Name: visualizing protein kinase a activity in head-fixed behaving mice using in vivo two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy
Uploaded: 2019-06-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Biz MS. Tess J. Lameyer, Bayan Ruth Frank, ve Dr Michael A. Muniak düzenlemeler ve yorumlar için, ve Dr Ryohei Yasuda Max Planck Florida 2pFLIM edinme yazılımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma iki beyın girişimi Ödülleri U01NS094247 (H.Z. ve Me) ve R01NS104944 (H.Z. ve tum), bir R01 Grant R01NS081071 (tum) ve bir R21 Grant R21NS097856 (H.Z.) tarafından destekleniyordu. Tüm ödüller Ulusal nörolojik hastalıklar Enstitüsü ve Stroke, Amerika Birleşik Devletleri vardır.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.
1.2pFLIM mikroskop kurulum
<ol><li>Bir foton Zamanlama sayımı modülü (PTCM, malzeme tablosu) yükleyin ve üreticinin kılavuzuna göre bilgisayara (Şekil 1) bağlanın. Not: Ptcm genellikle lazer darbe zamanlaması için bir "Senkronizasyon" girişi ve fotomulti...

<ol>
	<li>Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurobiology+of+Slow+Synaptic+Transmission.">The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission.</a> Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).</li><li>Petersen, S. E., Posner, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+attention+system+of+the+human+brain:+20+years+after.">The attention system of the human brain: 20 years after.</a> Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).</li><li>Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+and+Corticotropin-Releasing+Hormone:+Partners+in+the+Neural+Circuits+that+Underpin+Stress+and+Anxiety.">Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety.</a> Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).</li><li>Berke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+dopamine+mean?.">What does dopamine mean?.</a> Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+G&#945;q-Coupled+Neuromodulator+Receptors+Activate+Protein+Kinase+A.">Endogenous G&#945;q-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A.</a> Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).</li><li>Madison, D. V., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+3&#8217;,5&#8217;-monophosphate+mediates+beta-receptor+actions+of+noradrenaline+in+rat+hippocampal+pyramidal+cells.">Cyclic adenosine 3&#8217;,5&#8217;-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells.</a> The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).</li><li>Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+signaling+cascades+for+LTP+induction.">A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction.</a> Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).</li><li>Pedarzani, P., Storm, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+mediates+the+effects+of+monoamine+transmitters+on+the+K++current+underlying+the+slow+spike+frequency+adaptation+in+hippocampal+neurons.">PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons.</a> Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).</li><li>Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+isoforms,+neural+pathways,+and+behaviour:+making+the+connection.">PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).</li><li>Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-+and+Cell+Type-Specific+Modulation+of+Excitatory+Neuronal+Activity+in+the+Neocortex.">Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).</li><li>Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+trends+in+in+vivo+neurochemical+monitoring+by+microdialysis.">Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).</li><li>Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hitchhiker&#8217;s+Guide+to+Voltammetry:+Acute+and+Chronic+Electrodes+for+In+Vivo+Fast-Scan+Cyclic+Voltammetry.">Hitchhiker&#8217;s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).</li><li>Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+level+brain+imaging+in+behaving+mammals:+An+engineering+approach.">Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach.</a> Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).</li><li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters.">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).</li><li>Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+reporters+of+protein+kinase+A+activity+reveal+impact+of+substrate+tethering.">Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).</li><li>Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PKA+activity+sensor+for+quantitative+analysis+of+endogenous+GPCR+signaling+via+2-photon+FRET-FLIM+imaging.">A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging.</a> Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).</li><li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Sensitive+A-Kinase+Activity+Reporter+for+Imaging+Neuromodulatory+Events+in+Awake+Mice.">A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice.</a> Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).</li><li>Yellen, G., Mongeon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+two-photon+imaging+of+fluorescent+biosensors.">Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).</li><li>Tang, S., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ERK+and+PKA+Activation+in+Single+Dendritic+Spines+during+Structural+Plasticity.">Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity.</a> Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).</li><li>Tillo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liberated+PKA+Catalytic+Subunits+Associate+with+the+Membrane+via+Myristoylation+to+Preferentially+Phosphorylate+Membrane+Substrates.">Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates.</a> Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+spatiotemporal+dynamics+of+neuronal+signaling+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).</li><li>Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+bound+to+microtubule-associated+protein+2.">Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+type+II+PKA+in+neurons.">Subcellular dynamics of type II PKA in neurons.</a> Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li><li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex-,+Hippocampus-,+Thalamus-,+Hypothalamus-,+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+utero+Electroporation+in+the+C57BL/6+Mouse.">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+quantitative+FRET-FLIM+imaging+in+single+dendritic+spines+using+improved+non-radiative+YFP.">Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP.</a> Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).</li><li>Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dark+green+fluorescent+protein+as+an+acceptor+for+measurement+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer.">A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of F&#246;rster resonance energy transfer.</a> Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).</li><li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+behavioral+experiments+in+head-fixed+mice.">Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice.</a> PLoS ONE. 9 (2), (2014).</li><li>Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+amygdala+controls+learning+in+the+lateral+amygdala.">The central amygdala controls learning in the lateral amygdala.</a> Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+signaling+using+two-photon+fluorescent+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).</li><li>Mehta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fluorophore+biosensors+for+sensitive+and+multiplexed+detection+of+signalling+activities.">Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities.</a> Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).</li></ol>

Bu protokol, beyin-sabit davranan fareler içinde nöromodülasyon-tetiklenen PKA etkinliğini görselleştirmek için FRET-FLıTM sensörü tAKARα kullanımını gösterir. Bu uygulama, elde edilen FLIM sinyalinin fizyolojik nöroformüller arasındaki olayların17ile alakalı olduğunu göstermek Için tAKARα in vitro ve in vivo kapsamlı test ve karakterizasyonu üzerine kuruludur. Burada, bir in vivo uygulama, motor korteks lokomotif kaynaklı PKA aktivite, beyin sensörü teslim prosedürle...

Neuromodulation, ayrıca yavaş sinaptik iletim olarak bilinen, farklı davranışsal durumlar sırasında beyin fonksiyonu üzerinde güçlü bir kontrol oluşturur, stres gibi, uyarılma, dikkat, ve lokomotasyon1,2,3, 4. önemini rağmen, ne zaman ve nerede nöromodüller olayların yer alır çalışma hala kendi bebeklik içindedir. Nöromodüller, asetilkolin dahil, dopamin, noradrenalin, serotonin, ve birçok nörofobiler, G protein birleştiğinde reseptörleri etkinleştirmek (GPCRs), hangi sırayla sıra tetikleyici hücre içi ikinci haberci yolları zaman çizelgelerin geniş bir pencere ile değişen saniyeye kadar saat. Her nöromodülatör sinyalizasyon olayları ayrı bir dizi tetikler iken, Camp/protein kinaz a (PKA) yolu birçok nöromodüller için ortak bir aşağı yol olduğunu1,5. Kamp/PKA yolu nöronal uyarılabilirlik, sinaptik iletim ve plastisite6,7,8,9düzenler ve bu nedenle, nöronal ağ dinamikleri tunes. Farklı nöronlar veya nöronal türler nöromodüller reseptörlerinin farklı türleri veya seviyeleri ifade çünkü10, aynı hücre içi nöromodüller içinde hücre dışı etkileri farklı nöronlar arasında heterojen olabilir, ve böylece, olması gerekir hücresel çözünürlükte okudu. Bugüne kadar, davranış sırasında bireysel nöronlar in vivo nöromodüller olayları izlemek için zor kalır.
Nöromodülasyonun yer alan dinamiklerini incelemek için uygun bir kayıt modalitesi gereklidir. Mikrodializ ve hızlı tarama döngüsel voltammetri sık nöromodüller serbest çalışma için kullanılır, ancak hücresel olayları izlemek için uzamsal çözünürlük eksikliği11,12. Nüfus görüntüleme13nöronal elektrik aktivitesi için bir vekil olarak kullanılan kalsiyum dinamiklerine benzer, PKA görüntüleme hücresel çözünürlükte nöronal bir nüfus arasında nöromodüller olayları okumak için kullanılabilir. Mevcut protokol, hayvan davranışları sırasında PKA etkinliklerini izlemek için geliştirilmiş A-kinase aktivite muhabirinin (AKAR) kullanımını açıklar. Burada açıklanan yöntem, fizyolojik nöromodüller içeren olayları izleyen temporal çözünürlüğe sahip hücre dışı çözünürlükte nöronal nüfusun eşzamanlı olarak görüntülenmesi için izin verir.
Akars bir donör ve bir PKA fosforilasyon substrat peptid ve bir Forkhead-ilişkili (FHA) alan, alt substrat fosforile serin veya treonin bağlanan bir Acceptor floresan proteinleri oluşur14,15. PKA yolunun aktivasyonu üzerine, AKAR substrat peptid fosforilated olduğunu. Sonuç olarak, FHA etki alanı fosforilated substrat peptid bağlar, böylece yakın yakınlığı içine iki fluorophores getiren, AKAR kapalı devlet olarak anılacaktır. Fosforilated AKAR 'ın kapalı durumu, donör ve alıcı fluorophores arasındaki Förster rezonans enerji transferinin (FRET) artması ile sonuçlanır. Fosforile akars oranı PKA aktivite16düzeyine bağlı olduğundan, biyolojik bir örnekteki fret miktarı PKA aktivite seviyesini ölçmek için kullanılabilir16,17,18, 19,20.
AKARs 'ın erken versiyonları, öncelikle iki renkli onay görüntüleme14için tasarlanmıştır. Beyin dokusuna daha derin görüntüleme yapılırken, onay yöntemi, dalga boyu bağımlı ışık saçılma17,18,21nedeniyle sinyal distorsiyonu muzdarip. Aşağıda anlatıldığı gibi, floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi (flim) Bu sorunu ortadan kaldırır, çünkü flim sadece florophore18,21tarafından yayılan fotonları ölçer. Sonuç olarak, FRET 'in FLıTM ölçümü doku derinliği17' den etkilenmez. Buna ek olarak, bir "karanlık" (yani, düşük kuantum verimi [QY]) alıcı fluorophore varyantı kullanılabilir. Bu, ikinci bir sensördeki eşzamanlı görüntüleme veya morfolojik Marker17,19,20ile ortogonal nöronal özelliklerin çoğullu ölçümünü kolaylaştırmak için bir renk kanalını serbest bırakır.
FLM görüntüleme bir fluorophore heyecanlı durumda, yani, floresan ömrü18harcıyor zaman nicelik. Bir fluorophore zemin devlet, böylece heyecanlı devletin sonuna dönüş, genellikle bir foton emisyonu ile koncomitates. Bireysel bir heyecanlı molekül için bir foton emisyon Stokastik olmasına rağmen, bir nüfusun ortalama floresan ömrü bu özel fluorophore bir özelliğidir. Florozların saf nüfusu aynı anda heyecanlı olduğunda, ortaya çıkan floresan tek bir üstel çürüme takip edecektir. Bu üstel çürümenin zaman sabiti, genellikle floresan proteinleri için bir ila dört nanosaniyeden oluşan ortalama floresans ömürüne karşılık gelir. Bir heyecanlı donör fluorophore zemin devlet dönüş de FRET tarafından ortaya çıkabilir. FRET varlığında, donör fluorophore floresans ömrü azalır. Fosforlu AKARs, nispeten daha uzun donör floresans ömrünü sergiler. PKA tarafından fosforilasyon üzerine, sensör daha kısa bir ömür sergiliyor çünkü donör ve alıcı fluorophores birbirlerine yakın getirilir ve FRET artar. AKARs nüfusunun floresans ömrünü ölçmek bu nedenle PKA aktivitesinin seviyesini temsil eder.
AKARs 'ın erken versiyonları, tek hücreli çözünürlükte in vivo görüntüleme için başarıyla kullanılmadı. Bu esas olarak, AKAR sensörlerin düşük sinyal amplitüle fizyolojik aktivasyonlarının17' si nedeniyle olur. Son zamanlarda, iki foton floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (2pFLIM) için mevcut AKAR sensörlerini sistematik olarak karşılaştırarak, alternatif sensörlerin daha fazla gerçekleştirilmesi için FLIM-AKAR denilen bir sensör bulunmuştur. Ayrıca, hedeflenen akars (takars) denilen flim-akar türevleri bir dizi belirli alt hücresel konumlarda PKA etkinliğini görselleştirmek için geliştirilmiştir: mikrotübüller (takarα), sitossol (takarβ), aktin (takarδ), filasentous aktin (takarε), membran (takarγ), ve postsinaptik yoğunluk (tAKARζ). TAKARs arasında, tAKARα 2,7-Fold tarafından norepinefrin tarafından ortaya çıkarılan sinyal genliği arttı. Bu bilgi ile tutarlı olduğunu PKA nöronlar çoğunluğu mikrotübüller için dinlenme durumunda demirlemiş22,23. tAKARα 2pFLIM için mevcut AKARs arasında en iyi oyuncu oldu. Ayrıca, tAKARα birden fazla nöromodüller tarafından saptanan fizyolojik olarak ilgili PKA aktivitesini algıladı ve tAKARα ifadesi nöronal fonksiyonları17değiştirmez.
Son zamanlarda, tAKARα başarıyla kafa sabit davranan fareler17PKA etkinliklerini görselleştirmek için kullanıldı. Bu uygulanan lokomotif yüzeysel tabaka nöronların Soma içinde PKA etkinliğini tetikleyen gösterildi (Katman 1 ile 3, bir derinliğe kadar ~ 300 μm Pia) motor, varil, ve görsel korseleler. Lokomotlama tetiklenen PKA aktivitesi, β-adrenergik reseptörleri ve D1 Dopamin reseptörlerinin sinyallerine bağlı olarak, ancak D2 dopamin reseptör antagonisti tarafından etkilenmez. Bu çalışma, takars 'ın 2pflim kullanarak nöromodülasyon olaylarını izleme yeteneğini göstermektedir.
Geçerli protokolde, uygulanan lokomotif paradigma sırasında baş sabit uyanık fareler içinde PKA aktivite görüntüleme için tüm yöntem altı adımda açıklanmıştır. İlk olarak, geleneksel iki foton mikroskobu 2pFLIM yetenekleri eklenmesi (Şekil 1). İkincisi, motorlu bir koşu bandı inşaatı (Şekil 2). Üçüncü olarak, DNA plazmidlerin utero Elektroporasyon (IUE) veya Adeno ile ilişkili virüsün (AAV) stereotaktik enjeksiyonu ile fare korteksinde takarα sensörünün ifadesi. IUE için ameliyatlar için mükemmel protokoller24,25 ve viral parçacıklar stereotaktik enjeksiyon26 daha önce yayınlandı. Kullanılan anahtar parametreler aşağıda açıklanmıştır. İleri, kraniyal pencerenin montajı. Mükemmel protokoller daha önce kranial pencere cerrahisi için yayımlandı27,28. Standart protokollerden değiştirilmiş birkaç adım açıklanmıştır. Beşinci, performans içinde vivo 2pFLIM. Altıncı, 2pFLIM görüntü analizleri (Şekil 3 ve Şekil 4). Bu yaklaşım, diğer birçok baş-sabit davranışsal paradigmalar ve beyin alanları için kolayca uygulanabilir olmalıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m cellulose acetate syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2520</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x 0.8 NA water-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRP07220</td>
			<td>Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pin cable</td>
			<td>US digital</td>
			<td>CA-MIC3-SH-NC</td>
			<td>Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum bread board</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1012</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnimalTracker MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass barrier filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500-40m</td>
			<td>Step 1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Step 2.4. Used as mount for rotation sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter</td>
			<td>FST</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular coverslip (5mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101413-528</td>
			<td>Step 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made injection needle holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44114</td>
			<td>Steps 4.3. and 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill; Microtorque ii</td>
			<td>Ram products</td>
			<td>66699</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowsil transparent polymer</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>3-4680</td>
			<td>Step 4.5. Artificial dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation electrode</td>
			<td>Bex</td>
			<td>LF650P5</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bex</td>
			<td>CUY21</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>Step 3.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMimage MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMview MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam-compatible glue (Gorilla White Glue)</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>5201204</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydraulic micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MO-10</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>KG82648R</td>
			<td>Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-noise fast photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422PA-40 or H10769PA-40</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2012b</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor</td>
			<td>Zhengke</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor speed controller</td>
			<td>Elenker</td>
			<td>EK-G00015A1-1</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P14</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PB2</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C1515</td>
			<td>Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR2</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS010</td>
			<td>Step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon timing counting module</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>SPC-150</td>
			<td>Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid: tAKAR&#945; (CAG-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119913</td>
			<td>Step 3.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH4</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90</td>
			<td>Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation sensor</td>
			<td>US digital</td>
			<td>MA3-A10-250-N</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mat</td>
			<td>Rubber-Cal</td>
			<td>B01DCR5LUG</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>6208K433</td>
			<td>Steps 2.3. and 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage 3.6</td>
			<td>Svoboda Lab/Vidrio Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 5.9. and 6.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal splitter</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>HPM-CON-02</td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>1327K66</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic alignment systsem</td>
			<td>David kopf</td>
			<td>1900</td>
			<td>Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>14006</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus: tAKAR&#945; (AAV2/1 hSyn-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119921</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White PE foam roller (8 x 12 inch)</td>
			<td>Fabrication enterprises INC.</td>
			<td>30-2261</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White polystyrene fom ball halves</td>
			<td>GrahamSweet</td>
			<td>200mm diameter 2 hollow halves</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipkicker</td>
			<td>PACER</td>
			<td>PT29</td>
			<td>Step 4.3. Hardening accelerator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein kinase a activity in head-fixed behaving mice using in vivo two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy

Nöromodüller beyin fonksiyonunda güçlü kontrol sağlar. Nöromodüller sistemlerinin fonksiyon bozukluğu nörolojik ve psikiyatrik bozukluklarla sonuçlanır. Önemini rağmen, hücresel çözünürlük ile nöromodüller olayları izlemek için teknolojiler sadece ortaya çıkmaya başlıyor. Nöromodulatörler, dopamin gibi, norepinefrin, asetilkolin, ve serotonin, onların ilgili G protein-bağlantılı reseptörleri ile nöronal uyarabilirlik modüle için hücre içi sinyal olayları tetikleyici, sinaptik iletişim, ve diğer nöronal fonksiyonları, böylece nöronal ağda bilgi işleme düzenleyen. Yukarıda belirtilen nöromodüller cAMP/protein kinaz A (PKA) yolu üzerine yakınsama. Bu nedenle, tek hücreli çözünürlüğe sahip in vivo PKA görüntüleme, nöronal elektrik faaliyetleri için kalsiyum görüntülemede benzer bir şekilde nöromodüller olayları için bir okuma olarak geliştirilmiştir. Burada, bir yöntem kafa sabit davranan fareler korteks bireysel nöronlar düzeyinde PKA etkinliğini görselleştirmek için sunulmaktadır. Bunu yapmak için, Förster rezonans enerji transferine (FRET) dayanan, tAKARα adlı geliştirilmiş A-kinaz aktivite muhabiri (AKAR) kullanılır. Bu genetik olarak kodlanmış PKA sensörü, DNA plazmidlerinin utero Elektroporasyon (IUE) veya Adeno ile ilişkili virüsün (AAV) stereotaktik enjeksiyonu ile motor korteks haline getirilmiştir. FRET değişiklikleri iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu (2pFLIM), ışık-saçılma beyin dokusunda FRET sinyali ölçmek için onay FRET ölçümleri üzerinde avantajları sunan kullanılarak görüntülenmiş. Zorunlu lokomotif sırasında PKA etkinliklerini incelemek için tAKARα, hızlı kontrollü bir motorlu koşu bandı üzerinde çalışan veya istirahat eden, uyanık, baş sabit fareler korteks üzerinde kronik kraniyal pencere aracılığıyla görüntülenmiştir. Bu görüntüleme yaklaşımı, ilgili davranışlara bağlı PKA etkinliklerini ve diğer FLIM tabanlı sensörlere in vivo görüntüleme için çalışmak üzere diğer birçok beyin bölgesine geçerli olacaktır.

FRET-FLıTM sensörleri, neuromodulation ile ilgili cAMP/PKA yolu da dahil olmak üzere birçok farklı sinyalizasyon yollarının görselleştirilmesine olanak tanır. Geçerli protokol, son zamanlarda geliştirilen tAKARα sensörünü 2pFLIM ile kombinasyon halinde kullanır ve kafa sabit davranan farelerde PKA etkinliklerini görselleştirebilir. Çoğu mevcut iki foton mikroskopları, Şekil 1 ' de gösterildiği gibi üç ila dört bileşen ekleyerek 2p...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Bir prosedür protein kinaz görselleştirmek için sunulmuştur baş-sabit, davranan fareler bir aktivite. Gelişmiş A-kinaz aktivite muhabiri, tAKARα, kortikal nöronlar içinde ifade edilir ve kafatası penceresinden görüntüleme için erişilebilir hale gelmiştir. İki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi, uygulanan lokomotif sırasında PKA etkinliklerini görselleştirmek için kullanılır.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Yöntemimiz yeni bir protein kigaz bir sensör hedef A kiazaktivite muhabiri alfa veya tAKAR denilen kullanır

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Behaving Farelerinin Hipokampusunda Nöronal Aktiviteleri Görselleştirmek için Kraniyotomi Prosedürü

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...