של מתכות המעבר בהתפתחות היונקים אינו מוערך כראוי. ראיות המתעוררים מראים כי הונוסטזיס מתכת ממשיך להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי של תאים ורקמות. יתר על כן, היעדים הסלולריים הספציפיים של מתכות גם זנים בפיתוח, וכמובן, זה מאתגר לזהות את מיקומם.עד כה פותחו טכניקות אנליטיות שונות לכימות מתכות, אך רובן יקרות או בלתי נגישות. מחקר אינטנסיבי מתמקד בשיפור קביעות המתכת בצורה נגישה ויעילה יותר. ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית של תנור גרפיט, GF-AAS, יש שני יתרונות עיקריים.הוא מספק מגבלות נמוכות של זיהוי עבור אבץ, המאפשר ניתוח אבץ עקבות מדויק. זוהי גם טכניקה שאינה דורשת כמויות גבוהות של מדגם, microliters של פתרון נוטים להיות מספיק כדי לבצע את הניתוח. השילוב של שני יתרונות אלה הופך את GF-AAS לאידיאלי לניתוח רכיבי מעקב בדגימות בנפח נמוך.מספר מצבים פתולוגיים אנושיים קשורים לחוסר איזון מתכתי. כמה דוגמאות הן אנמיה, אקרובמטיטיס enteropathica, ומחלות וילסון ומנקס. לכן, חשוב לפתח שיטות יעילות ואמינות למדידת רמות מתכות המעבר בדגימות ביולוגיות עם רגישות ודיוק גבוהים.GF-AAS היא דוגמה מצוינת על טכנולוגיה המאפשרת קביעה של כל מתכת נתון בתנאים פיזיולוגיים נורמליים, במקרים פתוגניים. השיטה מאוד רב-תכליתית. זה יכול להיות מיושם על מערכות רבות ורכיבים רבים יכולים להיות ניתוח באמצעות GF-AAS.האתגרים הם לקבוע את מגבלת השיטה של זיהוי במציאות, ולוודא כי הדגימות נופלות בתוך מגבלה זו. בהתחשב בעובדה כי נפח הדגימות הוא נמוך, אין הרבה מקום לבדיקה, כך בזהירות בדיקה של נתונים צריך להתקיים מההתחלה. לאחר הניתוח הראשון של דגימות, אנחנו צריכים לקבוע מה הוא גורם הדילול הדרוש כדי להביא את הדגימות למגבלות הנדרשות לכימות.ודא כי אתה יכול לשבר את הגרעינים כראוי לפני שאתה הולך AAS. כתמים מערביים הם תמיד אימות טוב לפני הניתוח הספקטרוסקופי. בעוד GF-AAS דורש אמצעי אחסון נמוכים, מאגרים תאיים נמצאים באמצעי אחסון נמוכים כבר.זה נותן מעט מקום לבדיקות. המדידות הראשונות צריכות להיעשות בקפידה ולבדוק, כך שניתן למזער את הטיפול המדגם לגורם דילול אחד. כדי להתחיל, תרבות התאים של עניין 55 צלחות סנטימטר מרובע.השתמש במלכודת ואקום כדי לשאוב את המדיה התרבותית. הקפד להסיר את כל עקבות המדיה. השתמש PBS קר כקרח ללא סידן ומגנזיום כדי לשטוף את התאים מנקודות הזמן הרצויות, או תנאי תרבות, שלוש פעמים.לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של קרח קר PBS לצלחת, ולגרד את התאים מהצלחת. העבר את מתלי התא לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, ולשמור אותו על קרח. צנטריפוגה במשך 10 שניות ב 10, 000 פעמים G, ולהסיר את supernatant על ידי שאיפה.אם ניתוח מתכת של שברים ציטופלסמיים וגריניים רצוי, תן שימוש חוזר לכדור התא ב-400 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח המכיל 0.1%NP-40, חומר ניקוי לא יוני. מעבירים 100 מיקרוליטרים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש כדגימה של התא כולו, ומאחסנים אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לבודד גרעינים, השתמש בקצה מיקרופיפיט P1000 כדי לפעום את ההשעיה של תא 400 מיקרוליטר למעלה ולמטה חמש עד עשר פעמים על קרח.לאחר מכן, לחלץ חמישה microliters של ההשעיה התא ולהעביר אותו לשקופית זכוכית מיקרוסקופ. מניחים את חמשת המיקרוליטרים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות מטרה של פי 40 כדי לאמת את שלמות הגרעינים. צנטריפוגה הנותרים 395 תא microliter lysate השעיה במשך 10 שניות ב 10, 000 פעמים G.Transfer supernatant המכיל את השבר הציטוסולי לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של PBS המכיל 0.1%NP-40 כדי לשטוף את גלולה עם שבר גרעיני, ו צנטריפוגה במשך 10 שניות ב 10, 000 פעמים G.Remove את supernatant, ו resuspend גלולה המכילה את הגרעינים ב 100 מיקרוליטרים של אותו פתרון. כדי ללקט את התאים, השתמש בביורופטור כדי להפוך את התא כולו ואת הגרעינים המכילים פתרון שלוש פעמים, כל אחד במשך חמש דקות. המשך לבצע בקרת איכות של טוהר השברים על ידי כתם מערבי, באמצעות נוגדנים ספציפיים עבור שברים גרעיניים או ציטוסוליים.ראשית, להוסיף נפח שווה של חומצה חנקתית מרוכזת של כיתה מתכת קורט לתא כולו, שברים ציטופלסמיים וגריוניים המכילים 100, 500 ו 100 microliters של השעיית התא ב 1.5 צינורות microcentrifuge מיליליטר, ולמקום אותם בלוק תרמי ב 80 מעלות צלזיוס כדי מינרליזציה של תרבות התא במשך שעה אחת. לאחר מכן, להוציא את הצינורות מן הבלוק התרמי למקם אותם במדף כדי להמשיך את עיכול החומצה לילה ב 20 מעלות צלזיוס. לעצור את התגובה על ידי הוספת 30% של נפח המדגם של מי חמצן.הביאו את נפח הדגימה ל-500 מיקרוליטר עם 18 מגה מים מטוהרים של Ohm. לאחר מכן, בצינור פלקון 15 מיליליטר לדלל תחמוצת חנקן סטנדרטית כיתה אנליטית במים מטוהרים ב 18 מגה Ohms להכין שני נפח אחוז חומצה חנקתית פתרון כפתרון ריק במהלך הכיול. לאחר מכן, השתמש בתסגם החומצה החנקתית של שני נפחים כדי לדלל פתרון מלאי אבץ זמין מסחרית של 1,000 עמודים לדקה עם ריכוז של 1,000 חלקים למיליארד.הכן פתרונות סטנדרטיים לעבודה מהפתרון הסטנדרטי של 1,000 חלק למיליון אבץ, פתרון 1,000 חלק למיליארד ולאחר מכן לדלל אותו ל 5, 8, 10, 15, 20 ו 25 ppb ישירות עם 2 נפח אחוז חומצה חנקתית פתרון. מניחים מיליליטר אחד של 0.1% מגנזיום חנקתי מגביל לתוך כוסות מדגם פוליפרופילן, ולאחר מכן לטעון את ה כוסות לתוך קרוסלת מדגם אוטומטי. תכנת את ספקטרומטר הספיגה האטומית כדי להוסיף באופן אוטומטי חמישה מיקרוליטרים של מגביל המטריצה לתקני האבץ וריק.הגדר את אותו מצב אופטימיזציה על ספקטרומטר הספיגה האטומית עבור הפתרונות הסטנדרטיים ואת הדגימות, עם קצב זרימה מבוא ב 250 מיליליטר לדקה, טמפרטורת הזרקה ב 20 מעלות צלזיוס, וטמפרטורת תנור גרפיט להגיע 1, 800 מעלות צלזיוס בתהליכים ארבעה שלבים. יש למדוד את כל הסטנדרטים והדגימות של ניסוי יחיד בו זמנית כדי למנוע טעויות עקב הבדלי כיול או אידוי. מטב את המנורה C-HCL לזרם של 20 אמפר, אורך גל של 213.9 ננומטר וחותך של 0.7 ננומטר.פיפטה הדגימות ב כוסות מדגם פוליפרופילן, והמקום אותם לתוך קרוסלת מדגם אוטומטי. הגבול התחתון של זיהוי אבץ הוא 0.01 חלקים למיליארד. על ידי הגדלת הריכוז של התקנים, הגבול העליון של זיהוי אבץ נקבע להיות 20 חלקים למיליארד.לאחר מתקבלת עקומת אבץ סטנדרטית, למדוד את הדגימות מינרלים כדי לקבוע את התוכן מתכת. אם הנתונים המתקבלים הם מעבר לגבול הגילוי, לדלל את הדגימות עם 18 מגה Ohm מים מטוהרים שטופלו 0.1% חומצה חנקתית כיתה אנליטית. בבידוד מהיר זה של פרוטוקול הגרעינים, כתם מערבי מייצג מהבדלת מיובלסטים ראשוניים מראה את טוהר שברי התת-תאיים.אנזים שיפוץ הכרומטין Brg1 שימש לזיהוי השבר הגרעיני, וטאבולין שימש לזיהוי החלק הציטוסולי. איור זה מציג מיקרוגרפים מייצגים של אור למיקרו-שכבות מתרבות ומובחנות או תואמות של כל סוג תא, ואת תוכן האבץ המתאים בתמציות תאים שלמים, שברים ציטוסוליים וגריוניים. כל קווי התאים שנותחו במחקר זה הראו ריכוזי אבץ בטווח הננו-מולארי.מיוטובים ראשוניים מובחנים הציגו רמות גבוהות יותר של אבץ מאשר תאים מתרבים. התפלגות תת-תאית דומה של אבץ זוהתה בקו התאים המופק נוירובלסטומה N2A. מצד שני, קו התאים 3T3-L1 שהוקם הפגין רמות גבוהות יותר של אבץ כאשר הקדם-אדיפוזיטים היו מתרבים מאשר כאשר הם היו המושרים או מובחנים.תאי MCF10A הראו רמות שוות של אבץ בין שברים ציטוסוליים וגריניים בתאים מתרבים. לאחר שתאי MCF10A הגיעו למנזר, זוהתה ירידה של 40% ברמות האבץ של התא כולו, והמתכת נמצאה מרוכזת ביותר בשבר הציטוסולי. ספקטרומטריית ספיגה אטומית של תנור גרפיט היא טכניקה רגישה ביותר למדידת מעבר ומתכות כבדות בדגימות ביולוגיות וסביבתיות.טיפול מיוחד וניקיון בהכנת שברים תת תאיים יש לקחת, כמו זיהום מינימלי צפוי להפריע הניתוח, בשל הרגישות של הציוד. בהתחשב בנפחים הנמוכים וברמות העקבות של מתכות בכל ניסוי, קשה לחשוב על טכניקה טובה ומדויקת יותר למדידת אבץ מאשר GF-AAS. אין טכניקות נוכחיות שיכולות לספק את גבולות הזיהוי ונפח נמוך הנדרשים בעלות נמוכה יחסית של GF-AAS.ספקטרומטריית ספיגת אטומית של תנור גרפיט מדויקת, רגישה, חסכונית ונגישה. טכניקה אנליטית זו תמשיך להשתפר ככל שטכנולוגיות הזיהוי היסודי ימשיכו להתקדם. יישום עתידי לגילוי אבץ ומתכות אחרות על ידי GF-AAS יכלול איברים, רקמות המתקבלות ממודלים של בעלי חיים, וביופסיות מחולים עם מחלה הקשורה לחוסר איזון מתכתי מערכתי.חומצה חנקתית היא חומצה קורוזיבית מאוד המסוגלת לגרום לכוויות כימיות חמורות במהירות רבה. כימיקל זה יכול גם להגיב באלימות עם תרכובות מסוימות כגון אבקות מתכתיות. בגלל הסכנה שמציבה חומצה חנקתית, חשוב לנקוט באמצעי בטיחות מחמירים בכל פעם שמטפלים בחומצה חנקתית.בעת טיפול בחומצה חנקתית אנו ממליצים בחום להרכיב משקפיים כימיים בטיחותיים, מגן פנים להגנה מפני התזה, כפפות ונשימה מאושרת של אדים אם האוורור אינו מספיק.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-Na+ חושפת בריכות CoQ פונקציונליות מפולחות חלקית

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...