Name: visualizing protein kinase a activity in head-fixed behaving mice using in vivo two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2019-06-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

نشكر السيدة ج. لاماير، والسيدة روث فرانك، والدكتور مايكل أ. مونياك على التعليقات والتعليقات، والدكتور ريوهي ياسودا في ماكس بلانك فلوريدا على برامج الاستحواذ 2pFLIM. وقد تم دعم هذا العمل من قبل اثنين من جوائز مبادرة الدماغ U01NS094247 (H.Z. و T.M.) و R01NS10444 (H.Z. و T.M.)، ومنحة R01 R01NS081071 (T.M.)، ومنحة R21 R21NS097856 (H.Z.). جميع الجوائز هي من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، الولايات المتحدة.

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة أوريغون للصحة والعلوم.
1. 2pFLIM المجهر الإعداد 2.
<ol><li>قم بتثبيت وحدة عد توقيت الفوتون (PTCM، جدولالمواد) والاتصال بالكمبيوتر (الشكل 1) وفقا لدليل ال?...

<ol>
	<li>Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurobiology+of+Slow+Synaptic+Transmission.">The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission.</a> Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).</li><li>Petersen, S. E., Posner, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+attention+system+of+the+human+brain:+20+years+after.">The attention system of the human brain: 20 years after.</a> Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).</li><li>Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+and+Corticotropin-Releasing+Hormone:+Partners+in+the+Neural+Circuits+that+Underpin+Stress+and+Anxiety.">Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety.</a> Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).</li><li>Berke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+dopamine+mean?.">What does dopamine mean?.</a> Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+G&#945;q-Coupled+Neuromodulator+Receptors+Activate+Protein+Kinase+A.">Endogenous G&#945;q-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A.</a> Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).</li><li>Madison, D. V., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+3&#8217;,5&#8217;-monophosphate+mediates+beta-receptor+actions+of+noradrenaline+in+rat+hippocampal+pyramidal+cells.">Cyclic adenosine 3&#8217;,5&#8217;-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).</li><li>Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+signaling+cascades+for+LTP+induction.">A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction.</a> Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).</li><li>Pedarzani, P., Storm, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+mediates+the+effects+of+monoamine+transmitters+on+the+K++current+underlying+the+slow+spike+frequency+adaptation+in+hippocampal+neurons.">PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons.</a> Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).</li><li>Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+isoforms,+neural+pathways,+and+behaviour:+making+the+connection.">PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).</li><li>Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-+and+Cell+Type-Specific+Modulation+of+Excitatory+Neuronal+Activity+in+the+Neocortex.">Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).</li><li>Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+trends+in+in+vivo+neurochemical+monitoring+by+microdialysis.">Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).</li><li>Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hitchhiker&#8217;s+Guide+to+Voltammetry:+Acute+and+Chronic+Electrodes+for+In+Vivo+Fast-Scan+Cyclic+Voltammetry.">Hitchhiker&#8217;s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).</li><li>Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+level+brain+imaging+in+behaving+mammals:+An+engineering+approach.">Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach.</a> Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).</li><li>Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+reporters+of+protein+kinase+A+activity+reveal+impact+of+substrate+tethering.">Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).</li><li>Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PKA+activity+sensor+for+quantitative+analysis+of+endogenous+GPCR+signaling+via+2-photon+FRET-FLIM+imaging.">A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging.</a> Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+A-Kinase+Activity+Reporter+for+Imaging+Neuromodulatory+Events+in+Awake+Mice.">A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice.</a> Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).</li><li>Yellen, G., Mongeon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+two-photon+imaging+of+fluorescent+biosensors.">Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).</li><li>Tang, S., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ERK+and+PKA+Activation+in+Single+Dendritic+Spines+during+Structural+Plasticity.">Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity.</a> Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).</li><li>Tillo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liberated+PKA+Catalytic+Subunits+Associate+with+the+Membrane+via+Myristoylation+to+Preferentially+Phosphorylate+Membrane+Substrates.">Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates.</a> Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+spatiotemporal+dynamics+of+neuronal+signaling+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).</li><li>Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+bound+to+microtubule-associated+protein+2.">Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+type+II+PKA+in+neurons.">Subcellular dynamics of type II PKA in neurons.</a> Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li><li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex-,+Hippocampus-,+Thalamus-,+Hypothalamus-,+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+utero+Electroporation+in+the+C57BL/6+Mouse.">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+quantitative+FRET-FLIM+imaging+in+single+dendritic+spines+using+improved+non-radiative+YFP.">Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP.</a> Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).</li><li>Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dark+green+fluorescent+protein+as+an+acceptor+for+measurement+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer.">A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of F&#246;rster resonance energy transfer.</a> Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).</li><li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+behavioral+experiments+in+head-fixed+mice.">Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice.</a> PLoS ONE. 9 (2), (2014).</li><li>Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+amygdala+controls+learning+in+the+lateral+amygdala.">The central amygdala controls learning in the lateral amygdala.</a> Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+signaling+using+two-photon+fluorescent+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).</li><li>Mehta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fluorophore+biosensors+for+sensitive+and+multiplexed+detection+of+signalling+activities.">Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities.</a> Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).</li></ol>

يوضح هذا البروتوكول استخدام جهاز استشعار FRET-FLIM tAKARα لتصور نشاط PKA الذي يتم تشغيله بالتشكيل العصبي في الفئران التي تتصرف في الرأس الثابتة. ويستند هذا التطبيق على اختبار واسعة النطاق وتوصيف اتاكر في المختبر وفي الجسم الحي لإثبات أن إشارة FLIM التي تم الحصول عليها ذات الصلة للأحداث العصبية الف?...

التشكيل العصبي، والمعروف أيضا باسم انتقال متشابك بطيء، يفرض سيطرة قوية على وظيفة الدماغ خلال الحالات السلوكية المختلفة، مثل الإجهاد، والإثارة، والاهتمام، والحركة1،2،3، 4.على الرغم من أهميتها، ودراسة متى وأين تجري الأحداث neuromodulatory لا تزال في مهدها. Neuromodulators, بما في ذلك أستيل, الدوبامين, نورادرينالين, السيروتونين, والعديد من الببتيدات العصبية, تنشيط مستقبلات G البروتين المقترنة (GPCRs), التي بدورها تؤدي داخل الخلايا مسارات رسول الثاني مع نافذة واسعة من الجداول الزمنية تتراوح من ثانية إلى ساعات. في حين أن كل neuromodulator مشغلات مجموعة متميزة من الأحداث إشارة، وcAMP / البروتين كيناز A (PKA) المسار هو مسار المصب المشتركة لكثير من neuromodulators1،5. مسار CAMP / PKA ينظم الإثارة العصبية، انتقال متشابك،واللدونة 6،7،8،9،وبالتالي، الإيقاعات ديناميات شبكة الخلايا العصبية. لأن الخلايا العصبية المختلفة أو أنواع الخلايا العصبية التعبير عن أنواع مختلفة أو مستويات مستقبلات neuromodulator10، قد تكون الآثار داخل الخلايا من نفس neuromodulator خارج الخلية غير متجانسة عبر الخلايا العصبية المختلفة ، وبالتالي ، يجب أن يكون درس مع القرار الخلوية. حتى الآن, لا يزال من الصعب رصد الأحداث neuromodulatory في الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي أثناء السلوك.
لدراسة الديناميات الصدغية للتشكيل العصبي، يلزم إجراء تسجيل مناسب. يتم استخدام غسيل الكلى الدقيق والقياس الفولتامتري الدوري يُفحص بسرعة لدراسة إطلاق النيونوموتورات، ولكنها تفتقر إلى الدقة المكانية لرصد الأحداث الخلوية11،12. مماثلة لديناميات الكالسيوم المستخدمة كوكيل للنشاط الكهربائي العصبي في التصوير السكاني13، يمكن استخدام التصوير PKA لقراءة الأحداث neuromodulatory عبر السكان الخلايا في القرار الخلوي. يصف هذا البروتوكول استخدام مراسل نشاط A-kinase محسن (AKAR) لرصد أنشطة PKA في الجسم الحي أثناء السلوك الحيواني. الطريقة الموصوفة هنا يسمح للتصوير المتزامن للسكان الخلايا العصبية في القرار دون الخلوي مع قرار زمني الذي يتتبع الأحداث العصبية الفسيولوجية.
وتتكون AKARs من متبرع وبروتينات فلورية مقبولة مرتبطة ببتيد الركيزة الفسفور PKA والمجال المرتبط بشوكة الرأس (FHA) الذي يربط serine الفوسفوري أو ثروينين الركيزة14،15. عند تفعيل مسار PKA، يتم الفوسفورية الببتيد الركيزة من AKAR. ونتيجة لذلك، يرتبط مجال FHA بببتيد الركيزة الفوسفوري، وبالتالي جلب الفلوروفورين اثنين على مقربة من بعضها البعض، ويشار إليها باسم حالة AKAR المغلقة. ينتج ال ينفضّ دولة من [سكر] [فوسفوريلت] في يزاد [فرستر] رنة طاقة إنتقال ([فريت]) بين المانحة ومقبولة [فلوروفورس]. وبما أن نسبة الأكور الفوسفورية ترتبط بمستوى نشاط PKA16،يمكن استخدام كمية قوات الاتحاد الثوري في عينة بيولوجية لتحديد مستوى نشاط PKA16،17،18، 19،20.
تم تصميم الإصدارات المبكرة من AKARs في المقام الأول للتصوير قياس اللونين14. عند التصوير أعمق في أنسجة الدماغ، وطريقة قياس النسب يعاني من تشويه الإشارة بسبب تشتت الضوء تعتمد على الطول الموجي17،18،21. كما هو موضح أدناه، الفلورة التصوير المجهري مدى الحياة (FLIM) يزيل هذه المشكلة لأن FLIM يقيس فقط الفوتونات المنبعثة من الفلوروفور المانح18،21. ونتيجة لذلك، لا يتأثر التحديد الكمي للFLIM من FRET بعمق الأنسجة17. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام متغير "داكن" (أي انخفاض غلة الكم [QY]) من الفلوروفور المقبول. هذا يحرر قناة ملونة لتسهيل القياس المتعدد من خصائص الخلايا العصبية المتعامدة عن طريق التصوير المتزامن للمستشعر الثاني أو علامة مورفولوجية17،19،20.
التصوير FLIM يحدد الوقت الذي يقضيه الفلوروفور في حالة متحمس، أي عمر الفلورة18. عودة فلوروفور إلى حالة الأرض، وبالتالي نهاية الدولة متحمس، وغالبا ما تصاحب انبعاث فوتون. على الرغم من أن انبعاث الفوتون لجزيء متحمس الفردية هو الاستوكاستك، في السكان متوسط عمر الفلورة هو سمة من سمات ذلك الفلوروفور خاصة. عندما يكون السكان النقيمن الفلوروفور متحمسون في وقت واحد، فإن الفلورة الناتجة سوف تتبع تسوس أسي واحد. ثابت الوقت من هذا الاضمحلال الأسي يتوافق مع متوسط عمر الفلورة، والتي تتراوح عادة من واحد إلى أربعة نانو ثانية للبروتينات الفلورية. كما يمكن أن تحدث عودة الفلوروفور المتحمس للمانحين إلى الحالة الأرضية من قبل الاتحاد من أجل إعادة التأثر. في وجود فريت، يتم تقليل عمر الفلوروفور المانح. وAAKARs غير الفوسفورية تظهر عمر الفلورة المانحة أطول نسبيا. وعند الفسفور من قبل PKA، يعرض جهاز الاستشعار عمراً أقصر لأن المتبرع والمانح الفلوروفوريس يقتربان من بعضهما البعض وتزداد الـ FRET. وبالتالي فإن التحديد الكمي لعمر الفلورة في عدد السكان من الـ AKARs يمثل مستوى نشاط مرافق الحماية من الكلمنها.
لم يتم استخدام الإصدارات المبكرة من AKARs بنجاح في التصوير في الجسم الحي بدقة خلية واحدة. ويرجع ذلك أساسا إلى انخفاض سعة إشارة أجهزة الاستشعار عكار إلى التنشيط الفسيولوجي17. في الآونة الأخيرة، من خلال المقارنة المنهجية أجهزة الاستشعار AKAR المتاحة لاثنين من الفوتون الفلورة التصوير المجهري مدى الحياة (2PFLIM)، تم العثور على جهاز استشعار يسمى FLIM-AKAR لتفوق أجهزة الاستشعار البديلة. وعلاوة على ذلك، تم تطوير سلسلة من المتغيرات FLIM-AKAR تسمى AKARs المستهدفة (tAKARs) لتصور نشاط PKA في مواقع محددة دون الخلوية: microtubules (tAKARα)، سيتوسول (tAKARβ)، أكتين (tAKARδ)، الأكتين خيوطي (tAKARי)، غشاء (tAKARγ)، والكثافة الرصاقة (tAKARי). ومن بين التاكارس، زاد التاكارا من سعة الإشارة التي أثارها إفراز بمقدار 2.7 أضعاف. وهذا يتفق مع المعرفة بأن غالبية PKA في الخلايا العصبية راسية على microtubules في حالة يستريح22،23. وكان tAKARα أفضل أداء بين AKARs القائمة ل2pFLIM. وعلاوة على ذلك، اكتشف tAKARα نشاط PKA ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي أثارها المغيرات العصبية متعددة، والتعبير عن tAKARα لم يغير وظائف الخلايا العصبية17.
في الآونة الأخيرة، تم استخدام tAKARα بنجاح لتصور أنشطة PKA في الفئران يتصرف الرأس ثابتة17. وقد تبين أن الحركة القسرية أدت إلى نشاط PKA في سوما من الخلايا العصبية الطبقة السطحية (الطبقة 1 إلى 3، تصل إلى عمق ~ 300 ميكرومتر من بيا) في المحرك، برميل، والقشرية البصرية. وكان نشاط PKA التي تسببها الحركة تعتمد جزئيا على الإشارة عن طريق مستقبلات β-adrenergic ومستقبلات الدوبامين D1, ولكن لم يتأثر بخصم مستقبلات الدوبامين D2. يوضح هذا العمل قدرة tAKARs على تتبع أحداث التشكيل العصبي في الجسم الحي باستخدام 2pFLIM.
في البروتوكول الحالي، يتم وصف الطريقة الكاملة لتصوير نشاط PKA في الفئران مستيقظا ثابتالرأس أثناء نموذج الحركة القسري في ست خطوات. أولا، إضافة قدرات 2pFLIM إلى المجهر التقليدية اثنينفوتون (الشكل 1). ثانيا، بناء جهاز المشيالآلية (الشكل 2). ثالثا، التعبير عن جهاز استشعار tAKARα في قشرة الماوس عن طريق في الكهربائي الرحم (IUE) من بلازميدات الحمض النووي، أو حقن مجسمة من الفيروس المرتبط بأدينو (AAV). وقد نشرت سابقا بروتوكولات ممتازة للعمليات الجراحية لIUE24،25 وحقن stereotaxic من الجسيمات الفيروسية26. ويرد أدناه وصف للبارامترات الرئيسية التي استخدمناها. وإلى الأمام، تركيب نافذة الجمجمة. وقد نشرت بروتوكولات ممتازة سابقا لجراحة نافذة الجمجمة27,28. يتم وصف العديد من الخطوات التي تم تعديلها من البروتوكولات القياسية. الخامس، أداء في الجسم الحي 2pFLIM. سادساً، تحليلات صور 2pFLIM (الشكل3 والشكل 4). وينبغي أن يكون هذا النهج قابلاً للتطبيق بسهولة على العديد من النماذج السلوكية الأخرى الثابتة الرأس ومناطق الدماغ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m cellulose acetate syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2520</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x 0.8 NA water-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRP07220</td>
			<td>Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pin cable</td>
			<td>US digital</td>
			<td>CA-MIC3-SH-NC</td>
			<td>Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum bread board</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1012</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnimalTracker MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass barrier filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500-40m</td>
			<td>Step 1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Step 2.4. Used as mount for rotation sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter</td>
			<td>FST</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular coverslip (5mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101413-528</td>
			<td>Step 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made injection needle holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44114</td>
			<td>Steps 4.3. and 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill; Microtorque ii</td>
			<td>Ram products</td>
			<td>66699</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowsil transparent polymer</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>3-4680</td>
			<td>Step 4.5. Artificial dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation electrode</td>
			<td>Bex</td>
			<td>LF650P5</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bex</td>
			<td>CUY21</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>Step 3.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMimage MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMview MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam-compatible glue (Gorilla White Glue)</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>5201204</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydraulic micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MO-10</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>KG82648R</td>
			<td>Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-noise fast photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422PA-40 or H10769PA-40</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2012b</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor</td>
			<td>Zhengke</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor speed controller</td>
			<td>Elenker</td>
			<td>EK-G00015A1-1</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P14</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PB2</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C1515</td>
			<td>Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR2</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS010</td>
			<td>Step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon timing counting module</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>SPC-150</td>
			<td>Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid: tAKAR&#945; (CAG-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119913</td>
			<td>Step 3.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH4</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90</td>
			<td>Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation sensor</td>
			<td>US digital</td>
			<td>MA3-A10-250-N</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mat</td>
			<td>Rubber-Cal</td>
			<td>B01DCR5LUG</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>6208K433</td>
			<td>Steps 2.3. and 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage 3.6</td>
			<td>Svoboda Lab/Vidrio Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 5.9. and 6.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal splitter</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>HPM-CON-02</td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>1327K66</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic alignment systsem</td>
			<td>David kopf</td>
			<td>1900</td>
			<td>Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>14006</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus: tAKAR&#945; (AAV2/1 hSyn-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119921</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White PE foam roller (8 x 12 inch)</td>
			<td>Fabrication enterprises INC.</td>
			<td>30-2261</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White polystyrene fom ball halves</td>
			<td>GrahamSweet</td>
			<td>200mm diameter 2 hollow halves</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipkicker</td>
			<td>PACER</td>
			<td>PT29</td>
			<td>Step 4.3. Hardening accelerator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein kinase a activity in head-fixed behaving mice using in vivo two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy

التشكيل العصبي يمارس سيطرة قوية على وظيفة الدماغ. يؤدي خلل في النظم العصبية إلى اضطرابات عصبية ونفسياً. على الرغم من أهميتها، بدأت تقنيات تتبع الأحداث العصبية مع القرار الخلوي في الظهور. Neuromodulators, مثل الدوبامين, إفراز, أستيل, والسيروتونين, تؤدي الأحداث الإشارات داخل الخلايا عن طريق مستقبلات البروتين G الخاصة بهم إلى تحوير الإثارة العصبية, الاتصالات متشابك, وغيرها من الخلايا العصبية وظائف، وبالتالي تنظيم معالجة المعلومات في شبكة الخلايا العصبية. تتلاقى المعوّقات العصبية المذكورة أعلاه على مسار كيناز/بروتين cAMP/protein (PKA). لذلك، في التصوير PKA في الجسم الحي مع قرار خلية واحدة وضعت كقراءة للأحداث neuromodulatory بطريقة مماثلة لتصوير الكالسيوم للأنشطة الكهربائية العصبية. هنا، يتم تقديم طريقة لتصور نشاط PKA على مستوى الخلايا العصبية الفردية في قشرة الفئران التي تتصرف في الرأس ثابتة. للقيام بذلك، يتم استخدام مراسل نشاط A-kinase محسنة (AKAR)، ودعا tAKARα، الذي يقوم على Förster نقل الطاقة الرنين (FRET). يتم إدخال هذا الاستشعار PKA ترميز وراثيا في القشرة الحركية عن طريق في الكهربائي الرحم (IUE) من بلازميدات الحمض النووي، أو حقن مجسمة من الفيروس المرتبط بأدينو (AAV). يتم تصوير التغييرات FRET باستخدام اثنين من الفوتون الفلورة التصوير المجهري مدى الحياة (2pFLIM)، والذي يقدم مزايا على قياسات FRET ratiometric لتحديد كمية إشارة افري في أنسجة الدماغ مبعثرة الضوء. لدراسة أنشطة PKA أثناء الحركة القسرية، يتم تصوير tAKARα من خلال نافذة الجمجمة المزمنة فوق قشرة الفئران اليقظة، وثابتة الرأس، والتي تعمل أو تقع على جهاز المشي الآلية التي تسيطر عليها السرعة. وسوف ينطبق هذا النهج التصويري على العديد من مناطق الدماغ الأخرى لدراسة أنشطة PKA المقابلة الناجمة عن السلوك وعلى أجهزة الاستشعار الأخرى القائمة على FLIM في التصوير الحي.

تسمح مستشعرات FRET-FLIM بتصور العديد من مسارات الإشارات المختلفة، بما في ذلك مسار CAMP/PKA المتضمن في التشكيل العصبي. يستخدم البروتوكول الحالي مستشعر tAKARα الذي تم تطويره مؤخرًا مع 2pFLIM لتصور أنشطة PKA في الفئران التي تتصرف بالرأس. ويمكن ترقية معظم المجاهر القائمة ذات الفوتونين بقد...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

يتم تقديم إجراء لتصور أنشطة البروتين كيناز A في الفئران الثابتة الرأس، وتتصرف. يتم التعبير عن مراسل نشاط A-kinase محسنة، tAKARα، في الخلايا العصبية القشرية وجعلها في متناول للتصوير من خلال نافذة الجمجمة. يتم استخدام اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية لتصور أنشطة PKA في الجسم الحي أثناء الحركة القسرية.

تصور البروتين كيناز نشاط في الفئران يتصرف الرأس ثابتة باستخدام في فيفو اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

أسلوبنا يستخدم رواية كيناز البروتين استشعار يسمى الهدف مراسل نشاط كيناز ألفا، أو tAKAR

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

إجراء استئصال القحف لتصور الأنشطة العصبية في قرن آمون من الفئران Behaving

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...