Name: assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

We willen graag onze financiële bron te erkennen: NIH R01 EY05661 aan J. E. H, Ines Gehring voor het assisteren bij het genereren van de aqp0a/b dubbele mutanten en zebravis veeteelt, Dr Daniel Dranow voor discussies die leiden tot generatie van de transgenes, Dr Bruce Blumberg en Dr Ken Cho Labs voor het gebruik van hun ontleden microscopen, en Dr Megan Smith voor hulp bij statistische analyse.

De dierlijke protocollen gebruikt in deze studie voldoen aan de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en visie onderzoek en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite (DEC) van de Universiteit van Californië, Irvine.

1. zebravis veeteelt en euthanasie
<ol><li>Raise en onderhoud zebravis (AB strain) onder standaard laboratorium condities12. Verhoog embryo's in embryo medium (EM)12. V...

<ol>
	<li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens.">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li><li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+Zero+Puzzle.">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li><li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0.">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion.">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li><li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49.">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration.">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li><li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes.">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li><li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish.">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lens+development+in+the+zebrafish:+A+three-dimensional+time-lapse+analysis.">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. 261, 59-94 (2002).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+&#946;B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish.">Recapitulation of human &#946;B1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li><li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye.">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye.">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell &#38; Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li><li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens.">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li><li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics.">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68 (2016).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases.">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research.">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li><li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens.">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li><li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens.">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li><li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency.">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li><li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development.">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li><li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+(NKCC1)+and+sodium+chloride+cotransporter+(NCC)+and+their+effects+on+rat+lens+transparency.">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5/fibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish.">Integrin &#945;5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li><li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish.">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li></ol>

Analyse van de zebravis lens morfologie is de eerste stap in het begrijpen van fenotypen in mutanten, of de effecten van farmacologische interventies gericht op het bestuderen van de biologie van de oculaire lens. We schetsen methoden om lens hechtingen, corticale Fiber Cell morfologie en aspecten van de lens Nucleus te analyseren. Deze benaderingen zijn een combinatie van in vitro en in vivo (vergeleken in tabel 1). De in vitro methoden zorgen voor meer detail van de buitenste...

De zebravis is een uitstekend model voor het bestuderen van lens ontwikkeling en fysiologie als gevolg van de anatomische gelijkenissen met zoogdieren lenzen, relatief gemak van genetische en farmacologische manipulatie, de snelheid van de embryonale ontwikkeling van het oog, kleine omvang en transparantie in een vroeg stadium waardoor in vivo beeldvorming. De hier beschreven methoden zijn ontwikkeld om zebravis lens morfologie te analyseren op embryonale en volwassen stadia met een focus op sutural integriteit, corticale membraan morfologie in vitro en in vivo, en locatie van de lens nucleaire positie langs de anterior-posterior as ex vivo. Deze methoden dienen als uitgangspunt voor functionele studies van de lens ontwikkeling en fysiologie, evenals omgekeerde genetische schermen voor lens fenotypes in zebravis.
Imaging zebravis lens morfologie
Aquaporine 0 (AQP0) is de meest voorkomende lens membraan eiwit en is van cruciaal belang voor beide, lens ontwikkeling en duidelijkheid, als gevolg van meerdere essentiële functies bij zoogdieren. Zebravis hebben twee Aqp0s (Aqp0a en Aqp0b) en we hebben methoden ontwikkeld om het verlies van hun functies te analyseren in zowel embryonale en volwassen lenzen. Onze studies tonen aan dataqp0a-/-mutanten voorste polaire opaciteit te ontwikkelen als gevolg van instabiliteit van de voorste hechtdraad, en aqp0a/b dubbele mutanten ontwikkelen nucleaire opaciteit1. AQP0 is aangetoond rollen te spelen in het water transport2, adhesie3,4, cytoskelet verankering5 en generatie van de brekingsindex gradiënt6, maar deze studies zijn grotendeels uitgevoerd in vitro. De zebravis biedt een unieke gelegenheid om te bestuderen hoe het verlies van functie, of verstoord functie van Aqp0a of Aqp0b zou de morfologie en de functie van invloed zijn in een levende lens. Om te beoordelen lens cel morfologie en sutural integriteit tijdens de ontwikkeling, we gewijzigd bestaande in vitro immunohistochemische methoden7 voor gebruik in embryonale en volwassen lenzen, en gegenereerde transgenen om dit proces te controleren in vivo .
Immunohistochemische analyse van de plasmamembraan structuur en sutural integriteit werd uitgevoerd in hele vaste embryo's en volwassen lenzen. Zebravis lenzen zijn extreem klein (lens diameter is ~ 100 µm in embryo's en tot 1 mm bij volwassenen) in vergelijking met hun tegenhangers van zoogdieren en hebben punt hechtingen8, die zelden worden gevangen in cryosecties. Zo, hele lenzen zijn essentieel voor het analyseren van sutural integriteit. Voor in vivo analyse van de voorste hechting vorming, en de beeldvorming van precieze lens Cell architectuur, genereerden we transgenes uiten Mapple specifiek etikettering lens membranen.
Voordelen van Live Imaging van de lens membraan transgenes zijn: 1) het vermijden van fixatie artefacten, 2) het bestuderen van dynamische morfologische veranderingen in time-lapse films, en 3) het mogelijk maken longitudinale studies waarin eerdere gebeurtenissen kunnen worden gecorreleerd met later Fenotypen. Pigmentatie van de Iris voorkomt normaalgesproken duidelijke beeldvorming van de lens periferie. Toevoeging van 1-fenyl 2-thioureum (PTE) voor de Primordia-5 (Prim-5) fase9 voorkomt melanogenesis en oog pigmentatie tot ongeveer 4 dagen postfertilization (DPF). Echter, na 4 DPF, is de lens periferie verduisterd in vivo, met name in oudere stadia. Bovendien, de dichtheid van de lens zelf verduistert beeldvorming van de achterste paal. Daarom, om de morfologie van de lens periferie te bestuderen, of de achterste hechting, na 4 DPF, lenzen moeten worden versneden en vastgesteld.
Transgene zebravis lijnen zijn gebruikt om embryonale lens membraanstructuur te analyseren in vivo10. De Q01 transgene drukt een cyaan fluorescerende eiwit gesmolten tot een membraan targeting sequentie, Gap43, gedreven door de EF1α promotor en een hexamer van de DF4 Pax6 Enhancer element ubiquitously in lens Fiber cellen11. Q01 heeft extra-lensvormige uitdrukking, met inbegrip van amacrine cellen in het netvlies, die achtergrond signaal toevoegt als de primaire rente is de lens. We ontwikkelden een nieuwe transgene lijn die een membraan-tethered mApple specifiek in de lens uitdrukt, met als doel het vermijden van een extra-lensvormig signaal.
Lens Nucleus lokalisatie
We ontdekten dat de lens Nucleus verhuist van een eerste voorste locatie in larvale zebravis naar een centrale locatie in de voorste-posterior as in volwassen lenzen. Deze verschuiving in de positie van de hoge brekingsindex lens Nucleus wordt gedacht dat een eis voor de normale ontwikkeling van zebravis lens optica1. Onze methoden laten kwantificering van de lens nucleaire centralisatie in relatie tot de lens straal. Met behulp van deze methode, toonden we aan dat Aqp0a is vereist voor de lens nucleaire centralisatie1, en deze eenvoudige methode kan worden toegepast op andere studies van de ontwikkeling en fysiologie van de lens en de optische eigenschappen in de zebravis model.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">P7629</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; very toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:310px;">4% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:118px;">RT 157-4</td>
			<td>CAUTION &#8211; health hazard, combustible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Cryostat</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:118px;">CM3050S</td>
			<td style="width:258px;">Objective and chamber temperature set to -21&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">D1306</td>
			<td>CAUTION &#8211; irritating to eyes and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">D128</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; combustible, penetrates skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable base mold</td>
			<td style="width:196px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:118px;">15154-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable Pasteur glass pipets</td>
			<td style="width:196px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td>Keep forceps sharpened</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">A5040</td>
			<td>CAUTION - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)</td>
			<td style="width:196px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:118px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Glycerol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hu&#946;B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td>
			<td style="width:196px;">Addgene</td>
			<td style="width:118px;">ID:122451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">Wayne Rasband, NIH</td>
			<td style="width:118px;">v1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Low Melt Agarose (LMA)</td>
			<td style="width:196px;">Apex</td>
			<td style="width:118px;">902-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">V 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements AR software</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus&#160; with a model 2.1.1.183 controller</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus microscope&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phalloidin-Alexa Flour 546</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:118px;">A22283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phenol Red indicator (1% w/v)</td>
			<td style="width:196px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:118px;">5725-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">BP399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Photoshop</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Apo 60x/1.2 WD objective</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Power source</td>
			<td style="width:196px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:118px;">MTr 22</td>
			<td>Or equivalent power source&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Slide warmer model No. 26020FS</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:310px;">Sodium Hydroxide beads</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">S612-3</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Superfrost/Plus microscope slide</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Sylgard 184 silicone Dow Corning</td>
			<td style="width:196px;">World Prevision Instruments</td>
			<td style="width:118px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:196px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:118px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Triton X-100 BioXtra</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">T9284</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vannas micro-dissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:118px;">1346</td>
			<td>Sharp/sharp straight tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vectashield antifade mouting medium</td>
			<td style="width:196px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:118px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">W11262</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity

De zebravis is uniek geschikt voor genetische manipulatie en in vivo beeldvorming, waardoor het een steeds populairder model voor omgekeerde genetische studies en voor de productie van transgenes voor in vivo Imaging. Deze unieke mogelijkheden maken de zebravis een ideaal platform om oculaire lens ontwikkeling en fysiologie te bestuderen. Onze recente bevindingen dat een aquaporine-0, Aqp0a, is vereist voor de stabiliteit van de voorste lens hechting, evenals voor de verschuiving van de lenskern naar de lens centrum met de leeftijd leidde ons om tools te ontwikkelen vooral geschikt voor het analyseren van de eigenschappen van zebravis lenzen. Hier schetsen we gedetailleerde methoden voor lens dissectie die kunnen worden toegepast op zowel larvale en volwassen lenzen, om hen voor te bereiden op histologische analyse, Immunohistochemistry en imaging. We richten ons op de analyse van de lens hechting integriteit en corticale cel morfologie en vergelijk de gegevens gegenereerd uit ontleed lenzen met gegevens verkregen uit in vivo beeldvorming van de lens morfologie mogelijk gemaakt door een nieuwe transgene zebravis lijn met een genetisch gecodeerde fluorescerende marker. Analyse van ontleed lenzen loodrecht op hun optische as maakt kwantificering van de relatieve positie van de lenskern langs de voorste-posterior as. Beweging van de lenskern van een eerste voorste positie naar het centrum is vereist voor de normale lensoptiek in volwassen zebravis. Aldus, correleert een kwantitatieve maatregel van lenskern positie direct met zijn optische eigenschappen.

Adult zebravis Eye anatomie lijkt sterk op die van zoogdieren (Figuur 1a). Ondanks enkele verschillen tussen zebravis en zoogdier ogen, zoals het hebben van een tril gebied in plaats van een tril lichaam17, verschillen in optische eigenschappen18, en verschillen in morfogenese tijdens de embryonale ontwikkeling19, de zebravis Eye is een uitstekend model voor het bestuderen van ontwikkelin...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Deze protocollen werden ontwikkeld om de corticale lens morfologie, structurele integriteit van de zebravis lens hechtingen in vaste en live lenzen te analyseren en om de positie van de zebravis lens Nucleus te meten langs de voorste-posterior as.

Beoordeling van zebravis lens Nucleus lokalisatie en Sutural integriteit

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Onze protocollen vormen een uitgangspunt voor functionele studies van lensontwikkeling en fysiologie en voor omgekeerde genetische screening van lensfenotypes bij zebravissen. Onze protocollen overbruggen in vitro en in vivo analyses van zebrafish lens membraan morfologie en bieden een nieuwe en eenvoudige methode voor het kwantificeren van de ontwikkeling van zebravis lens optica. Het analyseren van zebravis lens morfologie en optica leidt tot inzichten in mechanismen die de ontwikkeling van de lens, normale fysiologie en pathofysiologie.Deze inzichten kunnen op hun beurt leiden tot een vermogen om cataract te vertragen of te voorkomen. Er zijn geen meldingen geweest bij andere soorten dan zebravissen van asymmetrisch gelokaliseerde lenskernen. Het identificeren van lens hechtingen is van cruciaal belang voor het correct oriënteren van de lens om nucleus lokalisatie te meten.Na bevestiging van voldoende sedatie met Tricaine, gebruik microdissection schaar om onmiddellijk accijns beide ogen van een volwassene of een larven zebravis en plaats beide ogen in een 35-millimeter op maat gemaakte petrischaal met een siliconen dissectie mal gevuld met PBS. Om de lens te oogsten van een volwassen zebravis, plaats het oog achterste kant omhoog en steek tangen in een minder dan 45-graden hoek door de optische schijf. Gebruik dissectie schaar om twee of drie radiale incisies te maken door het netvlies en sclera van de optische schijf naar de ciliary zone in het geïmmobiliseerde oog en schil terug het netvlies en sclera zoals bloemblaadjes.Draai het oog, hoornvlies-kant omhoog, en gebruik de platte kant van de schaar om de lens indirect immobiliseren via manipulatie van de sclera en hoornvlies met behulp van tangen weg te trekken het netvlies en bijgevoegde weefsels, dan zorgvuldig trim weg overtollig weefsel van de lens. Voor larve zebravis lens oogst, plaats een larvale oog achterste kant omhoog op het vlakke deel van een siliconen schotel van PBS en gebruik een geslepen wolfraam naald om radiale bezuinigingen te maken door het netvlies en sclera terwijl immobilisatie van het oog met een andere naald of tangen, dan voorzichtig schep de lens van de gedoog met de stompe kant van een op maat gemaakte wolfraam-draad naald en zorgvuldig weg te trekken het bijgevoegde weefsel. Om de voorste aslens nucleus lokalisatie te meten, oriënteer je de vers uitgesneden lenzen axiaal in PBS in een 35-millimeter schotel met een afdekglas met de palen en hechtingen die parallel aan het vlak van focus zijn georiënteerd.Om de lenskern te identificeren, zoekt u naar een verschil in de brekingsindex, die meestal optreedt op de interface van de lensschors en de lenskern. Als lens hechtingen zijn niet duidelijk, een lichte lik met tangen aan de lens capsule onthult de hechtingen en de lens kern, helpen oriënteren van de lens voor de meting. Plaats de schotel op het podium van een dissectie microscoop uitgerust met een camera en beeld de lenzen met de lens kern in focus onder brightfield verlichting of met differentiële interferentie contrast optica.Afbeelding van een micrometer onder dezelfde vergroting voor kalibratie en klik op Live View. Klik op Momentopname om een afbeelding te verkrijgen en sla de afbeelding op als TIFF-bestand. Als u de verworven lensafbeeldingen wilt kalibreren, selecteert u in een geschikt softwareprogramma voor beeldverwerking het gereedschap rechte lijn en tekent u een lijn van bekende lengte op het beeld van de micrometer.Klik op Schaal analyseren en instellen en voer de bekende afstand en eenheden in, selecteer vervolgens Globale kalibratie en klik op OK. Als u de afstand van het midden van de lenskern tot de voorste paal wilt meten, identificeert u de locatie van de lenshechting en gebruikt u het gereedschap rechte lijn om een lijn te trekken over het afgebeelde midden van de lenskern in een axiale oriëntatie. Het centrum van deze lijn is het midden van de lenskern. Teken een andere lijn van dit punt naar de voorste paal van de lens en selecteer Meten in het menu Analyseren om de afstand te meten.Trek een andere lijn van de voorste paal naar de achterste paal en meet deze afstand als de lensdiameter, kopieer deze lengtes van het venster Resultaten naar een spreadsheet en bereken de genormaliseerde lokalisatie van de lenskern ten opzichte van de lensstraal. Door drie dagen na de bevruchting vormen zich voorste hechtingen aan de voorste pool en wordt de opvallende convergentie van cellen duidelijk gevisualiseerd door phalloïdine kleuring van de smalle vezelcelmembranen in vaste embryo's. Sterkere breedvezelcellabeling in lensmembraan gelokaliseerde mApple transgenic maakt live visualisatie van membraan subdomeinen mogelijk, maar mist de suturale convergentie.Achterste hechtingen kunnen zowel in vitro als in vivo worden gevisualiseerd na drie dagen na de bevruchting. In een equatoriaal vlak, phalloidin sterk labels de buitenste corticale vezelcellen, onthullen een afgeplatte zeshoekige vorm. Phalloidin is uitgesloten van de verdichte lenskern en wilde type en mutant lens kijken niet te onderscheiden.De sterke etikettering van brede vezelcellen in lensmembraan-gelokaliseerde mApple mozaïeken transgenics onthullen verstoringen in het celvolume in de mutant lens. Aangezien transgene expressie niet wordt beperkt door doorlaatbaarheid, sommige mozaïeken onthullen lens kern etikettering. Bij wilde dieren begint de lenskern dichter bij de voorste lenspool tijdens de vroege stadia van ontwikkeling voordat ze centraliseren tijdens de volwassenheid.Expressie van groengelabelde eiwitten in een transgene gastheer waarin de celmembranen rood fluorescerend rood mogelijk maken, evenals de beoordeling van vezelcelmorfologie in vivo. Zebravissen zijn vooral geschikt voor in vivo studies. Met behulp van de hier beschreven tools kunnen we lensmechanismen, grotendeels bestudeerd in vitro, in een in vivo systeem onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biology

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Lens transplantatie in de zebravis en de toepassing ervan in de Analyse van Eye Mutanten

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analyse van de LINE-1 retrotransposition bij de Single Nucleus niveau

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Lens-gratis videomicroscopie voor de dynamiek en de kwantitatieve analyse van aanhangend celkweek

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Beoordeling van de integriteit van de darmbarrière bij muizen met fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Micro-injectie van recombinant RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...