Name: visualizing protein kinase a activity in head-fixed behaving mice using in vivo two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2019-06-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

אנו מודים לגב טס י. לאמייר, גב' רות פרנק וד ר מיכאל א. מוניק לעריכה והערות, וד ר ריודהי יאסין במקס פלאנק פלורידה לתוכנת הרכישה של 2pFLIM. עבודה זו נתמכת על ידי שני פרסי יוזמת המוח U01NS094247 (ז ו ט) ו R01NS104944 (ז ו ט), R01 המענק R01NS081071 (ט), ו R21 מענק R21NS097856 (ז). כל הפרסים הם מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ, ארצות הברית.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אורגון בריאות ומדע אוניברסיטת.
1.2Flim התקנת מיקרוסקופ
<ol><li>התקן מודול ספירת הפוטון (לפטין, טבלת החומרים) והתחבר למחשב (איור 1) לפי המדריך של היצרן. הערה: בדרך כלל, מד...

<ol>
	<li>Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurobiology+of+Slow+Synaptic+Transmission.">The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission.</a> Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).</li><li>Petersen, S. E., Posner, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+attention+system+of+the+human+brain:+20+years+after.">The attention system of the human brain: 20 years after.</a> Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).</li><li>Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+and+Corticotropin-Releasing+Hormone:+Partners+in+the+Neural+Circuits+that+Underpin+Stress+and+Anxiety.">Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety.</a> Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).</li><li>Berke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+dopamine+mean?.">What does dopamine mean?.</a> Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+G&#945;q-Coupled+Neuromodulator+Receptors+Activate+Protein+Kinase+A.">Endogenous G&#945;q-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A.</a> Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).</li><li>Madison, D. V., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+3&#8217;,5&#8217;-monophosphate+mediates+beta-receptor+actions+of+noradrenaline+in+rat+hippocampal+pyramidal+cells.">Cyclic adenosine 3&#8217;,5&#8217;-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).</li><li>Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+signaling+cascades+for+LTP+induction.">A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction.</a> Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).</li><li>Pedarzani, P., Storm, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+mediates+the+effects+of+monoamine+transmitters+on+the+K++current+underlying+the+slow+spike+frequency+adaptation+in+hippocampal+neurons.">PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons.</a> Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).</li><li>Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+isoforms,+neural+pathways,+and+behaviour:+making+the+connection.">PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).</li><li>Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-+and+Cell+Type-Specific+Modulation+of+Excitatory+Neuronal+Activity+in+the+Neocortex.">Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).</li><li>Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+trends+in+in+vivo+neurochemical+monitoring+by+microdialysis.">Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).</li><li>Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hitchhiker&#8217;s+Guide+to+Voltammetry:+Acute+and+Chronic+Electrodes+for+In+Vivo+Fast-Scan+Cyclic+Voltammetry.">Hitchhiker&#8217;s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).</li><li>Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+level+brain+imaging+in+behaving+mammals:+An+engineering+approach.">Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach.</a> Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).</li><li>Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+reporters+of+protein+kinase+A+activity+reveal+impact+of+substrate+tethering.">Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).</li><li>Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PKA+activity+sensor+for+quantitative+analysis+of+endogenous+GPCR+signaling+via+2-photon+FRET-FLIM+imaging.">A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging.</a> Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+A-Kinase+Activity+Reporter+for+Imaging+Neuromodulatory+Events+in+Awake+Mice.">A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice.</a> Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).</li><li>Yellen, G., Mongeon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+two-photon+imaging+of+fluorescent+biosensors.">Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).</li><li>Tang, S., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ERK+and+PKA+Activation+in+Single+Dendritic+Spines+during+Structural+Plasticity.">Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity.</a> Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).</li><li>Tillo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liberated+PKA+Catalytic+Subunits+Associate+with+the+Membrane+via+Myristoylation+to+Preferentially+Phosphorylate+Membrane+Substrates.">Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates.</a> Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+spatiotemporal+dynamics+of+neuronal+signaling+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).</li><li>Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+bound+to+microtubule-associated+protein+2.">Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+type+II+PKA+in+neurons.">Subcellular dynamics of type II PKA in neurons.</a> Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li><li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex-,+Hippocampus-,+Thalamus-,+Hypothalamus-,+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+utero+Electroporation+in+the+C57BL/6+Mouse.">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+quantitative+FRET-FLIM+imaging+in+single+dendritic+spines+using+improved+non-radiative+YFP.">Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP.</a> Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).</li><li>Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dark+green+fluorescent+protein+as+an+acceptor+for+measurement+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer.">A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of F&#246;rster resonance energy transfer.</a> Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).</li><li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+behavioral+experiments+in+head-fixed+mice.">Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice.</a> PLoS ONE. 9 (2), (2014).</li><li>Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+amygdala+controls+learning+in+the+lateral+amygdala.">The central amygdala controls learning in the lateral amygdala.</a> Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+signaling+using+two-photon+fluorescent+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).</li><li>Mehta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fluorophore+biosensors+for+sensitive+and+multiplexed+detection+of+signalling+activities.">Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities.</a> Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).</li></ol>

פרוטוקול זה מדגים את השימוש של חיישן-FLIM מחיישנים tAKARα כדי להמחיש את הפעילות העצבית-הפעלת PKA פעולה בראש-קבוע עכברים התנהגות. יישום זה מבוסס על בדיקות נרחבות ומאפיין של tAKARα ב מבחנה ובvivo להפגין כי האות FLIM שהושג הוא רלוונטי לאירועים נוירומודולטיים פיזיולוגיים17. כאן, אחד ביישום vivo,...

הנגיף העצבי, הידוע גם כשידור הסינפטית איטי, מטיל שליטה חזקה על תפקוד המוח במהלך מצבים התנהגותיים שונים, כגון לחץ, עוררות, תשומת לב, ו תנועה1,2,3, 4. למרות חשיבותו, המחקר של מתי והיכן מתרחשים אירועים נוירומודולטוריים הוא עדיין בחיתוליו. נוירואומודולטורים, כולל אצטילכולין, דופמין, נוראדרנלין, סרוטונין, ונוירופפטידים רבים, להפעיל את G חלבון מצמידים קולטנים (GPCRs), אשר בתורו ההדק תאיים מסלולים השני עם חלון רחב של צירי זמן ועד משניות לשעות. בעוד כל מטפל עצבי מפעיל קבוצה ברורה של אירועים איתות, המחנה/חלבון קינאז a (pka) מסלול הוא מסלול מצוי במורד הזרם עבור הרבה נוירומודולטורים1,5. מסלול המחנה/pka מווסת את היכולות הנוירואליות, העברת הסינפטית והפלסטיות6,7,8,9, ולכן, מנגינות את הדינמיקה של רשת עצבית. מכיוון נוירונים שונים או סוגים עצביים לבטא סוגים שונים או רמות של קולטני עצבי מחדש10, את ההשפעות התאיים של אותו מיאואואואואואואואואואואואואואואוטור זהה עשוי להיות הטרוגנית על פני נוירונים שונים, ולכן, צריך להיות למדה ברזולוציה תאית. עד היום, הוא נשאר מאתגר לפקח על אירועים נוירומודולאליים בנוירונים בודדים בvivo במהלך ההתנהגות.
כדי ללמוד את הדינמיקה הטמפורלית של הנוירומודולציה, נדרש מודאליות של הקלטה מתאימה. מיקרודיאליזה ומחזורי סריקה מחזורית משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד שחרור של נוירומודולטורים, אבל הם חסרים את הרזולוציה המרחבית לפקח על אירועים סלולריים11,12. מקבילה לדינמיקה של סידן בשימוש כפרוקסי לפעילות החשמלית העצבית בדימות האוכלוסייה13, הדמיה pka עשוי לשמש כדי לקרוא את האירועים הנוירומודולדיטוריים ברחבי האוכלוסייה העצבית ברזולוציה התאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בכתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז (AKAR) כדי לפקח על פעילויות ה-PKA בvivo במהלך התנהגות בעלי חיים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה בו של אוכלוסיות נירואליות ברזולוציה תת-תאית עם רזולוציה טמפורלית שעוקבת אחר אירועים נוירומודולטוריים פיזיולוגיים.
Akars מורכב מתורם ו לקבלה חלבונים פלואורסצנטי המקושרים על ידי pka זירחון המצע פפטיד ו forkhead הקשורים (fha) התחום הנקשר סרין זרחנת או טראונין של המצע14,15. עם הפעלת מסלול PKA, פפטיד המצע של AKAR הוא זרחי. כתוצאה מכך, התחום FHA נקשר את פפטיד המצע זרחני, ובכך להביא את שני fluorophores לסמיכות, המכונה מצב סגור של AKAR. המצב הסגור של AKAR זרחט מגדיל את העברת האנרגיה של התהודה המוגברת (למעלה) בין התורם לבין הקבלה. מאז שיעור של akars זרחמיים קשורה לרמה של פעילות pka16, את כמות הסריג במדגם ביולוגי ניתן להשתמש כדי לכמת את הרמה של פעילות pka16,17,18, 19,20.
גרסאות מוקדמות של AKARs תוכננו בעיקר עבור שני צבע הדמיה טימטרי14. כאשר הדמיה עמוקה יותר לרקמת המוח, השיטה הטיברמטרית סובלת מעיוות האותות בשל פיזור אור באורך הגל17,18,21. כפי שמתואר להלן, מיקרוסקופ הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית (flim) מבטלת את הבעיה כי flim רק מודד פוטונים הנפלטים על ידי fluorophore התורם18,21. כתוצאה מכך, הקוונפיקציה של הפלימטר של הסריג אינה מושפעת מעומק הרקמה17. בנוסף, "כהה" (כלומר, תשואה קוונטית נמוכה [QY]) המשתנה של הקבלה fluorophore ניתן להשתמש. פעולה זו משחררת ערוץ צבע כדי להקל על מדידת מדידה של תכונות נוירואליות אורתוגונאליות באמצעות הדמיה בו של חיישן שני או מסמן מורפולוגי17,19,20.
הדמיה FLIM לכמת את הזמן כי fluorophore מבלה במצב נרגש, כלומר, החיים הפלואורסצנטית18. שובו של פלואור למדינת הקרקע, ולכן סופו של המדינה הנרגשת, לעתים קרובות מקשר עם פליטת פוטון. למרות פליטת פוטון עבור מולקולה נרגש בודדים הוא סטוכסטי, באוכלוסייה החיים מרושע הזריחה הוא מאפיין של fluorophore מסוים. כאשר אוכלוסייה טהורה של fluorophores מתרגש בו זמנית, הזריחה המתקבלת יהיה לאחר ריקבון מעריכי אחד. קבוע הזמן של ריקבון מעריכי זה מתאים לאורך חיים הזריחה הממוצע, אשר בדרך כלל נע בין אחד לארבע ננושניות עבור חלבונים פלואורסצנטי. שובו של התורם הנלהב fluorophore למדינה הקרקע יכול להתרחש גם על ידי לדאוג. בנוכחות של לדאוג, החיים הפלואורסצנטית של התורם fluorophore מופחת. האקארים הבלתי זרחנים מציגים. אורך חיים של התורמים הארוכים יותר עם זרחון על ידי PKA, החיישן מציג חיים קצרים יותר כי התורם ואת הקבלה fluorophores הובאו זה לזה, והוא מוגבר. הקוונפיקציה של החיים הפלואורסצנטית באוכלוסייה של AKARs ולכן מייצגת את רמת פעילות PKA.
גירסאות מוקדמות של AKARs לא השתמשו בהצלחה עבור הדמיה vivo ברזולוציה תא יחיד. זה נובע בעיקר משרעת האות נמוך של חיישני AKAR להפעלות פיזיולוגיות17. לאחרונה, על ידי השוואת באופן שיטתי חיישני AKAR זמינים עבור שני פוטון הדמיה מיקרוסקופ גלגול החיים (2pFLIM), חיישן שנקרא FLIM-AKAR נמצא כדי להערים על חיישנים חלופיים. יתר על כן, סדרה של משתני flim-akar שנקרא akar ממוקד (takars) פותחו כדי להמחיש פעילות pka במיקומים משניים ספציפיים: microtubules (takarα), ציטוסול (tAKARβ), אקטין (tAKARδ), filamentous אקטין (tAKARε), קרום (tAKARγ), וצפיפות פוסט-סינפטית (tAKARζ). בין טאטרים, takarα הגדילה את משרעת האות הרוויח על ידי נוראדרנלין על ידי 2.7-קיפול. זה מתאים עם הידע כי רוב pka בנוירונים מעוגנת microtubules במצב מנוחה22,23. tAKARα היה האמן הטוב ביותר בין AKARs קיימים עבור 2pFLIM. יתר על כן, tAKARα זיהה פעילות מבחינה פיזיולוגית הרלוונטית PKA הרוויח על ידי נוירומודולטורים מרובים, ואת הביטוי של tAKARα לא לשנות פונקציות נוירואליות17.
לאחרונה, tAKARα השתמשו בהצלחה כדי להמחיש את הפעילויות PKA בראש קבוע עכברים התנהגות17. זה הוכח כי נאכף תנועה המופעל הפעילות pka בסומה של נוירונים בשכבה שטחית (שכבה 1 עד 3, עד עומק של ~ 300 יקרומטר מ pia) ב מנוע, חבית, ויזואלית מערבולות. פעילות PKA תנועה המופעל היה חלק תלוי על איתות באמצעות קולטנים β-אדרררגיות ו קולטני דופמין D1, אבל לא הושפע על ידי היריב D2 הקולטן הדופמין. עבודה זו ממחישה את היכולת של tAKARs לעקוב אחר אירועים נוירומודולליות בvivo באמצעות 2pFLIM.
בפרוטוקול הנוכחי, השיטה כולה לדימות פעילות PKA בעכברים הערים קבועים בראש במהלך פרדיגמה תנועה נאכף מתואר בשישה שלבים. ראשית, תוספת של יכולות 2pFLIM למיקרוסקופ רגיל 2-פוטון (איור 1). שנית, בניית הליכון ממונע (איור 2). שלישית, הביטוי של חיישן tAKARα בקליפת העכבר על ידי אלקטרופורציה של הרחם (IUE) של ה-DNA, או הזרקת סטריאוטקאית של וירוס הקשורים adeno (AAV). פרוטוקולים מצוינים עבור ניתוחים של iue24,25 והזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראלי26 פורסמו בעבר. הפרמטרים המרכזיים שבהם השתמשנו מתוארים להלן. . קדימה, התקנת חלון גולגולת פרוטוקולים מצוינים פורסמו בעבר עבור ניתוח חלון הגולגולת27,28. מתוארים מספר שלבים ששונו מהפרוטוקולים הסטנדרטיים. . חמישית, מופיעה בvivo 2pFLIM שישית, הניתוח של התמונות 2pFLIM (איור 3 ואיור 4). גישה זו צריכה להיות ישימה בקלות רבים אחרים בראש קבוע התנהגות ושטחים המוח.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m cellulose acetate syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2520</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x 0.8 NA water-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRP07220</td>
			<td>Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pin cable</td>
			<td>US digital</td>
			<td>CA-MIC3-SH-NC</td>
			<td>Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum bread board</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1012</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnimalTracker MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass barrier filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500-40m</td>
			<td>Step 1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Step 2.4. Used as mount for rotation sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter</td>
			<td>FST</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular coverslip (5mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101413-528</td>
			<td>Step 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made injection needle holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44114</td>
			<td>Steps 4.3. and 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill; Microtorque ii</td>
			<td>Ram products</td>
			<td>66699</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowsil transparent polymer</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>3-4680</td>
			<td>Step 4.5. Artificial dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation electrode</td>
			<td>Bex</td>
			<td>LF650P5</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bex</td>
			<td>CUY21</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>Step 3.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMimage MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMview MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam-compatible glue (Gorilla White Glue)</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>5201204</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydraulic micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MO-10</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>KG82648R</td>
			<td>Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-noise fast photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422PA-40 or H10769PA-40</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2012b</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor</td>
			<td>Zhengke</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor speed controller</td>
			<td>Elenker</td>
			<td>EK-G00015A1-1</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P14</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PB2</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C1515</td>
			<td>Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR2</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS010</td>
			<td>Step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon timing counting module</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>SPC-150</td>
			<td>Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid: tAKAR&#945; (CAG-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119913</td>
			<td>Step 3.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH4</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90</td>
			<td>Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation sensor</td>
			<td>US digital</td>
			<td>MA3-A10-250-N</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mat</td>
			<td>Rubber-Cal</td>
			<td>B01DCR5LUG</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>6208K433</td>
			<td>Steps 2.3. and 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage 3.6</td>
			<td>Svoboda Lab/Vidrio Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 5.9. and 6.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal splitter</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>HPM-CON-02</td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>1327K66</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic alignment systsem</td>
			<td>David kopf</td>
			<td>1900</td>
			<td>Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>14006</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus: tAKAR&#945; (AAV2/1 hSyn-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119921</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White PE foam roller (8 x 12 inch)</td>
			<td>Fabrication enterprises INC.</td>
			<td>30-2261</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White polystyrene fom ball halves</td>
			<td>GrahamSweet</td>
			<td>200mm diameter 2 hollow halves</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipkicker</td>
			<td>PACER</td>
			<td>PT29</td>
			<td>Step 4.3. Hardening accelerator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein kinase a activity in head-fixed behaving mice using in vivo two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy

הנוירואומודולציה מפעילה שליטה. חזקה על תפקוד המוח בעיות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. למרות החשיבות שלהם, טכנולוגיות למעקב אחר אירועים נוירומודולטוריים עם רזולוציה תאית רק מתחילים להופיע. נוירומודולטיות, כגון דופמין, נוראדרנלין, אצטילכולין, וסרוטונין, ההדק אירועים תאיים מאותת באמצעות משולב חלבון G שלהם קולטנים כדי לווסת את היכולת הנוירולית, תקשורת סינפטית, ועוד עצבי ובכך להסדיר את עיבוד המידע ברשת העצבית. הנוירומודולטורים שהוזכרו לעיל מתכנסים אל המסלול של המחנה/חלבון קינאז A (PKA). לכן, ב vivo PKA הדמיה עם רזולוציה תא יחיד פותחה כבדיקה עבור אירועים נוירומודולאליות באופן אנלוגי לדימות סידן לפעילויות חשמל עצבי. להלן, שיטה מוצגת כדי להמחיש פעילות PKA ברמה של נוירונים בודדים בקליפת הראש-קבוע עכברים מתנהגים. לשם כך, נעשה שימוש בכתב משופר מבית א-קינאז (AKAR), הקרוי tAKARα, המבוסס על העברת אנרגיית תהודה של Förster (לדאוג). זה חיישן ה-pka מקודד גנטית הוא הציג לתוך קליפת המנוע באמצעות אלקטרופורציה הרחם (iue) של DNA פלמידים, או הזרקה סטריאוטקטית של וירוס הקשורים adeno (aav). שינויי השימוש בשיטת הצילום הם הדמיה באמצעות שני פוטון מיקרוסקופ גלגול החיים (2pFLIM), אשר מציע יתרונות על פני מדידות מחדש של מדידת מדידה עבור לכמת את האות ברקמת המוח פיזור אור. כדי ללמוד פעילויות PKA במהלך תנועה נאכף, tAKARα היא התמונה באמצעות חלון הגולגולת כרונית מעל קליפת הראש של הערה, הראשי קבוע עכברים, אשר לרוץ או לנוח על מהירות מבוקרת ממונע הליכון. גישה זו הדמיה יחולו על אזורים רבים אחרים במוח כדי ללמוד התנהגות הנגרמת המושרה פעילויות PKA ועל חיישנים אחרים מבוססי FLIM מבוסס על הדמיה vivo.

החיישנים מאפשרים הדמיה של מסלולים רבים ושונים של אותות, כולל מסלול המחנה/PKA המעורב במניפולציה עצבית. הפרוטוקול הנוכחי מנצל את חיישן tAKARα שפותחה לאחרונה בשילוב עם 2pFLIM כדי להמחיש את פעילויות PKA לתוך הראש קבוע עכברים התנהגות. ניתן לשדרג את רוב שני הפוטונים הקיימים באמצעות יכ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

הליך זה מוצג להמחיש החלבון קינאז פעילות בעכברים קבועים ומתנהגים. כתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז, tAKARα, מתבטאת בנוירונים בקליפת הגולגולת והפכה לנגישה להדמיה דרך חלון גולגולתי. מיקרוסקופ הדמיה של שני פוטון באורך החיים משמש כדי להמחיש פעילויות PKA ב vivo במהלך תנועה נאכף.

ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

השיטה שלנו משתמשת קינאז חלבון חדש חיישן בשם יעד כתב פעילות קינאז אלפא, או tAKAR

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

הליך גולגולתי להדמיית פעילויות עצביות בהיפוקמפוס של עכברים מתנהגים

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...