Name: assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende vores finansieringskilde: NIH R01 EY05661 til J. E. H, Ines gehring for at hjælpe med at generere aqp0a/b dobbelt mutanter og: zebrafisk opdræt, Dr. Daniel dranow for diskussioner, der fører til generation af transgenics, Dr. Bruce Blumberg og Dr. Ken Cho's laboratorier for brug af deres dissekere mikroskoper, og Dr. Megan Smith for hjælp med statistisk analyse.

De dyre protokoller, der anvendes i denne undersøgelse, overholder ARVO-erklæringen om brug af dyr i oftalmisk forskning og Synsundersøgelse og er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) fra University of California, Irvine.

1. opdræt af zebrafish og eutanasi
<ol><li>Hæv og vedligehold zebrafisk (AB stamme) under standard laboratoriebetingelser12. Fostre embryoner i embryonale medium (EM)12. Ti...

<ol>
	<li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens.">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li><li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+Zero+Puzzle.">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li><li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0.">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion.">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li><li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49.">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration.">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li><li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes.">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li><li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish.">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lens+development+in+the+zebrafish:+A+three-dimensional+time-lapse+analysis.">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. 261, 59-94 (2002).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+&#946;B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish.">Recapitulation of human &#946;B1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li><li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye.">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye.">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell &#38; Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li><li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens.">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li><li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics.">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68 (2016).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases.">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research.">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li><li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens.">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li><li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens.">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li><li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency.">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li><li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development.">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li><li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+(NKCC1)+and+sodium+chloride+cotransporter+(NCC)+and+their+effects+on+rat+lens+transparency.">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5/fibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish.">Integrin &#945;5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li><li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish.">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li></ol>

Analyse af: zebrafisk linse morfologi er det første skridt til at forstå fænotyper i mutanter, eller virkningerne af farmakologiske interventioner rettet mod at studere biologi af okulær linse. Vi skitserer metoder til at analysere linse suturer, kortikale fiber celle morfologi og aspekter af linsen kerne. Disse tilgange er en kombination af in vitro og in vivo (sammenlignet i tabel 1). In vitro metoderne giver mulighed for større detaljering af den ydre kortikale cellers ...

Den: zebrafisk er en glimrende model for at studere linse udvikling og fysiologi på grund af de anatomiske ligheder med pattedyrs linser, relativ lethed af genetiske og farmakologiske manipulation, hastighed af embryonale øjen udvikling, lille størrelse og gennemsigtighed tidligt stadie, hvilket muliggør in vivo -billeddiagnostik. De metoder, der er beskrevet her blev udviklet til at analysere: zebrafisk linse morfologi på embryonale og voksne stadier med fokus på den suturmæssige integritet, kortikale membran morfologi in vitro og in vivo, og placeringen af linsen nukleare position langs forreste-posteriort akse ex vivo. Disse metoder tjener som udgangspunkt for funktionelle undersøgelser af linse udvikling og fysiologi, samt omvendte genetiske skærme til linse fænotyper i zebrafish.
Billeddannende zebrafisklinse morfologi
Aquaporin 0 (AQP0) er den mest rigelige linse membran protein og er afgørende for både linse udvikling og klarhed, på grund af flere væsentlige funktioner i pattedyr. Zebrafish har to Aqp0s (Aqp0a og Aqp0b), og vi har udviklet metoder til at analysere tabet af deres funktioner i både embryonale og voksne linser. Vores undersøgelser afslører, ataqp0a-/-mutanter udvikler forreste polær uigennemsigtighed på grund af ustabilitet i den forreste sutur, og aqp0a/b dobbelt mutanter udvikler nuklear opacitet1. AQP0 har vist sig at spille roller i vand transport2, vedhæftning3,4, cytoskeletale forankring5 og generering af brydningsindeks gradient6, men disse undersøgelser er stort set blevet udført i vitro-diagnostik. Den: zebrafisk giver en unik mulighed for at studere, hvordan tab af funktion, eller forstyrres funktion af Aqp0a eller Aqp0b ville påvirke morfologi og funktion i en levende linse. For at vurdere cellernes morfologi og den kulturelle integritet under udviklingen ændrede vi eksisterende in vitro immunohistokemiske metoder7 til brug i embryonale og voksne linser og genererede transgenics til at overvåge denne proces in vivo .
Immunohistokemisk analyse af plasma membran struktur og den suturmæssige integritet blev udført i hele faste embryoner og voksne linser. Zebrafish linser er ekstremt små (linse diameter er ~ 100 μm i embryoner og op til 1 mm hos voksne) sammenlignet med deres pattedyr-modparter og har punkt suturer8, som sjældent fanges i kryosektioner. Således hele linser er afgørende for at analysere den kulturelle integritet. Til in vivo analyse af forreste sutur dannelse, og billeddannelse af præcis linse celle arkitektur, genererede vi transgenics udtrykker Mapple specifikt mærkning linse membraner.
Fordele ved levende billeddannelse af linse membran transgenics omfatter: 1) undgå fiksering artefakter, 2) studere dynamiske morfologiske ændringer i time-lapse film, og 3) muliggør langsgående undersøgelser, hvor tidligere begivenheder kan korreleres med senere Fænotyper. Pigmentering af iris forhindrer normalt klar billeddannelse af objektivets periferi. Tilsætning af 1-phenyl 2-thiourea (PTU) før primordia-5 (Prim-5) stadie9 forhindrer melanogenese og øjen pigmentering op til omkring 4 dage efter befrugtning (DPF). Efter 4 DPF skjules objektivets periferi dog in vivo, især i ældre stadier. Endvidere, tætheden af linsen selv tilslører billeddannelse af sin posterior stang. Derfor, for at studere morfologi af linsen periferi, eller posterior sutur, efter 4 DPF, linser skal være fjernet og fast.
Transgene: zebrafisk linjer er blevet anvendt til at analysere embryonale linse membran struktur i vivo10. Q01 transgene udtrykker et cyan fluorescerende protein, der er smeltet til en membran målretnings sekvens, Gap43, drevet af EF1α promoter og en hexamer af DF4 PAX6 forstærker-elementet allestedsnærværende i linse fiber celler11. Q01 har ekstra-lenkulære udtryk, herunder amacrine celler i nethinden, som tilføjer baggrunds signal, hvis den primære interesse er linsen. Vi udviklede en roman transgene linje, der udtrykker en membran-tøjret mApple specifikt i linsen, med det formål at undgå enhver ekstra-linse-signal.
Lokalisering af linse kerne
Vi opdagede, at linse kernen bevæger sig fra en indledende forreste placering i larve: zebrafisk til en central placering i den forreste-posterior akse i voksne linser. Dette skift i positionen af den høje brydningsindeks linse kerne menes at være et krav til normal udvikling af: zebrafisk linse optik1. Vores metoder muliggør kvantificering af objektivets nukleare centralisering i forhold til linse radius. Ved hjælp af denne metode, vi viste, at Aqp0a er nødvendig for linse nuklear centralisering1, og denne enkle metode kan anvendes til andre undersøgelser af udviklingen og fysiologi af linsen og dens optiske egenskaber i: zebrafisk model.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">P7629</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; very toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:310px;">4% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:118px;">RT 157-4</td>
			<td>CAUTION &#8211; health hazard, combustible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Cryostat</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:118px;">CM3050S</td>
			<td style="width:258px;">Objective and chamber temperature set to -21&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">D1306</td>
			<td>CAUTION &#8211; irritating to eyes and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">D128</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; combustible, penetrates skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable base mold</td>
			<td style="width:196px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:118px;">15154-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable Pasteur glass pipets</td>
			<td style="width:196px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td>Keep forceps sharpened</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">A5040</td>
			<td>CAUTION - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)</td>
			<td style="width:196px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:118px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Glycerol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hu&#946;B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td>
			<td style="width:196px;">Addgene</td>
			<td style="width:118px;">ID:122451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">Wayne Rasband, NIH</td>
			<td style="width:118px;">v1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Low Melt Agarose (LMA)</td>
			<td style="width:196px;">Apex</td>
			<td style="width:118px;">902-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">V 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements AR software</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus&#160; with a model 2.1.1.183 controller</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus microscope&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phalloidin-Alexa Flour 546</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:118px;">A22283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phenol Red indicator (1% w/v)</td>
			<td style="width:196px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:118px;">5725-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">BP399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Photoshop</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Apo 60x/1.2 WD objective</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Power source</td>
			<td style="width:196px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:118px;">MTr 22</td>
			<td>Or equivalent power source&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Slide warmer model No. 26020FS</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:310px;">Sodium Hydroxide beads</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">S612-3</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Superfrost/Plus microscope slide</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Sylgard 184 silicone Dow Corning</td>
			<td style="width:196px;">World Prevision Instruments</td>
			<td style="width:118px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:196px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:118px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Triton X-100 BioXtra</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">T9284</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vannas micro-dissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:118px;">1346</td>
			<td>Sharp/sharp straight tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vectashield antifade mouting medium</td>
			<td style="width:196px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:118px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">W11262</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity

Den zebrafisk er unikt egnet til genetisk manipulation og in vivo Imaging, hvilket gør det til en stadig mere populær model for reverse genetiske undersøgelser og for generation af transgenics for in vivo Imaging. Disse unikke kapaciteter gør Zebrafisken til en ideel platform til at studere okulær linse udvikling og fysiologi. Vores nylige fund, at en aquaporin-0, Aqp0a, er nødvendig for stabiliteten af den forreste linse sutur, samt for skiftet af linsen kerne til linsen Center med alderen førte os til at udvikle værktøjer specielt velegnet til at analysere egenskaberne af: zebrafisk linser. Her skitserer vi detaljerede metoder til linse dissektion, der kan anvendes til både larve og voksne linser, til at forberede dem til histologisk analyse, immunhistokemi og billeddannelse. Vi fokuserer på analyse af linse sutur integritet og kortikale celle morfologi og sammenligne data genereret fra dissekerede linser med data fra in vivo billedbehandling af linse morfologi muliggjort af en roman transgene: zebrafisk linje med en genetisk kodede fluorescerende markør. Analyse af dissekerede linser vinkelret på deres optiske akse gør det muligt at kvantificere den relative position af linse kernen langs den forreste-posteriore akse. Bevægelse af linse kernen fra en indledende forreste position til centrum er nødvendig for normal linse optik i voksne zebrafisk. Således en kvantitativ måling af linsen nukleare position direkte korrelerer med sine optiske egenskaber.

Voksne: zebrafisk øjen anatomi ligner nøje pattedyr (figur 1a). På trods af nogle forskelle mellem zebrafisk og pattedyr øjne, såsom at have en ciliære zone i stedet for en ciliære krop17, forskelle i optiske egenskaber18, og forskelle i morfogenese under fosterudvikling19, den : zebrafisk Eye er en glimrende model til at studere øjen udvikling og forståelse oftalmologiske sygdom...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Disse protokoller blev udviklet til at analysere kortikale linse morfologi, strukturel integritet af: zebrafisk linse suturer i faste og levende linser og til at målepositionen af zebrafisklinsen kerne langs den forreste-posteriore akse.

Vurdering af Zebrafish linse kerne lokalisering og Sutural integritet

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Vores protokoller giver et udgangspunkt for funktionelle undersøgelser af linseudvikling og fysiologi og for omvendt genetisk screening af linsefenotyper i zebrafisk. Vores protokoller bro in vitro og in vivo analyser af zebrafisk linse membran morfologi og giver en ny og ligetil metode til kvantificering af udviklingen af zebrafisk linse optik. Analyse zebrafisk linse morfologi og optik fører til indsigt i mekanismer, der styrer linsen udvikling, normal fysiologi, og patofysiologi.Disse indsigter kan igen føre til en evne til at forsinke eller forhindre grå stær. Der har ikke været rapporter hos andre arter end zebrafisk af asymmetrisk lokaliserede linsekerner. Identifikation linse suturer er afgørende for korrekt orientering af linsen til at måle kernen lokalisering.Efter bekræftelse af tilstrækkelig sedation med Tricaine, bruge microdissection saks til straks punktafgifter begge øjne fra enten en voksen eller en larve zebrafisk og placere begge øjne i en 35-millimeter specialfremstillet Petriskål med en silikone dissektion skimmel fyldt med PBS. At høste linsen fra en voksen zebrafisk, placere øjet posterior side op og indsætte snævle i en mindre end 45-graders vinkel gennem den optiske disk. Brug dissektion saks til at gøre to eller tre radiale indsnit gennem nethinden og sclera fra den optiske disk til ciliaere zone i immobiliserede øje og skræl tilbage nethinden og sclera som blomsterblade.Inverter øjet, hornhinde-side op, og bruge den flade side af saksen til at immobilisere linsen indirekte via manipulation af sclera og hornhinden ved hjælp af kraftvipper til at trække væk nethinden og fastgjort væv, derefter forsigtigt trimme væk overskydende væv fra linsen. For larve zebrafisk linse høst, placere en larve øje posterior side op på den flade del af en silikone skål af PBS og bruge en skærpet wolfram nål til at gøre radiale nedskæringer gennem nethinden og sclera mens immobilisere øjet med en anden nål eller forrektrene, derefter forsigtigt øse linsen fra dissociated øjet med stumpside af en skræddersyet wolfram-wire nål og omhyggeligt trække det vedlagte væv. For at måle den forreste-posterior akse linse kerne lokalisering, orientere frisk-punkterede linser akse i PBS i en 35-millimeter skål med et dæksel glas bund med poler og suturer orienteret parallelt med planet fokus.For at identificere linsen kernen, kigge efter en forskel i brydningsindeks, som normalt opstår på grænsefladen af linsen cortex og linse kerne. Hvis linsen suturer ikke er synlige, en lille slikke med flæng til linsen kapsel afslører suturer og linsen kernen, hjælpe orientere linsen til målingen. Placer skålen på scenen af en dissektion mikroskop udstyret med et kamera og billede linserne med linsen kernen i fokus under brightfield belysning eller med differentialinterferens kontrast optik.Billede et mikrometer under samme forstørrelse til kalibrering, og klik på Live View. Klik på Snapshot for at hente et billede og gemme billedet som en TIFF-fil. Hvis du vil kalibrere de erhvervede linsebilleder, skal du i et passende billedbehandlingsprogram vælge værktøjet med den lige linje og tegne en linje med kendt længde på mikrometerbilledet.Klik på Analysér og Angiv skalering, og angiv den kendte distance og de kendte enheder, vælg derefter Global kalibrering, og klik på OK. For at måle afstanden fra midten af linsen kernen til den forreste pol, identificere placeringen af linsen sutur og bruge den lige linje værktøj til at tegne en linje på tværs af billedet midten af linsen kernen i en aksial orientering. Midten af denne linje er midten af linsen kernen. Tegn en anden linje fra dette punkt til objektivets forreste pol, og vælg Mål i menuen Analysér for at måle afstanden.Tegn en anden linje fra den forreste pol til den bageste pol og måle denne afstand som linsen diameter, derefter kopiere disse længder fra vinduet Resultater til et regneark og beregne normaliseret lokalisering af linsen kernen med hensyn til linsen radius. Ved tre dage efter befrugtningen dannes forreste suturer på den forreste pol, og den slående konvergens af celler visualiseres tydeligt ved falloidinfarvning af de smalle fibercellemembraner i faste embryoner. Stærkere bred-fiber celle mærkning i linsen membran lokaliseret mApple transgene tillader levende visualisering af membran underdomæner, men mangler sutural konvergens.Posterior suturer kan visualiseres både in vitro og in vivo på tre dage efter befrugtningen. I et ækvatoriale plan, kraftigt falloidin etiketter de ydre kortikale fiberceller, afslører en flad sekskantet form. Phalloidin er udelukket fra den komprimerede linse kerne og vilde type og mutant linse ser umulig at skelne.Den stærke mærkning af brede fiberceller i linsen membran-lokaliseret mApple mosaikker transgenics afslører forstyrrelser i cellevolumen i den mutante linse. Da transgene udtryk ikke er begrænset af permeabilitet, nogle mosaikker afslører linsekerne mærkning. I vilde type dyr, begynder linsen kernen tættere på den forreste linse pol i de tidlige stadier af udviklingen, før centralisere i voksenalderen.Ekspression af grøn-mærkede proteiner i en transgen vært, hvor cellemembranerne fluorescerer rød tillader samtidig protein lokalisering samt vurdering af fibercelle morfologi in vivo. Zebrafisk er særligt velegnede til in vivo-studier. Ved hjælp af de værktøjer, der er beskrevet her, kan vi sonde linse mekanismer, stort set undersøgt in vitro, i en in vivo system.

Research

JoVE Journal

Biology

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporation af Morpholinos i den voksne zebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Localization brug af foto-aktiverede Localization mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analyse af LINE-1 retrotransposition på Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion i zebrafisk til model akut nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Linse-gratis Video mikroskopi for dynamiske og kvantitativ analyse af vedhængende cellekultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studere Ribonucleotide vedtægter: Strand-specifik påvisning af Ribonucleotides i gær genom og måling Ribonucleotide-induceret mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Dissekering af mekanoenzymatiske egenskaber af processive myosiner med ultrahurtig kraftklemmespektroskopi

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Vurdering af tarmbarriereintegritet hos mus ved hjælp af fluorescein-isothiocyanat-mærket dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Mikroinjektion af rekombinant RCAS(A)-retrovirus i embryonal kyllingelinse

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...