Name: atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Bu çalışma Massachusetts Tıp Fakültesi Üniversitesi 'nden öğrenci çeşitliliği akademisyenler Ödülü 'nden tuvalet-B ' d e k i desteklenmektedir. TAN. SEP-CONACYT, Grant 279879 tarafından desteklenmektedir. J. G. N, National Science Foundation Grant DBı 0959476 tarafından desteklenmektedir. Yazarlar onun teknik destek için N2A hücre hattı ve Daniella Cangussu sağlamak için Dr Daryl A. Bosco minnettar.

1. mammalin hücre kültürü
<ol><li>Genel hususlar
	<ol>
<li>Daha önce gözden38memelinin hücre kültürü için aseptik teknikleri izleyin.</li>
		<li>37 °C ' de nemlendirici% 5 CO2 kuluçte tüm hücre çizgilerini koruyun. Hücre kültürü koşulları her hücre türü için farklılık gösterir. Kullanılan her hücre çizgisi için uygun kültür koşullarını korumak önemlidir, bu prosedürlerin varyasyonları anormal fenotürleri ve hücre kültürün?...

Atomik emilme spektroskopisi, küçük hacimli/kütle biyolojik örneklerinde Zn ölçümü için son derece hassas bir yöntemdir. Zn ölçümünün tanımlanan optimizasyonu bu yöntemin uygulanması basit hale getirir ve ideal analitik koşulları garanti eder. Burada, GF-AAS ' ı kullanarak, tüm hücrelerde Zn konsantrasyonunu, farklı hücre hatlarından siterik ve nükleer fraksiyonları tespit ettik. Sonuçlar, bu tekniğin floresan problar ve ıCP-MS ile elde edilenlere karşılaştırılabilir olduğunu göster...

Zn, cu, MN ve Fe gibi geçiş ve ağır metaller, gıda ve kirleticilerin her iki besinindeki ortamda doğal olarak bulunur. Tüm yaşayan organizmalar bu mikroutrients farklı miktarlarda gerektirir; Ancak, yüksek seviyelere maruz organizmalar için zararlı. Metal edinme ağırlıklı olarak diyet yoluyla, ancak metaller de solunabilir veya cilt üzerinden absorbe edilebilir1,2,3,4,5. Atmosferik partiküllerde metaller varlığının arttığını ve sağlık riskleriyle büyük ölçüde ilişkili olduğunu dikkate almak önemlidir. Antropojenik faaliyetler nedeniyle, AG, as, CD, CR, HG, ni, Fe ve PB gibi ağır metaller seviyeleri atmosferik partikül madde, yağmur suyu ve toprak6,7' de tespit edilmiştir. Bu metaller, özellikle Zn ve Fe, temel fizyolojik iz elemanları ile rekabet potansiyeline sahip ve Biyolojik süreçler için temel enzimleri devre dışı bırakarak toksik etkileri teşvik.
İz öğesi Zn redoks Neutral ve biyolojik reaksiyonlar bir Lewis asit olarak davranır, bu da protein katlama ve katalitik aktivite için gerekli olan temel bir kofaktör meme proteinlerinin% 10 ' dan fazla8,9, 10; Sonuç olarak, çeşitli fizyolojik fonksiyonlar için esastır8,11. Ancak, birçok iz elemanları gibi, bu metaller normal fizyolojik fonksiyon kolaylaştırarak ve toksisite neden arasında hassas bir denge vardır. Memelilerde, Zn eksiklikleri anemiye yol açar, büyüme geriliği, hipogonadizm, cilt anomalileri, ishal, alopesi, tat bozuklukları, kronik inflamasyon, ve bağışıklık ve nörolojik fonksiyonları özürlü11,12, 13,14,15,16,17,18. Aşırı olarak, Zn sitotoksisdir ve bakır gibi diğer temel metallerin emilimini bozar19,20,21.
Ayrıca, cu ve Fe gibi bazı metaller zararlı reaksiyonlara katılma potansiyeline sahiptir. Fenton kimya ile reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi, demir sülfür kümesi proteinlerinin montajına müdahale edebilir ve lipid metabolizmasını değiştirebilir22,23,24. Bu hasarı önlemek için, hücreler toksik etkileri önlemek için metal bağlayıcı şaperonlar ve taşıyıcılar kullanır. Kuşkusuz, metal homeostaz sıkıca belirli hücre türlerinin metaller uygun düzeylerde korumak sağlamak için kontrol edilmelidir. Bu nedenle, biyolojik numunelerde iz metallerin doğru ölçümü için teknikleri ilerletmek için önemli bir ihtiyaç vardır. Gelişmekte olan ve olgun organizmalarda, hücresel düzeyde, farklı gelişimsel aşamalarda ve normal ve patolojik koşullarda iz elemanları için diferansiyel biyolojik ihtiyaç var. Bu nedenle, organizmal metal homeostazisini anlamak için doku ve sistemik metal düzeylerinin kesin belirlenmesi gereklidir.
Grafit fırını atomik emilim spektrometresi (GF-AAS), küçük numune hacimleri için kullanılan, biyolojik ve çevresel örneklerde mevcut geçiş ve ağır metaller ölçmek için ideal hale getirmek için son derece hassas bir tekniktir25,26 , 27 , 28. dahası, tekniğin yüksek hassasiyetinden dolayı, Xenopus kullanarak na+/k+-ATPase ve gastrik H+/y+-ATPase ' i n ince taşıma özelliklerini incelemek için uygun olduğu gösterilmiştir. bir model sistemi olarak oosit29. GF-AAS, bir örnek içinde atomized elemanlar bir ışık kaynağı ile ilgi metal içeren yayılan radyasyon dalga boyu absorbe, elemanın konsantrasyonuna orantılı absorbe radyasyon ile. Elemental elektronik uyarma her kimyasal eleman için benzersiz bir quantized sürecinde ultraviyole veya görünür radyasyon emilimi üzerine gerçekleşir. Tek bir elektron sürecinde, bir foton emilimi atom içinde daha yüksek seviyeye daha düşük bir enerji seviyesinde hareket eden bir elektron içerir ve GF-AAS radyasyon emici sayısı ile orantılı örnek tarafından emilen fotonların miktarını belirler elementleri grafit tüpünde atomize edilir.
Bu tekniğin seçicilik atomların elektronik yapısına dayanır, hangi her eleman belirli bir emilim/emisyon spektral hattı vardır. Zn durumunda, emici dalga boyu 213,9 Nm ve tam olarak diğer metallerden ayırt edilebilir. Genel olarak, GF-AAS, Zn 'ı yeterli tespit sınırı (LOD) ve yüksek hassasiyet ve seçicilik25ile ölçmek için kullanılabilir. Emilen dalga boyu değişiklikler entegre ve belirli ve izole dalga boylarında enerji emme doruklarına olarak sunulmaktadır. Belirli bir örnekteki Zn konsantrasyonu genellikle, emici, numunenin Zn konsantrasyonu ile doğrudan orantılı olduğu Beer-Lambert kanununa göre bilinen konsantrasyonların standart bir eğrisinden hesaplanır. Ancak, GF-AAS analizlerine Beer-Lambert denklemi uygulanması da bazı komplikasyonlar sunar. Örneğin, numunelerin atomizasyon ve/veya homojen olmayan konsantrasyonlarındaki varyasyonlar metal ölçümlerini etkileyebilmektedir.
GF AAS iz Elemental analizi için gerekli metal atomizasyon üç temel adımlardan oluşur. İlk adım, sıvı çözücünün buharlaşma olduğu desolvasyon; Fırından sonra kuru bileşikler bırakarak yaklaşık 100 °C sıcaklığa ulaşır. Sonra, bileşikler 800 den 1.400 °C (analiz edilecek öğeye bağlı olarak) onları ısıtarak buharlaştırılmış ve bir gaz haline gelir. Son olarak, gaz durumundaki bileşikler 1.500 ila 2.500 °C arasında bulunan sıcaklıklarda atomize edilir. Yukarıda da anlatıldığı gibi, bir metal konsantrasyonunun artması GF-AAS tarafından algılanan emilim üzerinde orantılı artışlar oluşturacaktır, ancak fırın, mümkün olan konsantrasyonların çalışma aralığı olan dinamik analiz aralığını azaltır cihaz tarafından belirlenir. Böylece, teknik düşük konsantrasyonları ve LOD ve bira-Lambert Kanununun doğrusallık (LOL) sınırını belirleyerek yöntemin dinamik aralığının dikkatli bir şekilde belirlenmesi gerektirir. LOD, bir maddenin tespit edilmesi için gereken asgari miktardır, matrisin Zn standart sapması üç kez tanımlanır. LOL Beer-Lambert Kanunu kullanılarak tespit edilebilir maksimum konsantrasyon.
Bu çalışmanın içinde, tüm hücre özleri, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlar içinde Zn seviyelerini analiz etmek ve kültürlü hücrelerde proliferasyon ve ayrım yapmak için standart bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Numune hazırlama sırasında metal kaybını önlemek için farklı hücresel sistemlere çekirdekler protokolünün hızlı izolasyonu uyarlanmıştır. Kullanılan hücresel modeller, fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar, murine Nöroblastom hücreleri (N2A veya Neuro2A), murine 3T3 L1 adipocytes, insan olmayan-tumorigenic meme epitelyal hücre hattı (MCF10A) ve epitelyal madin-Darby köpek böbrek ( MDCK) hücreleri. Bu hücreler farklı sırlardan kurulmuştur ve in vitrometal düzeylerinin erit spesifik varyasyonlarını araştırmak için iyi modellerdir.
Fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar, iskelet kası farklılaşmasını araştırmak için iyi uygun bir in vitro modeli oluşturmaktadır. Yüksek serum koşullarında kültürlü olduğunda bu hücrelerin proliferasyonu hızlıdır. Kas Kemine farklılaşma daha sonra düşük serum koşulları tarafından indüklenir30. Murine Nöroblastom (N2A) kurulan hücre hattı fare nöral arması türetilmiştir. Bu hücreler nöronal ve Kökbacaklılar kök hücre morfolojisi mevcut. Farklılaşma uyarıcı üzerine, N2A hücreleri neurons gibi nöronların çeşitli özellikleri mevcut, neurofilaments. N2A hücreler Alzheimer hastalığı araştırmak için kullanılır, nörit büyüme, ve nörotoksisite31,32,33. 3T3-L1 murine ön adipocytes kurulan hücre hattı genellikle Adipogenesis ile ilişkili metabolik ve fizyolojik değişiklikleri araştırmak için kullanılır. Bu hücreler fibroblast benzeri bir morfoloji sunar, ancak bir kez farklılaşma için uyarılır, onlar lipid sentezi ve trigliserid birikimi ile ilişkili enzimatik aktivasyon mevcut. Bu sitoplazmik lipid damlacıkları34,35üretmek için morfolojik değişiklikler olarak gözlemlenebilir. MCF10A, meme fibrokistik hastalığı36olan premenopozal bir kadından elde edilen tümör olmayan bir meme epitelyal hücre çizgisinin. Proliferasyon, hücre göçü ve istilası gibi meme Karsinogenezi ile ilgili biyokimyasal, moleküler ve hücresel çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Madin-Darby köpek böbreği (MDCK) epitelyal hücre hattı, epitelyal fenotipin kurulması ile ilgili özellikleri ve moleküler olayları araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Konfluence ulaştıktan sonra, bu hücreler polarize olur ve hücre-hücre yapışmaları, mammalin epitelyal dokularının özellikleri37.
Memeli hücrelerinde Zn seviyelerini ölçmek için AAS yeteneğini test etmek için, bu beş hücre hatlarının tüm ve hücre altı fraksiyonları (sitersol ve çekirdeği) analiz ettik. AAS ölçümleri bu hücre tiplerinde Zn farklı konsantrasyonları gösterdi. Konsantrasyonlarda primer myoblastlar proliferasyon ve farklılaşıyor (4 ila 7 nmol/mg protein) ve dört kurulan hücre hatları (20 ile 40 nmol/mg protein arasında değişen) daha yüksek. Primer myoblastlar ve nörblastoma hücrelerinde proliferasyon hücreleriyle karşılaştırıldığında, Zn düzeylerinde önemli olmayan küçük bir artış tespit edildi. Farklılaşmış adipanositlerde zıt etki tespit edildi. Ancak, proliferasyon 3T3-L1 hücreleri farklılaşmış hücrelere kıyasla metal yüksek konsantrasyonları sergiledi. Daha da önemlisi, bu üç hücreli çizgide, hücre içi fraksiyonlama, Zn 'ın bu hücrelerin metabolik durumuna göre sitersol ve çekirdeğin farklılaşması olduğunu göstermiştir. Örneğin, proliferasyon myoblastlar, N2A hücreler ve 3T3-L1 öncesi adipocytes, metal çoğunluğu çekirdeğe lokalizedir. Belirli hücre tedavileri kullanılarak farklılaşma indüksiyon üzerine, Zn bu üç hücre türlerinde sitüsol lokalize. İlginçtir ki, her iki epitelyal hücre hatları, bir karakteristik sıkı Tek tabakalı oluşmuş olan konfluence ulaştığında karşılaştırıldığında proliferasyon sırasında Zn daha yüksek düzeylerde gösterdi. Proliferasyon epitelyal hücrelerde, meme hücre hattı MCF10A Siton ve çekirdek arasında eşit Zn dağılımı vardı, böbrek kaynaklı hücre hattında iken, metal çoğu çekirdeğinde yer aldı. Bu iki hücre tipinde, hücreler konfluence ulaşıldığında, Zn ağırlıklı olarak siterona yer verildi. Bu sonuçlar GF-AAS düşük verim örneklerinde Elemental analiz yapmak için son derece hassas ve doğru bir teknik olduğunu göstermektedir. GF-AAS hücre altı fraksiyonlama ile birleştiğinde ve farklı hücre hatları ve dokularda iz metal öğelerin düzeylerini araştırmak için adapte edilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1005706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Brg1-antibody (G7)</td>
			<td>Santa Cruz biotechnologies</td>
			<td>sc-17796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti b-tubulin-antibody (BT7R)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA5-16308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidemal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>16050122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>51300044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid (HNO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 (NP-40)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>85125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM (Reduced Serum Media)</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol (Collagen)</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retionic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PHR1187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>648469-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFischer-Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 &#181;g/mL, 2% HNO3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N9300168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Established Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T3-L1</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CL-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDK</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2A</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic Absortion spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Aanalyst 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor</td>
			<td>Diagnode</td>
			<td>UCD-200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic absorbance spectroscopy to measure intracellular zinc pools in mammalian cells

Geçiş metaller organizmalar için temel mikroutrients ancak proteinlerde fizyolojik metaller ile rekabet ve redoks stres üreten yüksek konsantrasyonlarda hücrelere toksik olabilir. Metal tükenmesi veya birikimine yol açabilen patolojik koşullar farklı insan hastalıklarının nedensel ajanlarıdır. Anemi, akrodermatit Enteropathica ve Wilson ve Menkes hastalıklarına örnekler dahildir. Bu nedenle, bu öğelerin normal fizyolojik işlevlere nasıl katkı sağlayacağını araştırmayı kolaylaştırmak için yüksek hassasiyet ve doğruluk ile biyolojik örneklerde geçiş metallerinin düzeylerini ve taşınması ölçmek mümkün olması önemlidir ve Toksisite. Çinko (Zn), örneğin, birçok memelinin proteinleri bir kofaktör, sinyalizasyon olaylara katılır ve hücrelerde ikincil bir haberci olduğunu. Fazlalığında, Zn toksik ve diğer metallerin emilimini inhibe edebilir, açık iken, potansiyel olarak ölümcül koşullara çeşitli yol açabilir.

Grafit fırını atomik emilim spektroskopisi (GF-AAS), çeşitli biyolojik örneklerde Zn ve diğer geçiş metal konsantrasyonlarını belirlemek için son derece hassas ve etkili bir yöntem sağlar. GF-AAS aracılığıyla elektrotermal atomizasyon, ilgi unsurunun uyarılma dalga boyu kullanarak sonraki seçici emme analizi için numunelerin küçük hacimleri parçalamalı ile metaller nicelik. Beer-Lambert Kanunu doğrusallık sınırları içinde, metal tarafından ışık emici doğrudan analit konsantrasyonu ile orantılıdır. Zn içeriğinin belirlenmesi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, GF-AAS hem ücretsiz hem de kompleks Zn proteinlerinde ve muhtemelen küçük numune hacimlerinde yüksek hassasiyetle küçük hücre içi moleküllerde algılanır. Ayrıca GF-AAS, İndüktif olarak bağlı plazma kitle spektrometresi (ıCP-MS) veya Synchrotron tabanlı X-ışını floresans ile daha kolay erişilebilir durumdadır. Bu yöntemle, GF-AAS ' l a analiz için farklı kültürlü hücre hatlarının sistematik numune hazırlanması açıklanmıştır. Bu iz elemanının varyasyonları, hem tam hücre endoglikozidazları hem de Proliferasyona ve farklılaşan hücrelerin alt hücreli fraksiyonları ilkesinin kanıtı olarak karşılaştırıldı.

GF-AAS ' ı ı, memelinin hücrelerinde Zn dakika seviyelerini algılamak için test ettik (Şekil 1). Böylece, fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar ve kurulan hücre hatları N2A (Nöroblastom türetilmiştir), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (meme epiteli) ve MDCK hücreleri (köpek böbrek epiteli) kültürüne sahibiz. İlk olarak, tüm bu hücre türlerinin tüm hücresini, sitosolik ve nükleer fraksiyonları izole ettik ve Batı leke ta...

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells at JoVE.com

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Kültürlü primer veya kurulan hücre hatları yaygın hayvan modelleri kullanmadan önce bir ilk yaklaşım olarak temel biyolojik ve mekanik soruları ele almak için kullanılır. Bu protokol, çinko (Zn) ve Atom emici spektroskopisi ile diğer iz elemanlarının çalışmaları için tüm hücre özler ve hücre altı fraksiyonları hazırlamak açıklamaktadır.

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Geçiş metallerinin memeli gelişimindeki rolü büyük ölçüde küçümsenmemelidir. Ortaya çıkan kanıtlar metal homeostazın hücre ve dokuların gelişim evresine göre değişmeye devam ettiğini göstermektedir. Ayrıca, metallerin belirli hücresel hedefleri de geliştirme varietal, ve tabii ki, onların yerini belirlemek için zor.Bugüne kadar, metalleri ölçmek için farklı analitik teknikler geliştirilmiştir, ancak bunların çoğu pahalı veya erişilemezdir. Yoğun araştırma daha erişilebilir ve verimli bir şekilde metal tayinleri geliştirmek için odaklanmıştır. Grafit fırın atomik absorpsiyon spektroskopisi, GF-AAS, iki ana avantajı vardır.Çinko için düşük algılama limitleri sağlayarak doğru iz çinko analizi sağlar. Aynı zamanda yüksek hacimli numune gerektirmeyen bir tekniktir, çözeltinin mikrolitreleri analizi gerçekleştirmek için yeterli olma eğilimindedir. Bu iki avantajın birleşimi, GF-AAS'ı düşük hacimli numunelerde eser öğeleri analiz etmek için ideal hale getirsin.Birçok insan patolojik koşulları metal dengesizlikleri ile ilgilidir. Bazı örnekler anemi, akrodermatit enteropaica ve Wilson ve Menkes hastalıklarıdır. Bu nedenle biyolojik numunelerdeki geçiş metallerinin seviyelerini yüksek hassasiyet ve doğrulukla ölçmek için etkin ve güvenilir yöntemler geliştirmek önemlidir.GF-AAS, normal fizyolojik koşullarda ve patojenik vakalarda herhangi bir metalin belirlenmesini kolaylaştıran bir teknoloji üzerinde mükemmel bir örnektir. Yöntem çok yönlüdür. Birçok sistem uygulanabilir ve birçok eleman GF-AAS kullanılarak analiz edilebilir.Zorluklar, örneklerin bu sınıra düşmesini sağlayarak gerçekte algılama yöntemi sınırını belirlemektir. Örneklerin hacminin düşük olduğu göz önüne alındığında, test için çok fazla yer yoktur, bu nedenle verilerin dikkatle incelenmesi en başından beri yapılması gerekir. Numunelerin ilk analizinden sonra, numuneleri nicelleştirme için gerekli sınırlara getirmek için gereken seyreltme faktörünün ne olduğunu belirlememiz gerekir.AAS'ye gitmeden önce çekirdekleri düzgün bir şekilde kesirleyebildiğinizden emin olun. Batı lekeleri spektroskopik analizden önce her zaman iyi bir doğrulamadır. GF-AAS düşük hacimli olsa da, hücre içi havuzlar zaten düşük hacimlerdedir.Bu test için çok az yer verir. İlk ölçümler dikkatle yapılmalı ve incelenmelidir, böylece numune tedavisi sadece bir seyreltme faktörüne indirgenebilir. Başlamak için, kültür 55 santimetre kare plakalar ilgi hücreleri.Kültür medyaaspirate için bir vakum tuzağı kullanın. Ortamın tüm izlerini kaldırdıklarından emin olun. İstenilen zaman noktalarından veya kültür koşullarından hücreleri üç kez durulamak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen buz gibi PBS kullanın.Sonra plakaya bir mililitre buz gibi pBS ekleyin ve hücreleri tabaktan kazıyın. Hücre süspansiyonlarını 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buzda tutun. 10, 000 kez G'de 10 saniye santrifüj yapın ve aspirasyon la supernatant'ı çıkarın.Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonların metal analizi isteniyorsa, iyonik olmayan bir deterjan olan 0.1%NP-40 içeren 400 mikrolitre buz gibi pbs içeren hücre peletini yeniden askıya alın. 100 mikrolitreyi tüm hücre numunesi olarak yeni bir mikrosentrifuge tüpüne aktarın ve eksi 20 derecede saklayın. Çekirdekleri izole etmek için, 400 mikrolitrelik hücre süspansiyonunun buzüzerinde 5 ila 10 kez yukarı ve aşağı inip çıkarmasını pipetlemek için P1000 mikropipet ucu kullanın.Sonra, hücre süspansiyon beş mikrolitre ayıklayın ve bir mikroskop cam slayt aktarın. Çekirdek bütünlüğünü doğrulamak için 40 kat objektif kullanarak bir ışık mikroskobu altında beş mikrolitre yerleştirin. Kalan 395 mikrolitre likit süspansiyonu 10 saniyede 10 saniye için santrifüj edin, 000 kez G.Sitosolik fraksiyonu içeren süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra, 0.1% NP-40 içeren PBS 500 mikrolitre ekleyin nükleer fraksiyonu ile pelet durulayın, ve 10 saniye için santrifüj 10, 000 kez G.Supernatant çıkarın, ve aynı çözeltinin 100 mikrolitre çekirdekleri içeren pelet yeniden askıya. Hücreleri lyse için, beş dakika boyunca, üç kez, her biri için çözüm içeren tüm hücre ve çekirdekleri sonicate bir Bioruptor kullanın. Nükleer veya sitosolik fraksiyonlara özgü antikorlar kullanarak, fraksiyonların saflığının batı lekeleri tarafından kalite kontrolünü gerçekleştirmeye devam edin.İlk olarak, tüm hücre, sitoplazmik ve 1.5 mililitre mikrocentrifuge tüpler hücre süspansiyon 100, 500 ve 100 mikrolitre içeren nükleer fraksiyonları, tüm hücre, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonları konsantre nitrik asit eşit hacimli ekleyin ve bir saat hücre kültürünü mineralize etmek için 80 santigrat derece bir termal blok yerleştirin. Bundan sonra, termal blok tüpleri çıkarmak ve 20 santigrat derece de bir gecede asit sindirim devam etmek için bir rafa yerleştirin. Hidrojen peroksit numune hacminin% 30 ekleyerek reaksiyonu durdurun.18 mega Ohm saf su ile 500 mikrolitre numune hacmi getirin. Sonra, 15 mililitrelik Falcon tüp seyreltilmiş analitik sınıf standart nitrik oksit saflaştırılmış suda 18 mega Ohms kalibrasyon sırasında boş çözelti olarak iki hacimli nitrik asit çözeltisi hazırlamak için. Daha sonra, milyarda 1,000 parça konsantrasyonu ile ticari olarak kullanılabilir 1, 000 ppm çinko stok çözeltisi seyreltmek için iki hacimli nitrik asit çözeltisi kullanın.Çalışma standardı çözümleri milyon çinko standart çözeltisi başına 1, 000 parça, milyar çözelti başına 1,000 parça hazırlayın, sonra 5, 8, 10, 15, 20 ve 25 ppb doğrudan 2 hacimli nitrik asit çözeltisi ile seyreltin. Polipropilen örnek bardak içine% 0.1 magnezyum nitrat matris değiştirici bir mililitre yerleştirin ve sonra autosampler atlıkarınca içine bardak yükleyin. Otomatik olarak çinko standartlarına matris değiştirici beş mikrolitre eklemek için atomik soğurma spektrometre programlayın ve boş.Standart çözeltiler ve numuneler için atomik soğurma spektrometresinde aynı optimize edilmiş koşulu, dakikada 250 mililitre giriş akış hızı, 20 santigrat derecede enjeksiyon sıcaklığı ve dört adımlı işlemlerde 1, 800 santigrat dereceye ulaşan grafit fırın sıcaklığı ile ayarlayın. Kalibrasyon farklılıkları veya buharlaşma nedeniyle yapılan hataları önlemek için tek bir deneyin tüm standartları ve numuneleri aynı anda ölçülmelidir. Lamba C-HCL'yi 20 amper, dalga boyu 213,9 nanometre ve 0,7 nanometre yarık ile optimize edin.Pipet polipropilen örnek bardak örnekleri, ve autosampler atlıkarınca içine yerleştirin. Çinko tespiti alt sınırı milyarda 0.01 parçadır. Standartların konsantrasyonu artırılarak, çinko tespiti üst sınırı milyarda 20 parça olarak belirlenmiştir.Çinko standart eğrisi elde edildikten sonra, metal içeriğini belirlemek için mineralize numuneleri ölçün. Elde edilen veriler algılama sınırının ötesindeyse, numuneleri %0,1 analitik sınıf nitrik asitle arıtılmış 18 mega Ohm arıtılmış su ile seyreltin. Çekirdek protokolünün bu hızlı yalıtımında, ayırt edici birincil miyoblastlardan temsili bir batı lekesi hücre altı fraksiyonlarının saflığını gösterir.Kromatin remodeler enzimi Brg1 nükleer fraksiyonu tanımlamak için kullanıldı ve tubulin sitosolik fraksiyonu tanımlamak için kullanıldı. Bu şekil, her hücre tipinin çoğalan ve farklılaştırılmış veya confluent monolayers için temsili ışık mikrograflar gösterir, ve tüm hücre özleri karşılık gelen çinko içeriği, sitosolik ve nükleer fraksiyonları. Bu çalışmada analiz edilen tüm hücre hatları nanomolar aralığında çinko konsantrasyonları gösterdi.Diferansiye primer miyotüpler çoğalan hücrelere göre daha yüksek düzeyde çinko sergiledi. Benzer bir althücre çinko dağılımı nöroblastom türetilmiş hücre hattı N2A tespit edildi. Öte yandan, kurulan 3T3-L1 hücre hattı, pre-adipositler indüklenen veya farklılaştırılan zamana göre çoğalan çinko daha yüksek düzeyde sergiledi.MCF10A hücreleri çoğalan hücrelerde sitosolik ve nükleer fraksiyonlar arasında eşit düzeyde çinko gösterdi. MCF10A hücreleri biraraya ulaştığında, tüm hücre çinko düzeylerinde %40 azalma saptanır ve metalin en çok sitosolik fraksiyonda yoğunlaştığı bulunmuştur. Grafit fırın atomik absorpsiyon spektrometresi biyolojik ve çevresel örneklerde geçiş ve ağır metaller ölçmek için son derece hassas bir tekniktir.Hücre altı fraksiyonlarının hazırlanmasında özel bakım ve temizlik yapılmalıdır, çünkü minimum kontaminasyon, ekipmanın hassasiyeti nedeniyle analize engel olacaktır. Her deneydeki düşük hacimler ve metallerin iz seviyeleri göz önüne alındığında, çinkoölçmek için GF-AAS'den daha iyi ve daha doğru bir teknik düşünmek zordur. GF-AAS'ın nispeten düşük maliyetinde algılama ve düşük hacim limitlerini sağlayabilecek güncel teknikler yoktur.Grafit fırın atomik absorpsiyon spektrometresi doğru, hassas, uygun maliyetli ve erişilebilir. Bu analitik teknik, temel algılama teknolojileri ilerlemeye devam ettikçe gelişmeye devam edecektir. Çinko ve diğer metallerin GF-AAS tarafından saptanması için gelecekte yapılacak uygulama, organlar, hayvan modellerinden elde edilen dokular ve sistemik metal dengesizlikleri ile ilişkili hastalığı olan hastalardan alınan biyopsileri içerecektir.Nitrik asit çok hızlı bir şekilde ciddi kimyasal yanıklara neden yeteneğine sahip son derece aşındırıcı bir asittir. Bu kimyasal aynı zamanda metalik tozlar gibi bazı bileşikler ile şiddetle tepki verebilir. Nitrik asitin oluşturduğu tehlike nedeniyle, nitrik asit kullanımı nda sıkı güvenlik önlemleri almak önemlidir.Nitrik asit kullanırken, havalandırma yeterli değilse güvenlik kimyasal gözlükleri, sıçrama koruması için yüz kalkanı, eldiven ve onaylı buhar solunumu takmanızı şiddetle tavsiye ediyoruz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Düşük-Orta Throughput'ta Kültürlü Memeli Hücrelerinde Hücre Büyümesini ve SağkalımLarını Etkileyen Bileşikleri Belirleme Stratejisi

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

İç Mitokondriyal Membranın Na+' ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...