Name: atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av fakulteten Diversity Scholars Award från University of Massachusetts Medical School till T.P.-B. N.N.-T. stöds av SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N stöds av National Science Foundation Grant DBI 0959476. Författarna är tacksamma för Dr Daryl A. Bosco för att tillhandahålla N2A cellinjen och Daniella Cangussu för hennes tekniska support.

1. däggdjurs cells odling
<ol><li>Allmänna överväganden
	<ol>
<li>Följ aseptiska metoder för däggdjurs cell kultur tidigare granskat38.</li>
		<li>Behåll alla cellinjer i en befuktad 5% CO2 inkubator vid 37 ° c. Cell odlings förhållandena varierar för varje cell typ. Det är viktigt att upprätthålla lämpliga odlings förhållanden för varje cellinjen som används, eftersom variationer av dessa procedurer kommer att leda till avvikande fenotyper och fel...

Atomabsorptionsspektroskopi är en mycket känslig metod för bestämning av Zn i små volym/Mass biologiska prover. Den beskrivna optimeringen av Zn-mätningen gör tillämpningen av denna metod enkel och garanterar idealiska analytiska förhållanden. Här, med hjälp av GF-AAS, bestämde vi koncentrationen av Zn i hela celler, och i cytosoliskt och nukleära fraktioner, från olika cellinjer. Resultaten visar att denna teknik gör jämförbar med den som erhålls genom fluorescerande sonder och ICP-MS. Till exempel vi...

Över gången och tung metaller, såsom Zn, Cu, mn, och FE, finns naturligt i miljön i både näringsämnen i livsmedel och föroreningar. Alla levande organismer kräver olika mängder av dessa mikronäringsämnen; exponering för höga halter är emellertid skadlig för organismer. Metall förvärv är främst genom kosten, men metaller kan också inhaleras eller absorberas genom huden1,2,3,4,5. Det är viktigt att notera att närvaron av metaller i atmosfäriska partiklar ökar och har till stor del för knippas med hälso risker. På grund av antropogena aktiviteter har ökade nivåer av tung metaller såsom AG, as, CD, CR, Hg, ni, Fe och PB upptäckts i atmosfäriska partiklar, regn vatten och jord6,7. Dessa metaller har potential att konkurrera med essentiella fysiologiska spår ämnen, särskilt Zn och FE, och de inducerar toxiska effekter genom att inaktivera grundläggande enzymer för biologiska processer.
Spår elementet Zn är redoxneutral och fungerar som en Lewis-syra i biologiska reaktioner, vilket gör den till en grundläggande kofaktor som är nödvändig för protein vikning och katalytisk aktivitet i över 10% av däggdjurs proteiner8,9, och 10; Därför är det viktigt för olika fysiologiska funktioner8,11. Men liksom många spår ämnen, det finns en känslig balans mellan dessa metaller som underlättar normal fysiologisk funktion och orsakar toxicitet. Hos däggdjur, Zn brister leda till anemi, tillväxthämning, hypogonadism, hud avvikelser, diarré, alopeci, smak rubbningar, kronisk inflammation, och nedsatt immun försvar och neurologiska funktioner11,12, 13,14,15,16,17,18. I överskott är Zn cytotoxiskt och försämrar absorptionen av andra essentiella metaller som koppar19,20,21.
Dessutom, vissa metaller som Cu och FE har potential att delta i skadliga reaktioner. Produktion av reaktiva syreradikaler (ros) via Fenton kemi kan störa monteringen av järn svavel kluster proteiner och ändra lipidmetabolismen22,23,24. För att förhindra denna skada, celler utnyttja metall-bindande Chaperones och transportörer för att förhindra toxiska effekter. Utan tvekan, metall homeostas måste vara hårt kontrollerad för att säkerställa att specifika cell typer upprätthålla korrekt nivåer av metaller. Av denna anledning finns det ett betydande behov av att avancera tekniker för noggrann mätning av spår metaller i biologiska prover. Vid utveckling och mogna organismer finns det ett Differentiellt biologiskt behov av spår ämnen på cell nivå, vid olika utvecklingsstadier, och under normala och patologiska förhållanden. Därför är exakt bestämning av vävnad och systemisk metall nivåer krävs för att förstå organismers metall homeostas.
Grafit ugnen atomabsorptionsspektrometri (GF-AAS) är en mycket känslig teknik som används för små prov volymer, vilket gör den idealisk för att mäta över gången och tung metaller som finns i biologiska och miljömässiga prover25,26 , den 27 , 28. på grund av den höga känsligheten hos tekniken har det visat sig lämpligt att studera de fina transport egenskaperna hos na+/K+-ATPas och gastric H+/K+-ATPas med Xenopus oocyter som modell system29. I GF-AAS absorberar de atomiserade elementen i ett prov en våglängd av strålning som avges av en ljus källa som innehåller metall av intresse, med den absorberade strålningen proportionell mot koncentrationen av elementet. Elementär elektronisk excitation sker vid absorption av ultraviolett eller synlig strålning i en kvantiserad process som är unik för varje kemiskt grundämne. I en enda elektron process innebär absorptionen av en fotonen en elektron som rör sig från en lägre energi nivå till högre nivå inom Atomen och GF-AAS bestämmer mängden fotoner som absorberas av provet, vilket står i proportion till antalet strålabsorberande element som är atomiserade i grafit röret.
Selektiviteten i denna teknik bygger på den elektroniska strukturen av atomerna, där varje element har en specifik absorption/emission spektrallinje. När det gäller Zn är absorbansvåglängderna 213,9 nm och kan skilja sig exakt från andra metaller. Sammantaget kan GF-AAS användas för att kvantifiera Zn med adekvata detektions gränser (LOD) och hög känslighet och selektivitet25. Förändringarna i absorberad våglängd är integrerade och presenteras som toppar av energiabsorption vid specifika och isolerade våg längder. Koncentrationen av Zn i ett givet prov beräknas vanligen utifrån en standard kurva över kända koncentrationer enligt Beer-Lambert-lagen, i vilken absorbansen är direkt proportionell mot koncentrationen av Zn i provet. Men att tillämpa Beer-Lambert ekvationen till GF-AAS analyser uppvisar också vissa komplikationer. Till exempel kan variationer i atomisering och/eller icke-homogena koncentrationer av proverna påverka metall mätningar.
Den metall atomisering som krävs för GF AAS spår elementär analys består av tre grundläggande steg. Det första steget är desolvation, där vätskan lösnings medlet är avdunsta; lämnar torra föreningar efter ugnen når en temperatur på cirka 100 ° c. Sedan, föreningarna förångas genom att värma dem från 800 till 1 400 ° c (beroende på elementet som skall analyseras) och bli en gas. Slutligen, föreningarna i det gasformiga tillståndet är atomiserade med temperaturer som sträcker sig från 1 500 till 2 500 ° c. Som diskuterats ovan, ökande koncentrationer av en metall av intresse kommer att göra proportionella ökningar på absorptionen upptäcks av GF-AAS, men ugnen minskar det dynamiska omfånget av analys, vilket är den arbets område av koncentrationer som kan bestäms av instrumentet. Således kräver tekniken låga koncentrationer och en noggrann bestämning av det dynamiska omfånget av metoden genom att bestämma LOD och gräns för linearitet (LOL) av Beer-Lambert lag. LOD är den minsta mängd som krävs för att ett ämne ska kunna detekteras, definierat som tre gånger standard avvikelsen för Zn i matrisen. Den LOL är den maximala koncentrationen som kan detekteras med hjälp av Beer-Lambert lag.
I detta arbete beskriver vi en standard metod för att analysera halterna av Zn i hela cell extrakt, cytoplasmatiska och nukleära fraktioner, och i att proliferera och differentiera odlade celler (figur 1). Vi anpassade den snabba isoleringen av nuklei-protokoll till olika cellulära system för att förhindra metall förlust under prov beredning. De cellulära modeller som används var primära myoblaster härrör från mus satellit celler, murina neuroblastom celler (N2A eller Neuro2A), murina 3T3 L1 adipocyter, en mänsklig icke-tumorigenic bröst epitelial cellinjen (MCF10A), och epitelial madin-Darby hundnjure ( MDCK)-cellerna. Dessa celler bildades från olika linjer och är bra modeller för att undersöka härstamning specifika variationer av metall nivåer in vitro.
Primära myoblaster som härrör från mus satellit celler utgör en väl lämpad in vitro -modell för att undersöka skelett muskel differentiering. Proliferation av dessa celler är snabb när odlade under höga serum förhållanden. Differentiering i den muskulösa härstamning framkallas därefter av låga serum villkorar30. Den murina neuroblastom (N2A) etablerade cellinjen härstammar från mus neurala Crest. Dessa celler presenterar neuronala och amöbiska stamcells morfologi. Vid differentiering stimulans, den N2A celler presentera flera egenskaper av nerv celler, såsom neurofilament. N2A celler används för att undersöka Alzheimers sjukdom, neurit utväxt, och neurotoxicitet31,32,33. Den 3T3-L1 murina pre-adipocyter etablerade cellinjen används ofta för att undersöka de metabola och fysiologiska förändringar i samband med adipogenesis. Dessa celler presentera en fibroblast-liknande morfologi, men en gång stimuleras för differentiering, de presenterar enzymatisk aktivering i samband med lipid syntes och triglycerider ackumulering. Detta kan observeras som morfologiska förändringar för att producera cytoplasmatiska lipiddroppar34,35. MCF10A är en icke-tumör bröst epitelial cellinjen härrör från en premenopausala kvinna med bröst Fibrocystisk sjukdom36. Det har använts flitigt för biokemiska, molekyl ära och cellulära studier relaterade till bröstcancercarcinogenes såsom proliferation, cell migration, och invasion. Den Madin-Darby hundnjure (MDCK) epitelial cellinjen har i stor utsträckning använts för att undersöka egenskaper och molekyl ära händelser i samband med inrättandet av epitelial fenotyp. När de når sammanflödet, blir dessa celler polariserade och etablera cell-cell sammanväxningar, egenskaper hos däggdjurs epitelial vävnader37.
För att testa förmågan hos AAS att mäta nivåerna av Zn i däggdjurs celler, analyserade vi hela och subcellulära fraktioner (Cytosol och kärna) av dessa fem cellinjer. AAS mätningar visade olika koncentrationer av Zn i dessa cell typer. Koncentrationerna var lägre i prolifererande och differentierande primära myoblaster (4 till 7 nmol/mg protein) och högre i de fyra etablerade cellinjerna (allt från 20 till 40 nmol/mg protein). En liten icke-signifikant ökning av Zn-nivåer upptäcktes för att differentiera primära myoblaster och neuroblastom celler jämfört med prolifererande celler. Motsatt effekt upptäcktes i differentierade adipocyter. Men, prolifererande 3T3-L1 celler uppvisade högre koncentrationer av metallen jämfört med differentierade celler. Viktigt, i dessa tre cellinjer, subcellulär fraktionering visade att Zn är differentially distribueras i cytosolen och kärnan enligt metaboliska tillstånd av dessa celler. Till exempel, i prolifererande myoblaster, N2A celler, och 3T3-L1 pre-adipocyter, en majoritet av metallen är lokaliserad till kärnan. Vid induktion av differentiering med hjälp av specifika cell behandlingar, Zn lokaliserad till cytosolen i dessa tre cell typer. Intressant, båda epitelial cellinjer visade högre nivåer av Zn under proliferation jämfört med när når sammanflödet, där en karakteristisk tight enskiktslager bildades. I prolifererande epitelceller, bröst cellen linje MCF10A hade en lika Zn fördelning mellan Cytosol och kärna, medan i njurederiverade cellinjen, de flesta av metallen var placerad i kärnan. I dessa två cell typer, när cellerna nådde sammanflödet, var Zn huvudsakligen placerad till cytosolen. Dessa resultat visar att GF-AAS är en mycket känslig och noggrann teknik för att utföra elementär analys i lågavkastande prover. GF-AAS i kombination med subcellulär fraktionering och kan anpassas för att undersöka nivåerna av spår metall element i olika cellinjer och vävnader.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1005706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brg1-antibody (G7)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnologies</td>
			<td>sc-17796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti b-tubulin-antibody (BT7R)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-16308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidemal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>51300044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid (HNO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM (Reduced Serum Media)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol (Collagen)</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retionic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648469-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 &#181;g/mL, 2% HNO3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Established Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3-L1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CL-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDK</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Absortion spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Aanalyst 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagnode</td>
			<td>UCD-200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells

Över gångs metaller är essentiella mikronäringsämnen för organismer men kan vara giftiga för celler vid höga koncentrationer genom att konkurrera med fysiologiska metaller i proteiner och generera Redox stress. Sjukdoms tillstånd som leder till metall utarmning eller ackumulering är kausala smittämnen av olika mänskliga sjukdomar. Några exempel är anemi, acrodermatitis enteropathica, och Wilsons och Menkes ' sjukdomar. Det är därför viktigt att kunna mäta nivåerna och transporten av över gångs metaller i biologiska prover med hög känslighet och noggrannhet för att under lätta forskning om hur dessa faktorer bidrar till normala fysiologiska funktioner och Toxicitet. Zink (Zn), till exempel, är en kofaktor i många däggdjurs proteiner, deltar i signalering händelser, och är en sekundär bud bärare i celler. I överskott, Zn är giftigt och kan hämma absorptionen av andra metaller, medan i underskott, det kan leda till en mängd potentiellt dödliga förhållanden.

Grafit ugnen atomabsorptionsspektroskopi (GF-AAS) ger en mycket känslig och effektiv metod för bestämning av Zn och andra över gångs metaller koncentrationer i olika biologiska prover. Elektrotermisk atomisering via GF-AAS kvantifierar metaller genom att Atomisera små mängder prover för efterföljande selektiv absorptionsanalys med hjälp av våglängd av excitation av elementet av intresse. Inom gränserna för den linearitet av Beer-Lambert lag, är absorbansen av ljus av metallen direkt proportionell mot koncentrationen av analyten. Jämfört med andra metoder för bestämning av Zn-halt detekterar GF-AAS både fri och komplex Zn i proteiner och möjligen i små intracellulära molekyler med hög känslighet i små prov volymer. Dessutom är GF-AAS också mer lättillgängligt än induktivt kopplad plasmasspektrometri (ICP-MS) eller synkrotronbaserad röntgenfluorescens. I denna metod beskrivs den systematiska prov beredningen av olika odlade cellinjer för analyser i en GF-AAS. Variationer i detta spår element jämfördes i både hela celllysat och subcellulära fraktioner av prolifererande och differentierade celler som bevis på principen.

Vi testade förmågan hos GF-AAS att detektera minut nivåer av Zn i däggdjurs celler (figur 1). Således odlade vi primära myoblaster som härrör från mus satellit celler, och den etablerade cellinjer N2A (neuroblastom härledd), 3T3 L1 (adipocyter), MCF10A (bröstepitel), och MDCK celler (hund njure epitel). Först isolerade vi hela cellen, cytosolic, och nukleära fraktioner av alla dessa cell typer och utvärderade renhet fraktioner av västra blot (<...

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomabsorptionsspektroskopi för att mäta intracellulära Zinkpooler i däggdjurs celler

Odlade primära eller etablerade cellinjer används ofta för att ta itu med grundläggande biologiska och mekanistiska frågor som en initial metod innan du använder djur modeller. Detta protokoll beskriver hur man förbereder hela cell extrakt och subcellulära fraktioner för studier av zink (Zn) och andra spår ämnen med atomabsorptionsspektroskopi.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Övergångsmetallernas roll i däggdjursutvecklingen är till stor del underskattad. Nya bevis visar att metall homeostas fortsätter att förändras enligt utvecklingsstadiet av celler och vävnader. Dessutom, de specifika cellulära destinationer av metaller också sort i utveckling, och naturligtvis, det är utmanande att identifiera deras plats.Hittills har olika analystekniker utvecklats för att kvantifiera metaller, men de flesta är dyra eller otillgängliga. Intensiv forskning är inriktad på att förbättra metallbestämningar på ett mer tillgängligt och effektivt sätt. Grafitugn atomabsorptionsspektroskopi, GF-AAS, har två huvudsakliga fördelar.Det ger låga gränser för detektion för zink, vilket möjliggör noggrann spår zink analys. Det är också en teknik som inte kräver stora volymer av prov, mikroliter av lösning tenderar att vara tillräckligt för att utföra analysen. Kombinationen av dessa två fördelar gör GF-AAS idealisk för att analysera spårämnen i lågvolymprover.Flera mänskliga patologiska tillstånd är relaterade till metall felbalanser. Några exempel är anemi, acrodermatitis enteropathica, och Wilsons och Menkes'sjukdomar. Därför är det viktigt att utveckla effektiva och tillförlitliga metoder för att mäta nivåerna av övergångsmetaller i biologiska prover med hög känslighet och noggrannhet.GF-AAS är ett utmärkt exempel på en teknik som underlättar en bestämning av varje given metall i normala fysiologiska förhållanden, och i patogena fall. Metoden är mycket mångsidig. Det kan tillämpas på många system och många element kan vara analys med hjälp av GF-AAS.Utmaningarna är att fastställa metoden gränsen för detektion i verkligheten, se till att proverna faller inom denna gräns. Med tanke på att volymen av prover är låg, det finns inte mycket utrymme för testning, så noggrant undersökning av data måste ske sedan början. Efter den första analysen av prover, måste vi fastställa vad som är den utspädningsfaktor som behövs för att få proverna till de gränser som krävs för kvantifiering.Var säker på att du har möjlighet att fractionate kärnorna ordentligt innan du går till AAS. Western blots är alltid bra validering före spektroskopisk analys. Medan GF-AAS kräver låga volymer, intracellulära pooler är i låga volymer redan.Det ger lite utrymme för testning. De första mätningarna måste göras noggrant och undersökas, så provbehandling kan minimeras till bara en utspädningsfaktor. Till att börja med kultur cellerna av intresse i 55 kvadrat centimeter plattor.Använd en vakuumfälla för att aspirera kulturmedierna. Var noga med att ta bort alla spår av media. Använd iskall PBS fri från kalcium och magnesium för att skölja cellerna från de önskade tidpunkterna, eller odlingsförhållanden, tre gånger.Tillsätt sedan en milliliter iskall PBS till plattan, och skrapa cellerna från plattan. Överför cellupphängningar till en 1,5 milliliter mikrocentrifug röret, och hålla den på is. Centrifugera i 10 sekunder vid 10, 000 gånger G, och ta bort supernatanten genom aspiration.Om metallanalys av cytoplasmatiska och nukleära fraktioner önskas, resuspend cell pelleten i 400 mikroliter av iskall PBS som innehåller 0,1%NP-40, en icke-joniska rengöringsmedel. Överför 100 mikroliter till ett nytt mikrocentrifugrör som hela cellprovet, och förvara det på minus 20 grader celsius. För att isolera kärnor, använd en P1000 mikropipett för att pipettera 400 mikrolitercellsupphängningen upp och ner fem till tio gånger på is.Sedan extrahera fem mikroliter av cellupphängningen och överföra den till ett mikroskop glasrutschkana. Placera de fem mikrolitererna under ett ljusmikroskop med hjälp av ett 40 gånger objektiv för att verifiera kärnornas integritet. Centrifugera den återstående 395 mikrolitercellen lysate suspension i 10 sekunder vid 10, 000 gånger G.Transfer den supernatant som innehåller cytosolic fraktionen till en ny microcentrifug röret.Därefter tillsätt 500 mikroliter av PBS som innehåller 0,1%NP-40 för att skölja pelleten med kärnfraktionen, och centrifug i 10 sekunder vid 10 000 gånger G.Ta bort supernatanten och respend pelleten som innehåller kärnorna i 100 mikroliter av samma lösning. För att lysa cellerna, använd en Bioruptor för att sonikera hela cellen och kärnor som innehåller lösning tre gånger, var och en i fem minuter. Fortsätt att utföra kvalitetskontroll av renheten hos fraktionerna av västra blot, med hjälp av antikroppar specifika för antingen den nukleära eller cytosolic fraktioner.Lägg först till en lika stor volym koncentrerad salpetersyra av spårmetallsort till hela cellen, cytoplasmatiska och nukleära fraktioner som innehåller 100, 500 och 100 mikroliters cell suspension i 1,5 milliliter mikrocentrifugrör, och placera dem i ett termiskt block på 80 grader celsius för att mineralisera cellkulturen i en timme. Efter det, ta ut rören från termiska blocket och placera dem i ett rack för att fortsätta syra matsmältningen över natten vid 20 grader celsius. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 30% av provvolymen av väteperoxid.Ta provvolymen till 500 mikroliter med 18 mega Ohm renat vatten. Därefter, i en 15 milliliter Falcon röret späda analyskvalitet standard kväveoxid i renat vatten vid 18 mega Ohm att förbereda två volym procent salpetersyra lösning som den tomma lösningen under kalibrering. Använd sedan den två volymprocents kvävesyralösningen för att späda ut en kommersiellt tillgänglig 1, 000 ppm zinkbeståndslösning med en koncentration på 1, 000 delar per miljard.Förbered arbetsstandardlösningar från 1, 000 delen per miljon zink standardlösning, den 1, 000 del per miljard lösning, späd sedan ut den till 5, 8, 10, 15, 20, och 25 ppb direkt med 2 volym procent salpetersyra lösning. Placera en milliliter av 0,1%magnesiumnitrat matrismoderatören i polypropylen prov koppar, och sedan ladda kopparna i autosampler karusell. Programmera atomabsorptionsspektrometern för att automatiskt lägga till fem mikroliter av matrismodifieraren till zinkstandarderna och blindprovet.Ställ in samma optimerade tillstånd på atomabsorptionsspektrometern för standardlösningarna och proverna, med introduktionsflödeshastighet på 250 milliliter per minut, injektionstemperatur vid 20 grader celsius och grafitugnstemperaturen når 1, 800 grader celsius i fyra stegsprocesser. Alla standarder och prover av ett enskilt experiment bör mätas samtidigt för att undvika misstag på grund av kalibreringsskillnader eller avdunstning. Optimera lampan C-HCL till en ström på 20 ampere, våglängd på 213,9 nanometer, och slits av 0,7 nanometer.Pipettera proverna i polypropylenprov koppar, och placera dem i autosampler karusellen. Den undre gränsen för detektion av zink är 0,01 delar per miljard. Genom att öka koncentrationen av standarderna, den övre gränsen för detektion av zink bestäms vara 20 delar per miljard.Efter att en zinkstandardkurva erhållits, mät de mineraliserade proverna för att bestämma metallhalten. Om de data som erhålls ligger utanför detektionsgränsen, späd proverna med 18 mega Ohm renat vatten som behandlats med 0,1%analysgrad salpetersyra. I denna snabba isolering av atomkärnor protokoll, en representativ västra blot från differentiera primära myoblasts visar renhet subcellulära fraktioner.Kromatin remodeler enzymet Brg1 användes för att identifiera kärnfraktionen, och tubulin användes för att identifiera den cytosoliska fraktionen. Denna figur visar representativa ljusmikrografer för prolifererande och differentierade eller konfluenta enskikt av varje celltyp, och motsvarande zinkhalt i hela cellextrakt, cytosoliska och nukleära fraktioner. Alla cellinjer som analyserades i denna studie visade zinkkoncentrationer i nanomolarområdet.Differentierade primära myotubes uppvisade högre nivåer av zink än proliferering celler. En liknande subcellulär fördelning av zink upptäcktes i neuroblastom härledda cellinje N2A. Å andra sidan uppvisade den etablerade 3T3-L1-cellinjen högre nivåer av zink när pre-adipocyterna prolifererade än när de inducerades eller differentierades.MCF10A celler visade lika nivåer av zink mellan cytosolic och nukleära fraktioner i prolifererande celler. När MCF10A celler når sammanflödet, en 40%minskning av hela cellen zink nivåer upptäcktes, och metallen konstaterades vara mest koncentrerade i cytosolic fraktionen. Grafitugnens atomabsorptionspektrometri är en mycket känslig teknik för att mäta övergång och tungmetaller i biologiska och miljömässiga prover.Särskild försiktighet och renlighet vid beredning av subcellulära fraktioner bör vidtas, eftersom minimal kontamination sannolikt kommer att störa analysen, på grund av utrustningens känslighet. Med tanke på de låga volymerna och spårnivåerna av metaller i varje experiment är det svårt att tänka sig en bättre och mer exakt teknik för att mäta zink än GF-AAS. Det finns inga nuvarande tekniker som kan ge de gränser för detektion och låg volym som krävs vid den relativt låga kostnaden för GF-AAS.Grafitugn atomabsorptionspektrometri är korrekt, känslig, kostnadseffektiv och tillgänglig. Denna analytiska teknik kommer att fortsätta att förbättras i och med att detekteringsteknik för elementära upptäckter fortsätter att avancera. Framtida tillämpning för detektion av zink och andra metaller av GF-AAS kommer att omfatta organ, vävnader som erhållits från djurmodeller, och tarmbiopsier från patienter med sjukdom i samband med systemisk metall obalanser.Salpetersyra är en extremt frätande syra som kan orsaka svåra kemiska brännskador mycket snabbt. Denna kemikalie kan också reagera våldsamt med vissa föreningar såsom metalliska pulver. På grund av faran med salpetersyra är det viktigt att vidta strikta säkerhetsåtgärder när du hanterar salpetersyra.Vid hantering av salpetersyra rekommenderar vi starkt att du använder säkerhetskemikalier glasögon, ansiktsskydd för stänkskydd, handskar, och godkänd ångandning om ventilationen inte är tillräcklig.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomär skala strukturella studier av makromolekylära sammansättningar av Solid-state kärnmagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

En strategi för att identifiera substanser som påverkar cell tillväxt och överlevnad i odlade däggdjursceller vid låg till måttlig genomströmning

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Densitet gradient ultracentrifugation för att undersöka endocytisk återvinning i däggdjursceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Fluorescens spektroskopi med dubbla färger för att studera protein-proteininteraktion och proteindynamik i levande celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Rening av Ubiquitinated p53-proteiner från däggdjursceller

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inre mitokondriell membrankänslighet för Na + avslöjar delvis segmenterade funktionella Q-pooler

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Syreoberoende analyser för att mäta mitokondriell funktion hos däggdjur

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...