Name: atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

이 작품은 T.P.에 매사추세츠의과 대학에서 교수진 다양성 학자 상을 지원 했다. N.N.. 는 SEP CONACYT, 보조금 279879에 의해 지원 됩니다. J. g. N은 국립 과학 재단 보조금 DBI 0959476에 의해 지원 됩니다. 저자는 N2A 셀 라인을 제공 하기 위한 닥터 다 릴 a. 보스코와 그녀의 기술 지원에 대 한 다니엘 라 창 Ussu에 감사 드립니다.

1. 포유류 세포 배양
<ol><li>일반 고려 사항
	<ol>
<li>포유류 세포 배양에 대 한 무 균 기술에 따라 이전에 검토38.</li>
		<li>37 ° c에서가 습 된 5% CO2 인큐베이터에서 모든 세포 주를 유지 한다. 세포 배양 조건은 각 세포 유형에 따라 달라 집니다. 사용 된 각 세포 주의 적절 한 배양 조건을 유지 하는 것이 중요 하며, 이러한 절차의 변화로 인해 세포 배양의 변종 ?...

원자 흡 광도 분광학은 소량의/대량 생물학 견본에 있는 Zn 정량화를 위한 높게 과민 한 방법입니다. Zn 측정의 최적화는이 방법을 간단 하 게 적용 하 고 이상적인 분석 조건을 보장 합니다. 여기에서 GF-AAS를 사용 하 여, 우리는 다양 한 세포 주 로부터, 세포 및 핵 분 획에서, 그리고 전체 셀에서 Zn의 농도를 결정 했다. 결과는이 기술이 형광 프로브 및 ICP에 의해 얻어진 것과 비교 하 여 렌더링 한다...

아연, Cu, Mn 및 Fe와 같은 전이 및 중 금속은 식품 및 오염 물질의 두 영양소 모두에서 자연적으로 발견 됩니다. 모든 살아있는 유기 체는이 미 량 영양소의 다른 양을 요구 합니다; 그러나, 높은 수준에 노출은 유기 체에 해로운. 금속 수집은 주로 다이어트를 통해, 하지만 금속은 또한 피부를 통해 흡입 또는 흡수 될 수 있다1,2,4,5. 대기 입자에 있는 금속의 존재가 증가 하 고 건강 위험과 크게 연관 되어 있다는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다. 인위적인 활동으로 인하여 Ag와 같은 중 금속의 증가 된 수준, 예컨대 Cd, Cr, Hg, Ni, Fe 및 Pb는 대기 미 립 자 물질, 빗 물 및 토양6에서 검출 되었다. 이러한 금속은 필수 생리 적 미 량 원소, 특히 Zn과 Fe와 경쟁할 가능성이 있으며 생물학적 과정에 대 한 기본 효소를 비활성화 하 여 독성 효과를 유발 합니다.
미 량 원소 Zn은 산화 환 원 중성 이며, 포유류 단백질8,9의 10% 이상에서 단백질 폴딩 및 촉매 활성에 필요한 근본적인 보조 인자를 만드는 생물학적 반응에서 루이스 산으로 서 동작 하며, 10; 따라서 다양 한 생리 기능8,11에 필수적입니다. 그러나, 많은 미 량 원소 처럼, 정상적인 생리 기능을 촉진 하 고 독성을 일으키는 이러한 금속 사이의 섬세 한 균형이 있다. 포유류에서, Zn 결핍은 빈 혈, 성장 지연, hypogonadism, 피부 이상, 설사, 탈모 증, 맛 장애, 만성 염증 및 장애인 면역 및 신경 기능 장애를 야기 한다11,12, 16,17,18. 과량으로, Zn은 세포 독성을 가지 며 구리19,20,21등의 다른 필수 금속의 흡수를 저해 한다.
추가적으로, Cu와 Fe와 같은 몇몇 금속은 유해한 반응에 참여할 가능성이 있습니다. 펜 톤 화학을 통한 반응성 산소 종 (ROS)의 생산은 철 황 클러스터 단백질의 조립을 방해 하 고 지질 대사22,23을변경할 수 있습니다. 이 손상을 방지 하기 위해, 세포는 독성 효과를 방지 하기 위해 금속 결합 샤 페론 및 전송기를 활용 합니다. 의심 할 여 지 없이, 금속 항상성 특정 세포 유형이 금속의 적절 한 수준을 유지 하기 위해 엄격 하 게 제어 해야 합니다. 이러한 이유로 생물학적 시료에서 미 량 금속을 정확 하 게 측정 하기 위한 기술을 발전시키는 데는 상당한 필요성이 있습니다. 발달 하 고 성숙한 유기 체에서 세포 수준, 다른 발달 단계 및 정상 및 병리학 적 조건에서 미 량 원소에 대 한 차등 생물학적 필요성이 존재 합니다. 따라서, 조직 및 전신 금속 레벨의 정밀한 결정은 organismal 금속 항상성 이해에 필요 하다.
흑연로 원자 흡수 분 광 법 (GF-AAS)은 작은 시료 부피에 사용 되는 고감도 기술로 서 생물학적 및 환경적 시료에 존재 하는 전이 및 중 금속을 측정 하는 데 이상적입니다25,26 , 28 , 28. 또한, 기술의 높은 감도로 인해 xenopus 를 사용 하 여 Na +/k+ATPase 및 위 H+/k+-ATPase의 미세한 수송 특성을 연구 하는 데적합 한 것으로 나타났습니다. 모델 시스템으로 서 난 모 세포 (29). GF-AAS에서, 샘플 내의 원자화 된 요소는 관심 있는 금속을 포함 하는 광원에 의해 방출 되는 방사선의 파장을 흡수 하 고, 흡수 된 방사선은 원소의 농도에 비례 합니다. 원소 전자 여기는 각 화학 원소에 대 한 고유 양자화 된 과정에서 자외선 또는 가시 방사선의 흡수에 일어난다. 단일 전자 공정에서, 광자의 흡수는 원자 내에서 더 낮은 에너지 레벨로 이동 하는 전자와 GF-AAS는 샘플에 의해 흡수 되는 광자의 양을 결정 하며,이는 방사선 흡수의 수에 비례 한다 요소는 흑연 튜브에서 원자화.
이 기법의 선택 성은 각 원소에 특정 흡수/방출 스펙트럼 라인이 있는 원자의 전자 구조에 의존 합니다. Zn의 경우, 흡 광도 파장은 213.9 nm이 고, 다른 금속과 정밀 하 게 구별할 수 있다. 전반적으로 GF-AAS는 적절 한 검출 한계 (LOD)와 고감도 및 선택성25를 사용 하 여 Zn을 정량화 하는 데 사용할 수 있습니다. 흡수 된 파장의 변화는 통합 되 고 특정 및 절연 파장에서 에너지 흡수의 피크로 제시 됩니다. 주어진 샘플에서 Zn의 농도는 일반적으로 맥주-램버트 법칙에 따라 알려진 농도의 표준 곡선에서 계산 되며, 여기서 흡 광도는 샘플의 Zn 농도에 정비례 합니다. 그러나 GF-AAS 분석에 맥주 램버트 방정식을 적용 하면 약간의 합병증도 나타납니다. 예를 들어, 샘플의 분무 및/또는 불균일 한 농도의 변동은 금속 측정에 영향을 줄 수 있습니다.
GF AAS 미 량 원소 분석에 필요한 금속 분무는 세 가지 기본 단계로 구성 됩니다. 첫 번째 단계는 액체 용 매가 증발 되는 탈 용 매입니다. 퍼니스 후 건조 화합물을 떠나는 것은 약 100 ° c의 온도에 도달 한다. 이어서, 화합물을 800 내지 1400 ° c에서가 열 하 여 기화 시켜 (분석 하고자 하는 원소에 따라) 기체가 된다. 마지막으로, 기체 상태의 화합물은 1500에서 2500 ° c 까지의 온도 범위에서 원자화 됩니다. 상기 논의 된 바와 같이, 관심 금속의 농도 증가는 GF-AAS에 의해 검출 된 흡수에 비례 증가를 렌더링 하지만, 퍼니스는 분석의 동적 범위를 감소 시킬 수 있는 농도의 작동 범위 기기에 의해 결정 됩니다. 따라서,이 기술은 낮은 농도를 요구 하 고 비어 있는 램버트 법칙의 LOD 및 선형성의 한계를 결정 함으로써 방법의 동적 범위에 대 한 신중한 결정을 필요로 한다. LOD는 물질을 검출할 때 필요한 최소 수량으로, 매트릭스에서 Zn의 표준 편차를 3 배로 정의 합니다. LOL은 맥주 램버트 법을 사용 하 여 검출 될 수 있는 최대 농도 이다.
이 작업에서는 전체 세포 추출 물, 세포질 및 핵 분 획 및 증식 및 분화 배양 세포에서 Zn의 수준을 분석 하는 표준 방법을 설명 합니다 (그림 1). 우리는 샘플 준비 중 금속 손실을 방지 하기 위해 다른 세포 시스템에 핵 프로토콜의 급속 한 격리를 조정 했습니다. 사용 된 셀룰러 모델은 마우스 위성 세포, 뮤 린 신경 모 세포종 세포 (N2A 또는 Neuro2A), 뮤 린 3T3 L1 지방 세포내, 인간 비 종양 유 방 상피 세포 주 (MCF10A) 및 상피 마 딘-다 비 개 신장 ( MDCK) 셀입니다. 이 세포는 다른 계보에서 설립 된 및 시험관에서금속 수준의 계보 특정 변화를 조사 하기 위한 좋은 모델.
마우스 위성 세포에서 유래 된 1 차 myoblasts은 골격 근육 분화를 조사 하기에 적합 한 시험관 내 모델을 구성 합니다. 이러한 세포의 증식은 높은 혈 청 조건 하에서 배양 할 때 빠르다. 근육 혈통으로의 분화는 저 혈 청 조건30에 의해 유도 된다. 뮤 린 신경 모 세포종 (N2A) 확립 된 세포 주는 마우스 뉴 럴 크레스트 로부터 유래 되었다. 이들 세포는 뉴런 및 아메바 줄기 세포 형태학을 제시 한다. 분화 자극 시, N2A 세포는 신경 필 라 멘 트와 같은 뉴런의 여러 성질을 제시 한다. N2A 세포는 알츠하이머병을 조사 하기 위해 사용 되는, 신경 근 성장, 및 신경 독성31,32,33. 3T3-L1 뮤 린 전 지방 세포는 지질 생성과 관련 된 대사 및 생리 적 변화를 조사 하기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 이들 세포는 섬유 아 세포 유사 형태학을 제시 하지만, 일단 분화에 자극을 주며, 지질 합성과 중성 지방 축적과 관련 된 효소 활성화를 제시 한다. 이는 세포질 지질 방울34,35을 생성 하기 위한 형태학 적 변화로 관찰 될 수 있다. MCF10A는 유 방 섬유 낭 성 질환36을 가진 폐 경전 여성에서 유래한 비 종양 유 방 상피 세포 라인 이다. 이는 증식, 세포 이동 및 침략과 같은 유 방 발암 물질과 관련 된 생화학 적, 분자 및 세포 연구에 널리 사용 되 고 있습니다. 마 딘-다가 개 신장 (MDCK) 상피 세포 주는 광범위 하 게 사용 되어 상피 표현 형의 확립과 관련 된 특성 및 분자 사건을 조사 한다. 합류에 도달 하면,이 세포는 편광 되 고 세포 세포 유착을 확립, 포유류 상피 조직의 특성37.
포유동물 세포에서의 Zn 수준을 측정 하는 AAS의 능력을 시험 하기 위해, 우리는 이들 5 개의 세포 주 들의 전체 및 세포 분 획 (사이토 졸 및 핵)을 분석 하였다. AAS 측정은 이러한 세포 유형에 서 Zn의 상이한 농도를 보여주었다. 농도는 4 개의 확립 된 세포 주 (단백질의 20에서 40 nmol/mg에 이르기까지)에서 증가 하 고 1 차적인 myob(4~7nmol/mg 단백질)의 분화에서 더 낮다. 아연 수준에서 작은 비 중요 한 증가는 세포 증식에 비교 될 때 일차 myoblasts 및 신경 모 세포종 세포를 차별화에서 검출 되었다. 분화 된 지방 세포에서 반대 효과가 검출 되었다. 그러나 3T3-L1 세포 증식은 분화 된 세포에 비해 금속의 높은 농도를 나타내 었 다. 중요 하 게도, 이러한 3 개의 세포 주에서, 세포 분별은 Zn이 이들 세포의 대사 상태에 따라 사이토 졸 및 핵에 차별적으로 분포 되어 있음을 보여주었다. 예를 들어, 증식에 있어서, N2A 세포 및 3T3-L1 사전 지방 세포, 금속의 대다수는 핵에 국한 된다. 특정 세포 처리를 사용 하 여 분화의 유도 시, 아연은이 세 가지 세포 유형에 서 사이토 졸에 국한. 흥미롭게도, 둘 다 상피 세포 라인은 특성 꽉 단층 형성 된 합류에 도달 했을 때에 비해 증식 시 Zn의 높은 수준을 보였다. 상피 세포 증식에서, 유 방 세포 주는 사이토 졸과 핵 사이에 동등한 Zn 분포를 MCF10A, 신장 유래 세포 주는 대부분의 금속이 핵에 위치 하였다. 이 두 세포 유형에 서, 세포가 합류에 도달 하면, Zn은 주로 사이토 졸에 위치 하였다. 이러한 결과는 GF-AAS가 저 수율 샘플에서 원소 분석을 수행 하기 위한 매우 민감하고 정확한 기술 이라는 것을 보여줍니다. GF-AAS는 세포 분 획과 결합 하 고 다른 세포 주 및 조직에서 미 량 금속 원소의 레벨을 조사 하도록 조정할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1005706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brg1-antibody (G7)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnologies</td>
			<td>sc-17796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti b-tubulin-antibody (BT7R)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-16308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidemal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>51300044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid (HNO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM (Reduced Serum Media)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol (Collagen)</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retionic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648469-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 &#181;g/mL, 2% HNO3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Established Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3-L1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CL-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDK</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Absortion spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Aanalyst 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagnode</td>
			<td>UCD-200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells

전이 금속은 유기 체에 필수적인 미 량 영양소 이지만 단백질의 생리 금속과 경쟁 하 고 산화 환 원 스트레스를 발생 시켜 높은 농도로 세포에 독성이 있을 수 있습니다. 금속 고갈 또는 축적으로 이끌어 내는 병리학 적 상태는 다른 인간적 인 질병의 인과 대리인입니다. 몇몇 예는 빈혈증, acrodermatitis enteropathica, 및 윌슨의 그리고 Menkes의 질병을 포함 합니다. 따라서 이러한 요소가 정상적인 생리 적 기능에 기여 하는 방법을 탐구 하는 연구를 용이 하 게 하기 위해 높은 민감도와 정확성을 가진 생물학적 시료에서 전이 금속의 수준과 수송을 측정 할 수 있어야 하는 것이 중요 합니다 독성. 아연 (Zn)은 예를 들어 많은 포유류 단백질의 보조 인자이 고, 신호 전달에 관여 하며, 세포에서의 이차 메신저 이다. 과잉에서, Zn은 독성이 며 다른 금속의 흡수를 억제할 수 있으며, 적자 상태에서는 잠재적으로 치명적인 다양 한 조건으로 이어질 수 있습니다.

흑연로 원자 흡수 분 광 법 (GF-AAS)은 다양 한 생물학적 샘플에서 Zn 및 기타 전이 금속 농도를 결정 하는 매우 민감하고 효과적인 방법을 제공 합니다. GF-AAS를 통한 전기 열 분무는 관심 요소의 여기 파장을 사용 하 여 후속 선택적 흡수 분석을 위해 소량의 시료를 분무 하 여 금속을 정량 합니다. 맥주-램버트 법칙의 선형성의 한계 내에서, 금속에의 한 빛의 흡 광도는 분석 물의 농도에 정비례 합니다. Zn 함량을 결정 하는 다른 방법에 비해, GF-AAS는 작은 샘플 용적에서 고감도의 작은 세포내 분자와 단백질의 무료 및 복합 Zn을 모두 검출 합니다. 또한, GF-AAS는 유도 결합 플라즈마 질량 분 광 법 (ICP) 또는 싱크 로트 론 기반 X 선 형광 보다 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 이 방법에서는, GF-AAS에서 분석을 위해 상이한 배양 된 세포 주 들의 체계적인 샘플 준비가 기재 되어 있다. 이 미 량 원소의 변이는 전체 세포 용 해물과 증식 및 분화 된 세포의 소 세포 분 획을 원리의 증거로 서 비교 하였다.

우리는 포유류 세포에 있는 Zn의 분 수준을 검출 하는 GF-AAS의 능력을 시험 했습니다 (그림 1). 따라서, 우리는 마우스 위성 세포 로부터 유래 된 1 차 myoblasts (신경 모 세포종 유래), 3T3 L1 (지방 세포), MCF10A 및 MDCK 세포 (개 신장 상피)를 배양 하였다. 먼저, 이러한 모든 세포 유형의 전체 세포, 사이토 솔 릭 및 핵 분 획을 분리 하 고 웨스턴 블랏으로 분 획...

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Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학

배양 된 일차 또는 확립 된 세포 주는 일반적으로 동물 모델을 사용 하기 전에 초기 접근법으로 서 근본적인 생물학적 및 기계적 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 아연 (Zn) 및 원자 흡 광도 분광학이 있는 다른 미 량 원소 연구를 위해 전체 세포 추출 물과 세포 분 획을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

포유류 발달에서 전이 금속의 역할은 크게 과소 평가된다. 새로운 증거는 금속 항상성 세포와 조직의 발달 단계에 따라 변경 계속 것을 보여줍니다. 또한, 금속의 특정 셀룰러 대상은 또한 개발에 품종, 물론, 그것은 그들의 위치를 식별 하기 어려운.현재까지 금속을 정량화하기 위해 다른 분석 기술이 개발되었지만 대부분은 비싸거나 접근 할 수 없습니다. 집중적인 연구는 보다 접근가능하고 효율적인 방식으로 금속 측정을 개선하는 데 중점을 두고 있습니다. 흑연 용광로 원자 흡수 분광법, GF-AAS는 두 가지 주요 장점이 있습니다.아연에 대한 검출 의 낮은 한계를 제공하므로 정확한 추적 아연 분석을 가능하게 합니다. 또한 대량의 시료를 필요로 하지 않는 기술이며, 마이크로리터의 용액은 분석을 수행하기에 충분합니다. 이 두 가지 장점의 조합은 GF-AAS가 낮은 부피 샘플에서 미량 요소를 분석하는 데 이상적입니다.몇몇 인간적인 병리학 조건은 금속 잘못 균형과 관련이 있습니다. 몇몇 보기는 빈혈증, 곡예염 장병증 및 윌슨의 및 Menkes's 질병입니다. 따라서 높은 감도와 정확도로 생물학적 샘플에서 전이 금속 의 수준을 측정하는 효율적이고 신뢰할 수있는 방법을 개발하는 것이 중요합니다.GF-AAS는 정상적인 생리적 조건및 병원성 사례에서 주어진 금속의 결정을 용이하게 하는 기술에 대한 훌륭한 예입니다. 이 방법은 매우 다재다능합니다. 그것은 많은 시스템에 적용 될 수 있으며 많은 요소는 GF-AAS를 사용하여 분석 될 수있다.문제는 실제로 검출 방법 한계를 설정하여 샘플이 이 한계 내에 있는지 확인하는 것입니다. 샘플의 양이 적다는 사실을 감안할 때, 테스트할 여지가 많지 않으므로 처음부터 신중하게 데이터를 검사해야 합니다. 시료의 첫 번째 분석 후, 우리는 정량화에 필요한 한계에 샘플을 가지고 하는 데 필요한 희석 계수의 무엇을 설정 해야.AAS에 가기 전에 핵을 제대로 분수할 수 있는지 확인하십시오. 웨스턴 블롯은 분광 분석 전에 항상 좋은 검증입니다. GF-AAS는 낮은 볼륨을 필요로 하는 동안, 세포 내 풀은 이미 낮은 볼륨에.이는 테스트할 여지가 거의 없습니다. 첫 번째 측정은 신중하게 수행하고 검사해야 하므로 샘플 처리를 단 하나의 희석 계수로 최소화할 수 있습니다. 시작하려면 55 평방 센티미터 플레이트에 관심있는 세포를 배양합니다.진공 트랩을 사용하여 문화 미디어를 흡인합니다. 미디어의 모든 흔적을 제거해야 합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 얼음 차가운 PBS를 사용하여 원하는 시점이나 배양 조건으로부터 세포를 세 번 헹구는 다.그런 다음 접시에 얼음 차가운 PBS 1 밀리리터를 추가하고 접시에서 세포를 긁어 냅니다. 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오. 원심분리기는 10초, 000회 G에서 10초 동안, 포부로 상부를 제거합니다.세포질 및 핵 분획의 금속 분석이 바람직한 경우, 0.1%NP-40, 비이온 세제를 포함하는 얼음 감기 PBS의 400 마이크로리터에서 세포 펠릿을 재중단한다. 100 마이크로리터를 새로운 미세원심분리기 튜브로 전신 샘플로 전송하고 영하 20도에서 저장합니다. 핵을 분리하려면 P1000 마이크로파이펫 팁을 사용하여 400 마이크로리터 셀 서스펜션을 얼음에서 5~10회 위아래로 피펫합니다.그런 다음, 셀 서스펜션의 5개의 마이크로리터를 추출하여 현미경 유리 슬라이드로 옮기. 핵 무결성을 확인하기 위해 40배의 목표를 사용하여 5개의 마이크로리터를 가벼운 현미경 아래에 놓습니다. 원심분리기 나머지 395 마이크로리터 셀 용액 은 10초에서 10초 동안 정지현수, 000배 G.Transfer를 새로운 미세원심분리기 튜브로 분리한다.다음으로, 0.1%NP-40을 함유한 PBS의 마이크로리터 500을 추가하여 핵 분획으로 펠릿을 헹구고, 원심분리기는 10초에서 10초, 000배 G.는 상퍼를 제거하고, 동일한 용액의 100마이크로리터에 핵을 함유한 펠릿을 재연한다. 세포를 lyse하려면 Bioruptor를 사용하여 전체 세포와 핵함유 용액을 5분 동안 각각 세 번 초음파 처리합니다. 핵 또는 세포분획에 특이적인 항체를 사용하여 서양 얼룩에 의한 분획의 순도의 품질 관리를 수행합니다.첫째, 전세포, 세포질 및 100 마이크로리터를 함유한 세포질 및 100마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로센티슈에 함유한 미량 금속 등급의 농축 된 질산의 동일한 부피를 1시간 동안 세포 배양을 미네랄화하기 위해 열 블록에 배치한다. 그 후, 열 블록에서 튜브를 꺼내 20섭씨에서 하룻밤 동안 산 소화를 계속랙에 놓습니다. 과산화수소의 시료 부피의 30%를 첨가하여 반응을 중지합니다.18 메가 옴 정제 수와 500 마이크로 리터에 샘플 볼륨을 가져. 다음으로, 15 밀리리터 팔콘 튜브에서 18 메가 옴스의 정제수에서 분석 등급 표준 산화 질소 산화물을 희석하여 교정 중에 빈 용액으로 2부량 의 질산 용액을 준비합니다. 그런 다음, 2부피 퍼센트 질산 용액을 사용하여 10억 분의 1, 000부품의 농도로 시판 가능한 1, 000 ppm 아연 스톡 용액을 희석한다.1, 000분당 1, 000부, 100부, 100부, 100부, 25ppb로 희석하여 2부피% 질산 용액으로 직접 희석한다. 질산 마그네슘 매트릭스 수식제 1밀리리터를 폴리프로필렌 샘플 컵에 넣고 컵을 오토샘플러 회전 목마에 넣습니다. 원자 흡수 분광계를 프로그래밍하여 매트릭스 수정기의 5마이크로리터를 아연 표준 및 빈값에 자동으로 추가합니다.표준 솔루션 및 샘플에 대한 원자 흡수 분광계에 동일한 최적화된 조건을 설정하여 분당 250 밀리리터의 도입 유량, 섭씨 20도의 분사 온도, 흑연 용광로 온도가 4단계 공정에서 섭씨 1, 800도에 도달합니다. 단일 실험의 모든 표준 및 샘플은 교정 차이 또는 증발로 인한 실수를 피하기 위해 동시에 측정되어야 합니다. 램프 C-HCL을 20암페어, 파장 213.9나노미터, 0.7나노미터의 슬릿으로 최적화합니다.폴리프로필렌 샘플 컵에 샘플을 피펫하고 자동 샘플러 회전 목마에 넣습니다. 아연 검출의 하한은 10억 개당 0.01부품이다. 기준의 농도를 증가시킴으로써 아연 검출의 상한선은 10억 개당 20개 부품으로 결정된다.아연 표준 곡선을 얻은 후 광물화된 샘플을 측정하여 금속 함량을 결정합니다. 얻어진 데이터가 검출 한계를 초과하는 경우, 0.1%의 분석등급 질산으로 처리된 18메가옴 정제수로 샘플을 희석시키게 한다. 핵 프로토콜의 이 급속한 격리에서, 1차 근세포에서 대표적인 서쪽 얼룩은 세포전 분획의 순도를 나타낸다.크로마티닌 리모델링 효소 Brg1은 핵 분획을 식별하는 데 사용되었고, 튜룰린은 세포분획을 식별하는 데 사용되었다. 이 수치는 각 세포 유형의 증식 및 분화 또는 수렴 단층층, 그리고 전체 세포 추출물, 세포종 및 핵 분획에 해당하는 아연 함량을 확산및 분화하기 위한 대표적인 빛 현미경을 보여줍니다. 이 연구에서 분석된 모든 세포주들은 나노몰라 범위의 아연 농도를 보였다.분화 된 1 차 심모튜브는 증식 세포보다 아연의 높은 수준을 나타냈다. 아연의 유사한 세포 전염분포는 신경모세포종 유래 세포주 N2A에서 검출되었다. 한편, 확립된 3T3-L1 세포주들은 사전 아디포세포가 유도되거나 분화되었을 때보다 증식되었을 때 더 높은 수준의 아연을 나타냈다.MCF10A 세포는 증식 세포에서 세포와 핵 분획 사이의 아연의 동등한 수준을 보였다. MCF10A 세포가 합류하면 전세포 아연 수치가 40% 감소하는 것이 감지되었고, 금속은 세포분획에 가장 집중된 것으로 나타났다. 흑연 용광로 원자 흡수 분광법은 생물학적 및 환경 샘플에서 전이 및 중금속을 측정하는 매우 민감한 기술입니다.최소한의 오염으로 인해 장비의 감도로 인해 분석에 방해가 되기 때문에 세포 전 분획 을 준비하는 데 특별한 주의와 청결을 취해야 합니다. 모든 실험에서 낮은 볼륨과 미량의 금속 수준을 감안할 때 GF-AAS보다 아연을 측정하는 더 좋고 정확한 기술을 생각하기가 어렵습니다. GF-AAS의 상대적으로 낮은 비용으로 필요한 검출 의 한계와 낮은 부피를 제공할 수 있는 현재 기술은 없습니다.흑연 용광로 원자 흡수 분광법은 정확하고 민감하며 비용 효율적이며 접근 가능합니다. 원소 검출 기술이 계속 발전함에 따라 이 분석 기법은 계속 개선될 것입니다. GF-AAS에 의한 아연 및 기타 금속 검출을 위한 향후 응용 프로그램에는 전신 금속 불균형과 관련된 질병 환자로부터 장기, 동물 모델에서 얻은 조직 및 생검이 포함됩니다.질산은 매우 빠르게 심한 화학 적 화상을 일으킬 수있는 매우 부식성 산이다. 이 화학 물질은 또한 금속 분말 과 같은 특정 화합물과 격렬하게 반응할 수 있습니다. 질산에 의해 제기 되는 위험 때문에, 그것은 질산을 처리 할 때마다 엄격한 안전 조치를 취하는 것이 중요.질산을 취급할 때 우리는 환기가 적당하지 않은 경우에 안전 화학 안경, 방수, 장갑 및 승인된 증기 호흡을 위한 얼굴 방패를 착용하는 것을 강력히 추천합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...