Name: atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av fakultetet mangfold Scholars Award fra University of Massachusetts Medical School til T.P.-B. N.N.-T. støttes av SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N er støttet av National Science Foundation Grant DBI 0959476. Forfatterne er takknemlige for Dr. Daryl A. Bosco for å gi N2A cellelinjen og til Daniella Cangussu for sin tekniske støtte.

1. pattedyr cellekultur
<ol><li>Generelle hensyn
	<ol>
<li>Følg aseptisk teknikk for pattedyr cellekultur som tidligere har gjennomgått38.</li>
		<li>Oppretthold alle cellelinjer i en fuktet 5% CO2 inkubator ved 37 ° c. Cellekultur forhold varierer for hver celle type. Det er viktig å opprettholde passende kultur forhold for hver cellelinje som brukes, som variasjoner av disse prosedyrene vil føre til avvikende fenotyper og svikt i celle kulturen.</li>
		<li>Sikr...

Atomic absorbansen spektroskopi er en svært følsom metode for Zn kvantifisering i små volum/masse biologiske prøver. Den beskrevne optimaliseringen av Zn måling gjør anvendelsen av denne metoden enkel og garanterer ideelle analytiske forhold. Her, ved hjelp av GF-AAS, bestemte vi konsentrasjonen av Zn i hele celler, og i cytosolic og kjernefysiske fraksjoner, fra ulike cellelinjer. Resultatene viser at denne teknikken gjengir sammenlignes med de som oppnås ved fluorescerende sonder og ICP-MS. For eksempel, flere f...

Overgang og tungmetaller, slik som Zn, Cu, MN, og Fe, finnes naturlig i miljøet i både næringsstoffer i mat og forurensning. Alle levende organismer krever forskjellige mengder av disse mikronæringsstoffer; eksponering for høye nivåer er imidlertid skadelige for organismer. Metall oppkjøp er hovedsakelig gjennom dietten, men metaller kan også inhalert eller absorberes gjennom huden1,2,3,4,5. Det er viktig å merke seg at tilstedeværelsen av metaller i atmosfæriske partikler er økende og har vært i stor grad forbundet med helserisiko. På grunn av menneskeskapte aktiviteter har det blitt påvist økte nivåer av tungmetaller som AG, som, CD, CR, HG, ni, fe og Pb i atmosfæriske partikler, regnvann og jord6,7. Disse metaller har potensial til å konkurrere med essensielle fysiologiske sporelementer, spesielt Zn og Fe, og de induserer toksiske effekter av inaktivere grunnleggende enzymer for biologiske prosesser.
Trace element Zn er Redox nøytral og oppfører seg som en Lewis Acid i biologiske reaksjoner, noe som gjør det til en grunnleggende kofaktor nødvendig for protein folding og katalysator i over 10% av pattedyr proteiner8,9, 10andre; Følgelig er det viktig for ulike fysiologiske funksjoner8,11. Men som mange sporstoffer, det er en delikat balanse mellom disse metaller tilrettelegge normal fysiologisk funksjon og forårsaker toksisitet. I pattedyr, Zn mangler føre til anemi, vekst retardasjon, hypogonadisme, hud unormalt, diaré, alopecia, smaksforstyrrelser, kronisk betennelse, og nedsatt immun-og nevrologiske funksjoner11,12, 13,14,15,16,17,18. I overkant er Zn cytotoksisk og hemmer absorpsjon av andre essensielle metaller som kobber19,20,21.
I tillegg har noen metaller som Cu og Fe potensial til å delta i skadelige reaksjoner. Produksjon av reaktive oksygen arter (ros) via Fenton kjemi kan forstyrre monteringen av jern svovel klynge proteiner og endre lipid metabolisme22,23,24. For å hindre denne skaden, celler utnytte metall-binding chaperones og transportører for å hindre toksiske effekter. Utvilsomt, må metall homeostase være strengt kontrollert for å sikre at bestemte celletyper opprettholde riktig nivå av metaller. Av denne grunn er det et betydelig behov for å fremme teknikker for nøyaktig måling av spor metaller i biologiske prøver. I utvikling og modne organismer finnes det en differensial biologisk behov for sporstoffer på cellenivå, på ulike utviklingsmessige stadier, og i normale og patologiske tilstander. Derfor nøyaktig bestemmelse av vev og systemiske metall nivåer er nødvendig for å forstå organismal metall homeostase.
Grafitt Furnace Atomic absorpsjon massespektrometri (GF-AAS) er en svært følsom teknikk som brukes for små prøve volumer, noe som gjør det ideelt å måle overgangen og tungmetaller tilstede i biologiske og miljømessige prøver25,26 , 27 andre priser , 28. videre, på grunn av høy følsomhet av teknikken, har det vist seg å være hensiktsmessig for å studere de fine transport egenskapene til na+/K+-ATPase og mage H+/K+-ATPase ved hjelp av Xenopus oocytter som modell system29. I GF-AAS, de atomized elementene i et utvalg absorberer en bølgelengde av stråling som slippes ut av en lyskilde som inneholder metall av interesse, med absorbert stråling proporsjonal med konsentrasjonen av elementet. Elemental elektronisk eksitasjon finner sted ved absorpsjon av ultrafiolett eller synlig stråling i en kvantisert prosess som er unik for hvert grunnstoff. I en enkelt elektron prosess innebærer opptaket av et foton et elektron som beveger seg fra et lavere energi nivå til et høyere nivå i Atom-og GF-AAS bestemmer mengden av fotoner som absorberes av prøven, som er proporsjonal med antall strålings absorberende elementer atomized i grafitt røret.
Selektivitet av denne teknikken er avhengig av den elektroniske strukturen av atomer, der hvert element har en bestemt absorpsjon/utslipp Spectral linje. I tilfelle av Zn, den absorbansen bølgelengde er 213,9 NM og kan være nøyaktig skilles fra andre metaller. Overall, GF-AAS kan brukes til å kvantifisere Zn med tilstrekkelige grenser for deteksjon (LOD) og høy følsomhet og selektivitet25. Endringene i absorbert bølgelengde er integrert og presentert som topper energi absorpsjon på bestemte og isolerte bølgelengder. Konsentrasjonen av Zn i en gitt prøve beregnes vanligvis fra en standard kurve av kjente konsentrasjoner i henhold til Beer-Lambert-loven, hvor absorbansen er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av Zn i prøven. Men å anvende Beer-Lambert-ligningen på GF-AAS-analyser viser også noen komplikasjoner. Variasjoner i forstøvning og/eller ikke-homogene konsentrasjoner av prøvene kan for eksempel påvirke metall målingene.
Metall forstøvning som kreves for GF AAS sporings element analyse består av tre grunnleggende trinn. Det første trinnet er desolvation, hvor det flytende løsemiddel er fordampet; forlater tørre forbindelser etter at ovnen når en temperatur på rundt 100 ° c. Deretter blir forbindelsene fordampet ved å varme dem fra 800 til 1 400 ° c (avhengig av elementet som skal analyseres) og bli en gass. Til slutt er forbindelsene i gass-staten atomized med temperaturer som spenner fra 1 500 til 2 500 ° c. Som diskutert ovenfor, vil økende konsentrasjoner av et metall av interesse gjengi proporsjonal økning på absorpsjon oppdages av GF-AAS, men ovnen reduserer det dynamiske spekteret av analyser, som er den arbeider spekter av konsentrasjoner som kan bestemmes av instrumentet. Således krever teknikken lave konsentrasjoner og en forsiktig bestemmelse av det dynamiske spekteret av metoden ved å bestemme LOD og grensen for linearitet (LOL) av Beer-Lambert lov. Den LOD er det minste antallet som kreves for en substans som skal oppdages, definert som tre ganger standardavviket for Zn i matrisen. Den LOL er den maksimale konsentrasjon som kan oppdages ved hjelp av Beer-Lambert lov.
I dette arbeidet beskriver vi en standard metode for å analysere nivåene av Zn i hele celle ekstrakter, cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner, og i voksende og differensiere kulturperler celler (figur 1). Vi tilpasset den raske isolering av kjerner protokollen til ulike cellulære systemer for å hindre metall tap under prøveforberedelse. Den cellulære modeller som brukes var primære myoblasts avledet fra musen satellitt celler, murine neuroblastom celler (N2A eller Neuro2A), murine 3T3 L1 adipocytter, en menneskelig ikke-tumorigene bryst epitel cellelinje (MCF10A), og epitel Madin-Darby canine nyre ( MDCK)-celler. Disse cellene ble etablert fra ulike linjene og er gode modeller for å undersøke avstamning spesifikke variasjoner av metall nivåer in vitro.
Primær myoblasts avledet fra mus satellitt celler utgjør en godt egnet in vitro modell for å undersøke skjelettlidelser muskel differensiering. Spredning av disse cellene er rask når kultivert under høye serum forhold. Differensiering i muskel avstamning blir deretter indusert av lavt serum forhold30. Den murine neuroblastom (N2A) etablerte cellelinje ble avledet fra musen neural Crest. Disse cellene presentere neuronal og Amoeboid stilk cellen morfologi. Ved differensiering stimulans, de N2A cellene presentere flere egenskaper av neurons, som neurofilamenter. N2A celler brukes til å etterforske Alzheimers sykdom, neurite utvekst, og nevrotoksisitet31,32,33. Den 3T3-L1 murine pre-adipocytter etablerte cellelinjen er vanligvis brukes til å undersøke metabolske og fysiologiske endringer forbundet med adipogenesis. Disse cellene presentere en Fibroblast-lignende morfologi, men når stimulert for differensiering, presenterer de enzymatisk aktivering forbundet med lipid syntese og triglyserider akkumulering. Dette kan observeres som morfologiske endringer for å produsere cytoplasmatiske lipid dråper34,35. MCF10A er en ikke-tumor bryst epitel cellelinje avledet fra en premenopausale kvinne med bryst fibrocystic sykdom36. Det har vært mye brukt for biokjemiske, molekylær, og cellulære studier knyttet til brystkreft som spredning, celle migrasjon, og invasjon. Den Madin-Darby canine nyre (MDCK) epitel cellelinjen har blitt mye brukt til å undersøke egenskaper og molekylære hendelser knyttet til etablering av epitel fenotype. Ved å nå samløpet, disse cellene blir polarisert og etablere celle-celle adhesjon, egenskaper av pattedyr epitel vev37.
For å teste AAS evne til å måle nivåene av Zn i pattedyrceller, analyserte vi hele og subcellulære fraksjoner (stoffer og nucleus) av disse fem cellelinjene. AAS-målinger viste ulike konsentrasjoner av Zn i disse celle typene. Konsentrasjonen var lavere i voksende og differensiering primære myoblasts (4 til 7 nmol/mg protein) og høyere i de fire etablerte cellelinjer (alt 20 til 40 nmol/mg protein). En liten ikke-signifikant økning i Zn nivåer ble påvist i å skille primære myoblasts og neuroblastom celler i forhold til voksende celler. Den motsatte effekten ble påvist i differensiert adipocytter. Men voksende 3T3-L1-celler viste høyere konsentrasjoner av metallet sammenlignet med differensiert celler. Viktigere, i disse tre cellelinjer, subcellulære fraksjonering viste at Zn er differensielt distribueres i stoffer og kjernen i henhold til metabolsk tilstand av disse cellene. For eksempel, i voksende myoblasts, N2A celler, og 3T3-L1 pre-adipocytter, et flertall av metallet er lokalisert til kjernen. Ved induksjon av differensiering ved hjelp av spesifikke celle behandlinger, Zn lokalisert til stoffer i disse tre celletyper. Interessant, viste både epitel cellelinjer høyere nivåer av Zn under spredning sammenlignet med når samløpet, der en karakteristisk stram monolag ble dannet. I voksende epitelceller, bryst cellelinjen MCF10A hadde en lik Zn fordeling mellom stoffer og kjernen, mens i nyre-avledet cellelinje, det meste av metallet var plassert i kjernen. I disse to celle typene, da cellene nådde samløpet, var Zn overveiende lokalisert til stoffer. Disse resultatene viser at GF-AAS er en svært følsom og nøyaktig teknikk for å utføre elementær analyse i lav kapasitets prøver. GF-AAS kombinert med subcellulære fraksjonering og kan tilpasses for å undersøke nivåene av sporstoffer metall elementer i ulike cellelinjer og vev.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1005706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brg1-antibody (G7)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnologies</td>
			<td>sc-17796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti b-tubulin-antibody (BT7R)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-16308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidemal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>51300044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid (HNO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM (Reduced Serum Media)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol (Collagen)</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retionic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648469-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 &#181;g/mL, 2% HNO3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Established Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3-L1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CL-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDK</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Absortion spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Aanalyst 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagnode</td>
			<td>UCD-200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells

Overgangs metaller er essensielle mikronæringsstoffer for organismer, men kan være giftig for celler ved høye konsentrasjoner ved å konkurrere med fysiologiske metaller i proteiner og generere Redox stress. Patologiske tilstander som fører til tømming av metall eller akkumulering er årsakssammenheng mellom ulike menneskelige sykdommer. Noen eksempler er anemi, acrodermatitis enteropathica, og Wilson ' s og Menkes ' sykdommer. Det er derfor viktig å være i stand til å måle nivåene og transport av overgangs metaller i biologiske prøver med høy følsomhet og nøyaktighet for å gjøre det lettere å undersøke hvordan disse elementene bidrar til normale fysiologiske funksjoner og Toksisitet. Sink (Zn), for eksempel, er en kofaktor i mange pattedyr proteiner, deltar i signalering hendelser, og er en sekundær Messenger i cellene. I overkant, Zn er giftig og kan hemme absorpsjon av andre metaller, mens i underskudd, kan det føre til en rekke potensielt dødelige forhold.

Grafitt ovn Atomic absorpsjon spektroskopi (GF-AAS) gir en svært følsom og effektiv metode for å bestemme Zn og andre overgangen metall konsentrasjoner i ulike biologiske prøver. Elektrotermiske forstøvning via GF-AAS kvantifiserer metaller ved Forstøvende små mengder av prøver for påfølgende selektiv absorpsjon analyse ved hjelp av bølgelengde av eksitasjon av elementet av interesse. Innenfor rammene av linearitet av Beer-Lambert Law, er absorbansen av lys av metallet direkte proporsjonal med konsentrasjonen av analytt. Sammenlignet med andre metoder for å bestemme Zn innhold, oppdager GF-AAS både frie og complexed Zn i proteiner og muligens i små intracellulære molekyler med høy følsomhet i små prøve volumer. Dessuten er GF-AAS også lettere tilgjengelig enn Induktivt kombinerte plasma masse massespektrometri (ICP-MS) eller Synchrotron røntgen fluorescens. I denne metoden beskrives den systematiske prøve forberedelsen av ulike kulturperler for analyser i en GF-AAS. Variasjoner i dette sporet element ble sammenlignet i både hele cellen lysater og subcellulære fraksjoner av voksende og differensiert celler som bevis på prinsippet.

Vi testet GF-AAS evne til å påvise minutt nivåer av Zn i pattedyrceller (figur 1). Derfor, vi kultivert primære myoblasts avledet fra musen satellitt celler, og de etablerte cellelinjer N2A (neuroblastom avledet), 3T3 L1 (adipocytter), MCF10A (bryst epitel), og MDCK celler (hund nyre epitel). Først isolerte vi hele celle, cytosolic, og kjernefysiske fraksjoner av alle disse celletyper og evaluert renheten av fraksjoner av Western Blot (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomic absorbansen spektroskopi å måle intracellulære zinc Pools i pattedyrceller

Kultivert primære eller etablerte cellelinjer er ofte brukt til å ta grunnleggende biologiske og mekanistisk spørsmål som en første tilnærming før du bruker dyremodeller. Denne protokollen beskriver hvordan man skal tilberede hele celle ekstrakter og subcellulære fraksjoner for studier av sink (Zn) og andre sporstoffer med Atomic absorbansen spektroskopi.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Overgangsmetallenes rolle i pattedyrutviklingen er i stor grad undervurdert. Nye bevis viser at metall homeostase fortsetter å endre seg i henhold til utviklingsstadiet av celler og vev. Videre er de spesifikke cellulære destinasjonene av metaller også varianter i utvikling, og selvfølgelig er det utfordrende å identifisere deres plassering.Til dags dato har ulike analytiske teknikker blitt utviklet for å kvantifisere metaller, men de fleste er dyre eller utilgjengelige. Intensiv forskning er fokusert på å forbedre metallbestemmelser på en mer tilgjengelig og effektiv måte. Grafitt ovn atomabsorpsjon spektroskopi, GF-AAS, har to hovedfordeler.Det gir lave begrensninger for deteksjon for sink, noe som åpner for nøyaktig sporsinkanalyse. Det er også en teknikk som ikke krever høye mengder prøve, mikroliter av løsning har en tendens til å være nok til å utføre analysen. Kombinasjonen av disse to fordelene gjør GF-AAS ideell for å analysere sporstoffer i lavvolumprøver.Flere menneskelige patologiske forhold er relatert til metall misbalanser. Noen eksempler er anemi, akrodermatitt enteropatiske, og Wilsons og Menkes'sykdommer. Derfor er det viktig å utvikle effektive og pålitelige metoder for å måle nivåene av overgangsmetaller i biologiske prøver med høy følsomhet og nøyaktighet.GF-AAS er et utmerket eksempel på en teknologi som letter en bestemmelse av et gitt metall under normale fysiologiske forhold, og i patogene tilfeller. Metoden er svært allsidig. Det kan brukes på mange systemer og mange elementer kan være analyse ved hjelp av GF-AAS.Utfordringene er å etablere metodegrensen for deteksjon i virkeligheten, og sørge for at prøvene faller innenfor denne grensen. Gitt det faktum at volumet av prøver er lavt, er det ikke mye rom for testing, så nøye undersøkelse av data må finne sted siden begynnelsen. Etter den første analysen av prøver må vi fastslå hva som er fortynningsfaktoren som trengs for å bringe prøvene til de grensene som kreves for kvantifisering.Pass på at du er i stand til å fraksjonere kjernene riktig før du går til AAS. Vestlige flekker er alltid god validering før den spektroskopiske analysen. Mens GF-AAS krever lave volumer, intracellulære bassenger er i lave volumer allerede.Det gir lite rom for testing. De første målingene må gjøres nøye og undersøkes, slik at prøvebehandling kan minimeres til bare én fortynningsfaktor. Til å begynne, kultur cellene av interesse i 55 kvadratcentimeter plater.Bruk en vakuumfelle til å aspirere kulturmediene. Pass på å fjerne alle spor av medier. Bruk iskald PBS uten kalsium og magnesium for å skylle cellene fra de ønskede tidspunktene, eller kulturforholdene, tre ganger.Tilsett deretter en milliliter iskald PBS til platen, og skrap cellene av platen. Overfør cellesuspensjonene til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og hold den på is. Sentrifuge i 10 sekunder ved 10 000 ganger G, og fjern supernatanten ved aspirasjon.Hvis metallanalyse av cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner er ønsket, gjenbruke cellepelleten i 400 mikroliter iskalde PBS som inneholder 0,1% NP-40, et ikke-ionisk vaskemiddel. Overfør 100 mikroliter til et nytt mikrocentrifugerør som hele celleprøven, og oppbevar det på minus 20 grader celsius. For å isolere kjerner, bruk en P1000 mikropipettespiss til å pipette den 400 mikroliters cellefjæringen opp og ned fem til 10 ganger på is.Deretter trekker du ut fem mikroliter av cellefjæringen og overfører den til et mikroskopglasssklie. Plasser de fem mikroliter under et lett mikroskop ved hjelp av et 40 ganger mål for å verifisere kjerneintegriteten. Sentrifuger de resterende 395 mikroliters cellelylatfjæringen i 10 sekunder ved 10.000 ganger G.Overfør supernatanten som inneholder cytosolisk fraksjon til et nytt mikrocentrifugerør.Deretter legger du til 500 mikroliter av PBS som inneholder 0,1% NP-40 for å skylle pelleten med atomfraksjonen, og sentrifuge i 10 sekunder ved 10 000 ganger G.Fjern supernatanten, og gjenoppuspend pelleten som inneholder kjernene i 100 mikroliter av samme løsning. For å lyse cellene, bruk en Bioruptor til å sonikere hele cellen og kjernene som inneholder løsning tre ganger, hver i fem minutter. Fortsett å utføre kvalitetskontroll av renheten av fraksjonene av vestlige blot, ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for enten kjernefysiske eller cytosoliske fraksjoner.Først legger du til et likt volum konsentrert salpetersyre av spormetallkvalitet til hele cellen, cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner som inneholder 100, 500 og 100 mikroliter cellesusus i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og legg dem i en termisk blokk ved 80 grader celsius for å mineralisere cellekulturen i en time. Deretter tar du ut rørene fra den termiske blokken og plasserer dem i et stativ for å fortsette syrefordøyelsen over natten ved 20 grader celsius. Stopp reaksjonen ved å legge til 30% av prøvevolumet av hydrogenperoksid.Ta prøvevolumet til 500 mikroliter med 18 mega Ohm renset vann. Deretter, i en 15 milliliter Falcon tube fortynne analytisk klasse standard nitrogenoksid i renset vann på 18 mega Ohms å forberede to volum prosent salpetersyre løsning som den tomme løsningen under kalibrering. Deretter bruker du den to volum prosentvis salpetersyreløsningen til å fortynne en kommersielt tilgjengelig 1000 ppm sinklagerløsning med en konsentrasjon på 1000 deler per milliard.Forbered fungerende standardløsninger fra 1000 del per million sinkstandardløsning, 1, 000 del per milliard løsning, og fortynne den deretter til 5, 8, 10, 15, 20 og 25 ppb direkte med 2 volum prosent salpetersyreløsning. Legg en milliliter på 0,1% magnesiumnitratmatrisemodifikator i polypropylenprøvekopper, og last deretter koppene inn i autosamplerkarusellen. Programmer atomabsorpsjonsspektrometeret for automatisk å legge til fem mikroliter av matrisemodifikatoren til sinkstandarder og det tomme.Sett den samme optimaliserte tilstanden på atomabsorpsjonsspektrometeret for standardløsningene og prøvene, med introduksjonsstrømningshastighet på 250 milliliter per minutt, injeksjonstemperatur ved 20 grader celsius, og grafittovnstemperaturen når 1800 grader celsius i fire trinns prosesser. Alle standarder og prøver av et enkelt eksperiment bør måles samtidig for å unngå feil på grunn av kalibreringsforskjeller eller fordampning. Optimaliser lampen C-HCL til en strøm på 20 ampere, bølgelengde på 213,9 nanometer og sliss på 0,7 nanometer.Pipette prøvene i polypropylen prøvekopper, og plasser dem i autosamplerkarusellen. Den nedre grensen for påvisning av sink er 0,01 deler per milliard. Ved å øke konsentrasjonen av standardene, er den øvre grensen for påvisning av sink fastslått å være 20 deler per milliard.Etter at en sinkstandardkurve er oppnådd, måler du de mineraliserte prøvene for å bestemme metallinnhold. Hvis de oppnådde dataene er utenfor deteksjonsgrensen, fortynne prøvene med 18 mega Ohm renset vann behandlet med 0,1% analytisk grad salpetersyre. I denne raske isolasjonen av kjerneprotokollen viser en representativ vestlig flekk fra differensiering av primære myoblaster renheten av subcellulære fraksjoner.Kromatin remodeler enzymet Brg1 ble brukt til å identifisere kjernefysisk fraksjon, og tubulin ble brukt til å identifisere cytosolisk fraksjon. Denne figuren viser representative lysmikrografer for spredning og differensiert eller samtidige monolayers av hver celletype, og tilsvarende sinkinnhold i hele celleekstrakter, cytosoliske og kjernefysiske fraksjoner. Alle cellelinjene som ble analysert i denne studien viste sinkkonsentrasjoner i nanomolarområdet.Differensierte primære myotubes viste høyere nivåer av sink enn proliferating celler. En lignende subcellulær fordeling av sink ble påvist i neuroblastomavledet cellelinje N2A. På den annen side viste den etablerte 3T3-L1 cellelinjen høyere nivåer av sink når pre-adipocytes var proliferating enn når de ble indusert eller differensiert.MCF10A-celler viste like nivåer av sink mellom cytosoliske og kjernefysiske fraksjoner i proliferaterende celler. Når MCF10A-cellene når samløpet, ble det påvist en 40 % reduksjon i helcellesinknivåer, og metallet ble funnet å være mest konsentrert i den cytosoliske fraksjonen. Grafitt ovn atomabsorpsjon spektrometri er en svært følsom teknikk for å måle overgang og tungmetaller i biologiske og miljømessige prøver.Spesiell forsiktighet og renslighet i utarbeidelsen av subcellulære fraksjoner bør tas, da minimal forurensning sannsynligvis vil forstyrre analysen, på grunn av utstyrets følsomhet. Gitt de lave volumene og spornivåene av metaller i hvert eksperiment, er det vanskelig å tenke på en bedre og mer nøyaktig teknikk for å måle sink enn GF-AAS. Det er ingen gjeldende teknikker som kan gi grensene for deteksjon og lavt volum som kreves til relativt lave kostnader for GF-AAS.Grafitt ovn atomabsorpsjon spektrometri er nøyaktig, følsom, kostnadseffektiv, og tilgjengelig. Denne analytiske teknikken vil fortsette å forbedre seg etter hvert som elementære deteksjonsteknologier fortsetter å utvikle seg. Fremtidig anvendelse for påvisning av sink og andre metaller av GF-AAS vil omfatte organer, vev hentet fra dyremodeller, og biopsier fra pasienter med sykdom forbundet med systemiske metall ubalanser.Salpetersyre er en ekstremt korroderende syre som kan forårsake alvorlige kjemiske forbrenninger veldig raskt. Dette kjemikaliet kan også reagere voldsomt med visse forbindelser som metallisk pulver. På grunn av faren ved salpetersyre, er det viktig å ta strenge sikkerhetstiltak når du håndterer salpetersyre.Ved håndtering av salpetersyre anbefaler vi på det sterkeste at du bruker vernebriller, ansiktsskjerm for sprutbeskyttelse, hansker og godkjent dampånding hvis ventilasjonen ikke er tilstrekkelig.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomic skala strukturelle studier av Macromolecular samlinger av Solid-state kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Tvinge spektroskopi enkelt Protein molekyler med en Atomic Force mikroskopet

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

En strategi for å identifisere forbindelser som påvirker Cell vekst og overlevelse i kultivert pattedyrceller ved lav-til-moderat gjennomstrømming

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Tetthet gradient ultracentrifugation for å undersøke endokytisk resirkulering i pattedyrceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi for å studere proteinproteininteraksjon og proteindynamikk i levende celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Rensing av allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Indre mitokondriemembranfølsomhet overfor Na+ avslører delvis segmenterte funksjonelle coq-bassenger

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Oksygenuavhengige analyser for å måle mitokondriefunksjon hos pattedyr

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...