Name: atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla facoltà diversità studiosi Award dalla University of Massachusetts Medical School a T.P.-B. N.N.-T. è supportata da SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N è supportato dalla National Science Foundation Grant DBI 0959476. Gli autori sono grati al dottor Daryl A. bosco per aver fornito la linea cellulare N2A e a Daniella Cangussu per il suo supporto tecnico.

1. coltura cellulare dei mammiferi
<ol><li>Considerazioni generali
	<ol>
<li>Seguire le tecniche asettiche per la coltura cellulare dei mammiferi precedentemente recensiti38.</li>
		<li>Mantenere tutte le linee cellulari in un incubatore umidificato 5% CO2 a 37 ° c. Le condizioni di coltura delle celle variano per ogni tipo di cella. È importante mantenere condizioni di coltura appropriate per ogni linea cellulare utilizzata, poiché le variazioni di queste procedur...

La spettroscopia di assorbanza atomica è un metodo altamente sensibile per la quantificazione di Zn in piccoli campioni biologici di volume/massa. L'ottimizzazione descritta della misura Zn rende semplice l'applicazione di questo metodo e garantisce condizioni analitiche ideali. Qui, utilizzando GF-AAS, abbiamo determinato la concentrazione di Zn in cellule intere, e in frazioni citosoliche e nucleari, da diverse linee cellulari. I risultati dimostrano che questa tecnica rende paragonabile a quelle ottenute da sonde flu...

La transizione e i metalli pesanti, come Zn, cu, MN e Fe, si trovano naturalmente nell'ambiente in entrambi i nutrienti negli alimenti e negli inquinanti. Tutti gli organismi viventi richiedono quantità diverse di questi micronutrienti; Tuttavia, l'esposizione a livelli elevati è deleteriosa per gli organismi. L'acquisizione di metalli è principalmente attraverso la dieta, ma i metalli possono anche essere inalati o assorbiti attraverso la pelle1,2,3,4,5. È importante notare che la presenza di metalli nelle particelle atmosferiche è in aumento ed è stata in gran parte associata a rischi per la salute. A causa di attività antropogeniche, sono stati rilevati aumenti dei livelli di metalli pesanti come AG, As, CD, CR, Hg, NI, Fe e PB in particolato atmosferico, acqua piovana e suolo6,7. Questi metalli hanno il potenziale per competere con oligoelementi fisiologici essenziali, in particolare Zn e Fe, e inducono effetti tossici inattivando gli enzimi fondamentali per i processi biologici.
L'oligoelemento Zn è redox neutro e si comporta come un acido di Lewis nelle reazioni biologiche, il che lo rende un cofattore fondamentale necessario per la piegatura delle proteine e l'attività catalitica in oltre il 10% delle proteine dei mammiferi8,9, 10; il di conseguenza, è essenziale per diverse funzioni fisiologiche8,11. Tuttavia, come molti oligoelementi, c'è un delicato equilibrio tra questi metalli facilitando la normale funzione fisiologica e causando tossicità. Nei mammiferi, carenze di Zn portano a anemia, ritardo della crescita, ipogonadismo, anomalie della pelle, diarrea, alopecia, disturbi del gusto, infiammazione cronica, e le funzioni immunitarie e neurologiche compromessa11,12, 13,14,15,16,17,18. In eccesso, lo Zn è citotossico e altera l'assorbimento di altri metalli essenziali come il rame19,20,21.
Inoltre, alcuni metalli come Cu e Fe hanno il potenziale per partecipare a reazioni dannose. La produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) tramite la chimica Fenton può interferire con l'assemblaggio delle proteine del cluster di zolfo di ferro e alterare il metabolismo lipidico22,23,24. Per evitare questo danno, le cellule utilizzano chaperoni e trasportatori di legame metallico per prevenire gli effetti tossici. Indubbiamente, l'omeostasi metallica deve essere strettamente controllata per garantire che determinati tipi di cellule mantengano i livelli appropriati di metalli. Per questo motivo, vi è una significativa necessità di avanzare tecniche per la misurazione accurata dei metalli in tracce in campioni biologici. Negli organismi in via di sviluppo e maturi esiste una necessità biologica differenziale per oligoelementi a livello cellulare, in diverse fasi evolutive, e in condizioni normali e patologiche. Pertanto, la determinazione precisa dei livelli di tessuto e di metallo sistemico è necessaria per comprendere l'omeostasi metallica dell'organismo.
La spettrometria di assorbimento atomico del forno di grafite (GF-AAS) è una tecnica altamente sensibile utilizzata per piccoli volumi di campioni, rendendola ideale per misurare la transizione e i metalli pesanti presenti nei campioni biologici e ambientali25,26 , 27 il , 28. Inoltre, a causa dell'elevata sensibilità della tecnica, si è dimostrato appropriato per studiare le proprietà di trasporto fine di na+/K+-ATPase e gastrico H+/K+-ATPase con Xenopus ovociti come sistema modello29. In GF-AAS, gli elementi atomizzati all'interno di un campione assorbono una lunghezza d'onda della radiazione emessa da una fonte di luce contenente il metallo di interesse, con la radiazione assorbita proporzionale alla concentrazione dell'elemento. L'eccitazione elettronica Elementale avviene dopo l'assorbimento di radiazioni ultraviolette o visibili in un processo quantizzato unico per ogni elemento chimico. In un singolo processo di elettroni, l'assorbimento di un fotone coinvolge un elettrone che si muove da un livello di energia inferiore a un livello superiore all'interno dell'atomo e GF-AAS determina la quantità di fotoni assorbita dal campione, che è proporzionale al numero di radiazioni che assorbono elementi atomizzati nel tubo di grafite.
La selettività di questa tecnica si basa sulla struttura elettronica degli atomi, in cui ogni elemento ha una specifica linea spettrale di assorbimento/emissione. Nel caso di Zn, la lunghezza d'onda di assorbanza è 213,9 Nm e può essere precisamente distinta da altri metalli. Complessivamente, GF-AAS può essere utilizzato per quantificare Zn con adeguati limiti di rilevazione (LOD) e alta sensibilità e selettività25. I cambiamenti nella lunghezza d'onda assorbita sono integrati e presentati come picchi di assorbimento di energia a lunghezze di onda specifiche e isolate. La concentrazione di Zn in un dato campione è di solito calcolata da una curva standard di concentrazioni conosciute secondo la legge della birra-Lambert, in cui l'assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di Zn nel campione. Tuttavia, l'applicazione dell'equazione di Beer-Lambert alle analisi di GF-AAS presenta anche alcune complicazioni. Ad esempio, le variazioni nell'atomizzazione e/o nelle concentrazioni non omogenee dei campioni possono influire sulle misurazioni metalliche.
L'atomizzazione del metallo necessaria per l'analisi elementale della traccia GF AAS consiste in tre passaggi fondamentali. Il primo passo è la desolvazione, dove il solvente liquido viene evaporato; lasciando i composti secchi dopo che il forno raggiunge una temperatura di circa 100 ° c. Poi, i composti vengono vaporizzati riscaldandoli da 800 a 1.400 ° c (a seconda dell'elemento da analizzare) e diventare un gas. Infine, i composti allo stato gassoso sono atomizzati con temperature che vanno da 1.500 a 2.500 ° c. Come discusso in precedenza, aumentando le concentrazioni di un metallo di interesse renderà aumenti proporzionali sull'assorbimento rilevato dal GF-AAS, ma il forno riduce la gamma dinamica di analisi, che è il campo di lavoro di concentrazioni che possono essere determinato dallo strumento. Pertanto, la tecnica richiede basse concentrazioni e un'attenta determinazione della gamma dinamica del metodo determinando il LOD e il limite di linearità (LOL) della legge della birra-Lambert. Il LOD è la quantità minima richiesta per una sostanza da rilevare, definita come tre volte la deviazione standard di Zn nella matrice. Il LOL è la massima concentrazione che può essere rilevata utilizzando la legge di birra-Lambert.
In questo lavoro, descriviamo un metodo standard per analizzare i livelli di Zn in estratti di cellule intere, frazioni citoplasmatiche e nucleari, e nel proliferare e differenziare le cellule coltivate (Figura 1). Abbiamo adattato il rapido isolamento del protocollo dei nuclei a diversi sistemi cellulari per prevenire la perdita di metallo durante la preparazione del campione. I modelli cellulari utilizzati erano i mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo, cellule di neuroblastoma murina (N2A o Neuro2A), murine 3T3 L1 adipociti, una linea cellulare epiteliale del seno non tumorigenico umano (MCF10A), e rene epiteliale Madin-Darby canino ( MDCK). Queste cellule sono state stabilite da diversi lignaggi e sono buoni modelli per indagare le variazioni specifiche di lignaggio dei livelli di metallo in vitro.
I mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo costituiscono un modello in vitro ben adatto per indagare la differenziazione muscolare scheletrica. La proliferazione di queste cellule è veloce quando viene coltivata in condizioni sieriche elevate. La differenziazione nel lignaggio muscolare viene quindi indotta da condizioni sieriche basse30. La linea cellulare stabilita dal neuroblastoma murino (N2A) è derivata dalla cresta neurale del topo. Queste cellule presentano la morfologia delle cellule staminali neuronali e amoeboidi. Dopo lo stimolo di differenziazione, le cellule N2A presentano diverse proprietà dei neuroni, come i neurofilamenti. Le cellule N2a sono usate per indagare la malattia di Alzheimer, la crescita del neurite e la neurotossicità31,32,33. Il 3T3-L1 murino pre-adipociti stabilito linea cellulare è comunemente usato per indagare i cambiamenti metabolici e fisiologici associati con adipogenesi. Queste cellule presentano una morfologia simile a fibroblasti, ma una volta stimolata per la differenziazione, presentano l'attivazione enzimatica associata alla sintesi lipidica e all'accumulo di trigliceridi. Questo può essere osservato come cambiamenti morfologici per produrre goccioline di lipidi citoplasmatici34,35. MCF10A è una linea cellulare epiteliale mammaria non tumorale derivata da una donna premenopausale con malattia fibrocistica mammaria36. È stato ampiamente utilizzato per gli studi biochimici, molecolari e cellulari relativi alla carcinogenesi mammaria, come la proliferazione, la migrazione cellulare e l'invasione. La linea cellulare epiteliale del rene canino Madin-Darby (MDCK) è stata ampiamente utilizzata per indagare le proprietà e gli eventi molecolari associati alla creazione del fenotipo epiteliale. Al raggiungimento della confluenza, queste cellule diventano polarizzate e stabiliscono le adesioni cellulari, caratteristiche dei tessuti epiteliali dei mammiferi37.
Per testare la capacità di AAS di misurare i livelli di Zn nelle cellule di mammiferi, abbiamo analizzato frazioni intere e subcellulari (citosol e nucleo) di queste cinque linee cellulari. Le misurazioni di AAS hanno mostrato diverse concentrazioni di Zn in questi tipi di cellule. Le concentrazioni sono state più basse nel proliferare e differenziare i mioblasti primari (da 4 a 7 nmol/mg di proteina) e più in alto nelle quattro linee cellulari stabilite (che vanno da 20 a 40 nmol/mg di proteina). Un piccolo aumento non significativo dei livelli di Zn è stato rilevato nella differenziazione delle mioblasti primari e delle cellule di neuroblastoma rispetto alle cellule proliferanti. L'effetto opposto è stato rilevato in adipociti differenziati. Tuttavia, le cellule 3T3-L1 proliferanti hanno mostrato concentrazioni più elevate del metallo rispetto alle cellule differenziate. È importante sottolineare che, in queste tre linee cellulari, il frazione subcellulare ha mostrato che Zn è distribuito differenzialmente nel citosol e nel nucleo secondo lo stato metabolico di queste cellule. Per esempio, in proliferare mioblasti, cellule N2A, e 3T3-L1 pre-adipociti, la maggior parte del metallo è localizzato al nucleo. Dopo l'induzione della differenziazione utilizzando trattamenti cellulari specifici, Zn localizzato al citosol in questi tre tipi di cellule. È interessante notare che entrambe le linee cellulari epiteliali hanno mostrato livelli più elevati di Zn durante la proliferazione rispetto a quando raggiungono la confluenza, in cui è stato formato un caratteristico monostrato stretto. Nelle cellule epiteliali proliferanti, la linea cellulare mammaria MCF10A aveva una distribuzione uguale di Zn tra il citosol e il nucleo, mentre nella linea cellulare derivata dal rene, la maggior parte del metallo era situata nel nucleo. In questi due tipi di cellule, quando le cellule raggiunsero la confluenza, Zn era prevalentemente localizzato al citosol. Questi risultati dimostrano che GF-AAS è una tecnica altamente sensibile e accurata per eseguire l'analisi elementare in campioni a basso rendimento. GF-AAS accoppiato con frazione subcellulare e può essere adattato per indagare i livelli di oligoelementi metallici in diverse linee cellulari e tessuti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1005706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brg1-antibody (G7)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnologies</td>
			<td>sc-17796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti b-tubulin-antibody (BT7R)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-16308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidemal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>51300044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid (HNO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM (Reduced Serum Media)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol (Collagen)</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retionic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648469-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 &#181;g/mL, 2% HNO3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Established Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3-L1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CL-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDK</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Absortion spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Aanalyst 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagnode</td>
			<td>UCD-200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells

I metalli di transizione sono micronutrienti essenziali per gli organismi, ma possono essere tossici per le cellule ad alte concentrazioni competendo con i metalli fisiologici nelle proteine e generando stress redox. Le condizioni patologiche che portano alla deplezione o all'accumulo di metalli sono agenti causali di diverse malattie umane. Alcuni esempi includono l'anemia, l'enteropatica dell'acrodermatite e le malattie di Wilson e Menkes. È quindi importante essere in grado di misurare i livelli e il trasporto dei metalli di transizione in campioni biologici con elevata sensibilità e accuratezza al fine di facilitare la ricerca esplorando come questi elementi contribuiscano alle normali funzioni fisiologiche e Tossicità. Lo zinco (Zn), ad esempio, è un cofattore in molte proteine dei mammiferi, partecipa a eventi di segnalazione ed è un messaggero secondario nelle cellule. In eccesso, Zn è tossico e può inibire l'assorbimento di altri metalli, mentre in deficit, può portare a una varietà di condizioni potenzialmente letali.

La spettroscopia di assorbimento atomico del forno di grafite (GF-AAS) fornisce un metodo altamente sensibile ed efficace per determinare Zn e altre concentrazioni di metalli di transizione in diversi campioni biologici. L'atomizzazione elettrotermica tramite GF-AAS quantifica i metalli atomizzando piccoli volumi di campioni per la successiva analisi selettiva dell'assorbimento utilizzando la lunghezza d'onda dell'eccitazione dell'elemento di interesse. Entro i limiti della linearità della legge della birra-Lambert, l'assorbanza della luce da parte del metallo è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'analita. Rispetto ad altri metodi per determinare il contenuto di Zn, GF-AAS rileva sia Zn libero e complessato in proteine e possibilmente in piccole molecole intracellulari con alta sensibilità in piccoli volumi di campione. Inoltre, GF-AAS è anche più facilmente accessibile rispetto alla spettrometria di massa plasmatica induttivamente accoppiata (ICP-MS) o alla fluorescenza a raggi X basata su sincrotrone. In questo metodo, viene descritta la preparazione sistematica del campione di diverse linee cellulari coltivate per le analisi in un GF-AAS. Le variazioni di questo oligoelemento sono state confrontate sia nei lisati a cellule intere che nelle frazioni subcellulari di cellule proliferanti e differenziate come prova di principio.

Abbiamo testato la capacità del GF-AAS di rilevare i livelli dei minuti di Zn nelle cellule di mammiferi (Figura 1). Così, abbiamo coltivato i mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo, e le linee cellulari stabilite N2A (neuroblastoma derivato), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (epitelio del seno), e cellule MDCK (epitelio del rene del cane). In primo luogo, abbiamo isolato le frazioni intere di cellule, citosoliche e nucleari di tutti questi tip...

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Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

Le linee cellulari primarie o consolidate sono comunemente utilizzate per affrontare questioni biologiche e meccanicistiche fondamentali come approccio iniziale prima di utilizzare modelli animali. Questo protocollo descrive come preparare estratti di cellule intere e frazioni subcellulari per studi di zinco (Zn) e altri oligoelementi con spettroscopia di assorbanza atomica.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Il ruolo dei metalli di transizione nello sviluppo dei mammiferi è ampiamente sottovalutato. Prove emergenti mostrano che l'omeostasi metallica continua a cambiare in base allo stadio di sviluppo di cellule e tessuti. Inoltre, anche le destinazioni cellulari specifiche dei metalli sono in fase di sviluppo e, naturalmente, è difficile identificarne la posizione.Ad oggi, sono state sviluppate diverse tecniche analitiche per quantificare i metalli, ma la maggior parte sono costose o inaccessibili. La ricerca intensiva è focalizzata per migliorare le determinazioni dei metalli in modo più accessibile ed efficiente. La spettroscopia ad assorbimento atomico del forno a grafite, GF-AAS, presenta due vantaggi principali.Fornisce bassi limiti di rilevamento per lo zinco, consentendo un'accurata analisi dello zinco traccia. È anche una tecnica che non richiede elevati volumi di campione, i microlitri di soluzione tendono ad essere sufficienti per eseguire l'analisi. La combinazione di questi due vantaggi rende GF-AAS ideale per analizzare oligoelementi in campioni a basso volume.Diverse condizioni patologiche umane sono legate a squilibri metallici. Alcuni esempi sono l'anemia, l'acrodermatite enteropathica e le malattie di Wilson e Menkes. Pertanto, è importante sviluppare metodi efficienti e affidabili per misurare i livelli di metalli di transizione in campioni biologici con elevata sensibilità e precisione.GF-AAS è un ottimo esempio su una tecnologia che facilita la determinazione di un dato metallo in normali condizioni fisiologiche e in casi patogeni. Il metodo è molto versatile. Può essere applicato a molti sistemi e molti elementi possono essere analisi utilizzando GF-AAS.Le sfide sono stabilire il limite di metodo di rilevamento nella realtà, assicurandosi che i campioni rientrano in questo limite. Dato che il volume dei campioni è basso, non c'è molto spazio per i test, quindi l'esame attento dei dati deve avvenire fin dall'inizio. Dopo la prima analisi dei campioni, dobbiamo stabilire qual è il fattore di diluizione necessario per portare i campioni ai limiti richiesti per la quantificazione.Assicurati di essere in grado di frazionare correttamente i nuclei prima di andare all'AAS. Le macchie occidentali sono sempre una buona convalida prima dell'analisi spettroscopica. Mentre GF-AAS richiede volumi bassi, i pool intracellulari sono già in volumi bassi.Questo dà poco spazio per i test. Le prime misurazioni devono essere accuratamente fatte ed esaminate, in modo che il trattamento del campione possa essere ridotto al minimo a un solo fattore di diluizione. Per iniziare, coltura le cellule di interesse in piastre di 55 centimetri quadrati.Utilizzare una trappola per vuoto per aspirare i mezzi di coltura. Assicurarsi di rimuovere tutte le tracce di supporti. Utilizzare PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio per risciacquare le cellule dai punti di tempo desiderati, o dalle condizioni di coltura, tre volte.Quindi aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato alla piastra e raschiare le cellule dalla piastra. Trasferire le sospensioni cellulari in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e tenerlo sul ghiaccio. Centrifugare per 10 secondi a 10.000 volte G e rimuovere il supernatante per aspirazione.Se si desidera un'analisi metallica delle frazioni citoplasmatiche e nucleari, rimescolare il pellet cellulare in 400 microlitri di PBS ghiacciato contenente lo 0,1%NP-40, un detergente non ionico. Trasferire 100 microlitri in un nuovo tubo di microcentrifugo come campione di cellule intere e conservarlo a meno 20 gradi celsius. Per isolare i nuclei, utilizzare una punta in micropipetto P1000 per pipettare la sospensione cellulare da 400 microliter su e giù da cinque a 10 volte sul ghiaccio.Quindi, estrarre cinque microlitri della sospensione cellulare e trasferirli in uno scivolo di vetro al microscopio. Posizionare i cinque microlitri al microscopio leggero utilizzando un obiettivo 40 volte superiore per verificare l'integrità dei nuclei. Centrifugare la restante sospensione a lysato a celle a 395 microliter per 10 secondi a 10.000 volte G.Trasferire il supernatante contenente la frazione citosolica in un nuovo tubo di microcentrifugo.Successivamente, aggiungere 500 microlitri del PBS contenenti 0,1%NP-40 per risciacquare il pellet con la frazione nucleare e centrifugare per 10 secondi a 10.000 volte G.Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet contenente i nuclei in 100 microlitri della stessa soluzione. Per liscire le cellule, utilizzare un Bioruptor per sonicare l'intera cellula e i nuclei contenenti soluzione tre volte, ciascuno per cinque minuti. Procedere ad eseguire il controllo di qualità della purezza delle frazioni da parte della macchia occidentale, utilizzando anticorpi specifici per le frazioni nucleari o citosoliche.In primo luogo, aggiungere un volume uguale di acido nitrico concentrato di grado di metallo traccia a tutte le frazioni cellulari, citoplasmatiche e nucleari contenenti 100, 500 e 100 microlitri di sospensione cellulare in tubi microcentrifuge da 1,5 millilitri e metterli in un blocco termico a 80 gradi celsius per mineralizzare la coltura cellulare per un'ora. Successivamente, esettare i tubi dal blocco termico e metterli in un rack per continuare la digestione acida durante la notte a 20 gradi Celsius. Interrompere la reazione aggiungendo il 30% del volume del campione di perossido di idrogeno.Portare il volume del campione a 500 microlitri con acqua purificata da 18 mega Ohm. Successivamente, in un tubo Falcon da 15 millilitri diluire l'ossido nitrico standard di grado analitico in acqua purificata a 18 mega Ohm per preparare la soluzione di acido nitrico del due volumi percento come soluzione vuota durante la calibrazione. Quindi, utilizzare la soluzione di acido nitrico del due volumi percento per diluire una soluzione di stock di zinco disponibile in commercio da 1.000 ppm con una concentrazione di 1.000 parti per miliardo.Preparare soluzioni standard di lavoro dalla soluzione standard di zinco da 1.000 parti per milione, la soluzione da 1.000 parti per miliardo, quindi diluirla a 5, 8, 10, 15, 20 e 25 ppb direttamente con una soluzione di acido nitrico del 2%. Posizionare un millilitro del modificatore della matrice di nitrato di magnesio dello 0,1% in tazze campione di polipropilene, quindi caricare le tazze nel carosello dell'autocampionatore. Programmare lo spettrometro ad assorbimento atomico per aggiungere automaticamente cinque microlitri del modificatore della matrice agli standard di zinco e al vuoto.Impostare la stessa condizione ottimizzata sullo spettrometro ad assorbimento atomico per le soluzioni standard e i campioni, con portata di introduzione a 250 millilitri al minuto, temperatura di iniezione a 20 gradi celsius e temperatura del forno di grafite che raggiunge 1.800 gradi celsius in processi in quattro fase. Tutte le norme e i campioni di un singolo esperimento devono essere misurati contemporaneamente per evitare errori dovuti a differenze di taratura o evaporazione. Ottimizzare la lampada C-HCL a una corrente di 20 ampere, lunghezza d'onda di 213,9 nanometri e fessura di 0,7 nanometri.Pipettare i campioni in tazze campione di polipropilene e posizionarli nel carosello dell'autocampionatore. Il limite inferiore di rilevazione dello zinco è di 0,01 parti per miliardo. Aumentando la concentrazione degli standard, il limite massimo di rivelazione dello zinco è determinato in 20 parti per miliardo.Dopo aver ottenuto una curva standard di zinco, misurare i campioni mineralizzati per determinare il contenuto di metallo. Se i dati ottenuti sono oltre il limite di rivelazione, diluire i campioni con acqua purificata da 18 mega Ohm trattata con acido nitrico di grado analitico dello 0,1%. In questo rapido isolamento del protocollo dei nuclei, una macchia occidentale rappresentativa dalla differenziazione dei mioblasti primari mostra la purezza delle frazioni subcellulari.L'enzima rimodellatore di cromatina Brg1 è stato usato per identificare la frazione nucleare, e la tubulina è stata utilizzata per identificare la frazione citosolica. Questa figura mostra le micrografie luminose rappresentative per monostrati proliferano e differenziati o confluenti di ciascun tipo di cella, non e il corrispondente contenuto di zinco negli estratti di cellule intere, nelle frazioni citosoliche e nucleari. Tutte le linee cellulari analizzate in questo studio hanno mostrato concentrazioni di zinco nell'intervallo nanomolare.I miotubi primari differenziati mostravano livelli più elevati di zinco rispetto alle cellule proliferanti. Una distribuzione subcellulare simile dello zinco è stata rilevata nella linea cellulare derivata dal neuroblastoma N2A. D'altra parte, la linea cellulare 3T3-L1 stabilita mostrava livelli più elevati di zinco quando i pre-adipociti proliferavano rispetto a quando erano indotti o differenziati.Le cellule MCF10A mostravano livelli uguali di zinco tra frazioni citosoliche e nucleari nelle cellule proliferanti. Una volta che le cellule MCF10A raggiungono la confluenza, è stata rilevata una diminuzione del 40% dei livelli di zinco a cellule intere e il metallo è stato trovato più concentrato nella frazione citosolica. La spettrometria ad assorbimento atomico del forno a grafite è una tecnica altamente sensibile per misurare la transizione e i metalli pesanti in campioni biologici e ambientali.Occorre prestare particolare attenzione e pulizia nella preparazione delle frazioni subcellulari, poiché una contaminazione minima probabilmente interferirà con l'analisi, a causa della sensibilità dell'apparecchiatura. Dati i bassi volumi e i bassi livelli di tracce di metalli in ogni esperimento, è difficile pensare a una tecnica migliore e più accurata per misurare lo zinco rispetto al GF-AAS. Non esistono tecniche attuali in grado di fornire i limiti di rilevamento e il basso volume richiesto al costo relativamente basso del GF-AAS.La spettrometria ad assorbimento atomico del forno a grafite è accurata, sensibile, economica e accessibile. Questa tecnica analitica continuerà a migliorare man mano che le tecnologie di rilevamento elementale continueranno a progredire. La futura applicazione per l'individuazione dello zinco e di altri metalli da parte della GF-AAS includerà organi, tessuti ottenuti da modelli animali e biopsie da pazienti con malattie associate a squilibri metallici sistemici.L'acido nitrico è un acido estremamente corrosivo in grado di causare gravi ustioni chimiche molto rapidamente. Questa sostanza chimica può anche reagire violentemente con alcuni composti come le polveri metalliche. A causa del pericolo rappresentato dall'acido nitrico, è importante adottare severe misure di sicurezza ogni volta che si maneggia acido nitrico.Quando si maneggia acido nitrico si consiglia vivamente di indossare occhiali chimici di sicurezza, schermo facciale per la protezione dagli spruzzi, guanti e respirazione a vapore approvata se la ventilazione non è adeguata.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Ricerca

Biochimica

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare e la sopravvivenza nelle cellule di mammaliana coltivate a bassa-moderato throughput

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Ultracentrifugazione a gradiente di densità per lo studio del riciclaggio endocitico nelle cellule di mammifero

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore per studiare l'interazione proteina-proteina e la dinamica proteica nelle cellule vive

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

La sensibilità della membrana mitocondriale interna a Na+ rivela pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...