Name: assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00
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Nous aimerions souligner notre source de financement: NIH R01 EY05661 à J.-c., ines-c. H. pour avoir aidé à générer les mutants doubles aqp0a/b et l’élevage de zébrafish, le Dr Daniel Dranow pour les discussions menant à la génération des transgéniques, le Dr Bruce Les laboratoires de Blumberg et de Dr Ken Cho pour l’utilisation de leurs microscopes dissécants, et le Dr Megan Smith pour l’aide à l’analyse statistique.

Les protocoles animaux utilisés dans cette étude adhèrent à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie à Irvine.

1. l’élevage et l’euthanasie du zébrafish
<ol><li>Élever et maintenir le zébrafish (souche AB) dans des conditions de laboratoire normales12. ?...

<ol>
	<li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens.">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li><li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+Zero+Puzzle.">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li><li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0.">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion.">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li><li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49.">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration.">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li><li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes.">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li><li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish.">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lens+development+in+the+zebrafish:+A+three-dimensional+time-lapse+analysis.">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. 261, 59-94 (2002).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+&#946;B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish.">Recapitulation of human &#946;B1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li><li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye.">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye.">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell &#38; Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li><li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens.">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li><li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics.">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68 (2016).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases.">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research.">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li><li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens.">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li><li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens.">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li><li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency.">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li><li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development.">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li><li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+(NKCC1)+and+sodium+chloride+cotransporter+(NCC)+and+their+effects+on+rat+lens+transparency.">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5/fibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish.">Integrin &#945;5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li><li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish.">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li></ol>

L’analyse de la morphologie des lentilles poisson zèbre est la première étape dans la compréhension des phénotypes chez les mutants, ou les effets des interventions pharmacologiques visant à étudier la biologie de la lentille oculaire. Nous décrions des méthodes pour analyser les sutures de lentilles, la morphologie des cellules en fibres corticales et les aspects du noyau de l’objectif. Ces approches sont une combinaison de in vitro et in vivo (comparé dans le tableau 1)....

Le poisson zèbre est un excellent modèle pour étudier le développement de lentilles et la physiologie en raison des similitudes anatomiques aux lentilles mammaliennes, la facilité relative de manipulation génétique et pharmacologique, la vitesse du développement des yeux embryonnaires, la petite taille et la transparence à des stades précoces permettant l’imagerie in vivo . Les méthodes décrites ici ont été développées pour analyser la morphologie des lentilles de zébrafish aux stades embryonnaires et adultes, en se concentrant sur l’intégrité suturale, la morphologie membranaire corticale in vitro et in vivo, et l’emplacement de la position nucléaire de l’objectif le long de la l’axe antérieur-postérieur ex vivo. Ces méthodes servent de point de départ pour les études fonctionnelles du développement de lentilles et de la physiologie, ainsi que des écrans génétiques inverses pour les phénotypes de lentilles dans le zébrafish.
Imagerie de la morphologie des lentilles poisson zèbre
Aquaporin 0 (AQP0) est la protéine la plus abondante de membrane de lentille et est critique pour le développement de lentille et la clarté, en raison de multiples fonctions essentielles chez les mammifères. Zebrafish ont deux Aqp0s (Aqp0a et Aqp0b) et nous avons développé des méthodes pour analyser la perte de leurs fonctions dans les lentilles embryonnaires et adultes. Nos études révèlent que les mutants aqp0a-/-développent l’opacité polaire antérieure en raison de l’instabilité de la suture antérieure, et que les mutants doubles aqp0a/b développent l’opacité nucléaire1. AQP0 a été montré à jouer des rôles dans le transport de l’eau2, l’adhérence3,4, l’ancrage cytosquelettique5 et la génération du gradient de l’indice de réfraction6, mais ces études ont été largement réalisées dans et non vitro. Le zébrafish offre une occasion unique d’étudier comment la perte de fonction, ou la fonction perturbée de Aqp0a ou Aqp0b affecterait la morphologie et la fonction dans un objectif vivant. Pour évaluer la morphologie des cellules de lentilles et l’intégrité de la suturie pendant le développement, nous avons modifié les méthodes immunohistochimiques in vitro existantes7 pour les lentilles embryonnaires et adultes et avons généré des transgéniques pour surveiller ce processus in vivo .
L’analyse immunohistochimique de la structure membranaire plasmatique et l’intégrité suturale ont été effectuées dans des embryons fixes entiers et des lentilles adultes. Les lentilles zebrafish sont extrêmement petites (le diamètre de l’objectif est ~ 100 μm dans les embryons et jusqu’à 1 mm chez les adultes) par rapport à leurs homologues mammifères et ont des sutures ponctuelles8, qui sont rarement capturées dans les Cryosections. Ainsi, les lentilles entières sont essentielles pour l’analyse de l’intégrité suturale. Pour l’analyse in vivo de la formation de suture antérieure et l’imagerie de l’architecture de cellules de lentilles précises, nous avons généré des transgéniques exprimant spécifiquement des membranes d’objectif de Mapple.
Les avantages de l’imagerie en direct des transgéniques membranaires de l’objectif comprennent: 1) éviter les artefacts de fixation, 2) étudier les changements morphologiques dynamiques dans les films Time-lapse, et 3) permettre des études longitudinales dans lesquelles des événements antérieurs peuvent être corrélés avec plus tard Phénotypes. La pigmentation de l’iris empêche normalement l’imagerie claire de la périphérie de l’objectif. L’addition de 1-phényl 2-thiourea (PTU) avant l’étape9 du primordia-5 (Prim-5) prévient la mélanogenèse et la pigmentation oculaire jusqu’à environ 4 jours après la fécondation (DPF). Cependant, après 4 DPF, la périphérie de la lentille est obscurcie in vivo, enparticulier à des stades plus anciens. En outre, la densité de la lentille elle-même obscurcit l’imagerie de son pôle postérieur. Par conséquent, pour étudier la morphologie de la périphérie de la lentille, ou la suture postérieure, après 4 DPF, les lentilles doivent être excisées et fixées.
Des lignées de zébrafish transgéniques ont été utilisées pour analyser la structure membranaire des lentilles embryonnaires in vivo10. Le transgénique Q01 exprime une protéine fluorescente cyan fusionnée à une séquence de ciblage membranaire, Gap43, entraînée par le promoteur EF1α et un hexamère de l’élément Df4 Pax6 Enhancer façon ubiquitaire dans les cellules de fibre optique11. Q01 a l’expression extra-lenticulaire, y compris les cellules d’amacrines dans la rétine, qui ajoute le signal d’arrière-plan si l’intérêt principal est l’objectif. Nous avons développé une nouvelle ligne transgénique qui exprime une mApple membranaire spécifiquement dans la lentille, dans le but d’éviter tout signal extra-lenticulaire.
Localisation du noyau de l’objectif
Nous avons découvert que le noyau de l’objectif se déplace d’un emplacement antérieur initial dans le zébrafish larvaire à un emplacement central dans l’axe antérieur-postérieur dans les lentilles adultes. Ce changement dans la position du noyau de lentille de l’indice de réfraction élevé est considéré comme une exigence pour le développement normal de l’optique de lentille de zébrafish1. Nos méthodes permettent de quantifier la centralisation nucléaire de l’objectif par rapport au rayon de l’objectif. En utilisant cette méthode, nous avons montré que Aqp0a est nécessaire pour la centralisation de la lentille nucléaire1, et cette méthode simple peut être appliquée à d’autres études sur le développement et la physiologie de l’objectif et ses propriétés optiques dans le modèle de zébrafish.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">P7629</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; very toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:310px;">4% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:118px;">RT 157-4</td>
			<td>CAUTION &#8211; health hazard, combustible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Cryostat</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:118px;">CM3050S</td>
			<td style="width:258px;">Objective and chamber temperature set to -21&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">D1306</td>
			<td>CAUTION &#8211; irritating to eyes and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">D128</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; combustible, penetrates skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable base mold</td>
			<td style="width:196px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:118px;">15154-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable Pasteur glass pipets</td>
			<td style="width:196px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td>Keep forceps sharpened</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">A5040</td>
			<td>CAUTION - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)</td>
			<td style="width:196px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:118px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Glycerol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hu&#946;B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td>
			<td style="width:196px;">Addgene</td>
			<td style="width:118px;">ID:122451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">Wayne Rasband, NIH</td>
			<td style="width:118px;">v1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Low Melt Agarose (LMA)</td>
			<td style="width:196px;">Apex</td>
			<td style="width:118px;">902-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">V 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements AR software</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus&#160; with a model 2.1.1.183 controller</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus microscope&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phalloidin-Alexa Flour 546</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:118px;">A22283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phenol Red indicator (1% w/v)</td>
			<td style="width:196px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:118px;">5725-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">BP399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Photoshop</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Apo 60x/1.2 WD objective</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Power source</td>
			<td style="width:196px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:118px;">MTr 22</td>
			<td>Or equivalent power source&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Slide warmer model No. 26020FS</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:310px;">Sodium Hydroxide beads</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">S612-3</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Superfrost/Plus microscope slide</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Sylgard 184 silicone Dow Corning</td>
			<td style="width:196px;">World Prevision Instruments</td>
			<td style="width:118px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:196px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:118px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Triton X-100 BioXtra</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">T9284</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vannas micro-dissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:118px;">1346</td>
			<td>Sharp/sharp straight tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vectashield antifade mouting medium</td>
			<td style="width:196px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:118px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">W11262</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity

Le zébrafish est particulièrement adapté à la manipulation génétique et à l’imagerie in vivo , ce qui en fait un modèle de plus en plus populaire pour les études génétiques inverses et pour la production de transgénics pour l’imagerie in vivo . Ces capacités uniques font du poisson zèbre une plate-forme idéale pour étudier le développement de lentilles oculaires et la physiologie. Nos récentes découvertes qu’un aquaporin-0, Aqp0a, est nécessaire pour la stabilité de la suture de lentille antérieure, ainsi que pour le déplacement du noyau de l’objectif au centre de lentilles avec l’âge nous a conduit à développer des outils particulièrement adaptés à l’analyse des propriétés des lentilles poisson zèbre. Ici, nous décrions des méthodes détaillées pour la dissection lentille qui peut être appliquée à la fois larvaire et lentilles adultes, pour les préparer pour l’analyse histologique, immunohistochimie et l’imagerie. Nous nous concentrons sur l’analyse de l’intégrité des suture des lentilles et la morphologie des cellules corticales et comparons les données générées à partir de lentilles disséqué avec des données obtenues à partir de l’imagerie in vivo de la morphologie des lentilles rendue possible par une nouvelle lignée de zébrafish transgénique avec un génétiquement marqueur fluorescent codé. L’analyse des lentilles disséqué perpendiculaires à leur axe optique permet de quantifier la position relative du noyau de l’objectif le long de l’axe antérieur-postérieur. Le mouvement du noyau d’objectif d’une position antérieure initiale au centre est exigé pour l’optique normale de lentille dans le zebrafish adulte. Ainsi, une mesure quantitative de la position nucléaire de lentille est directement corrélée avec ses propriétés optiques.

L’anatomie des yeux de la zébrafish adulte ressemble étroitement à celle des mammifères (figure 1a). Malgré certaines différences entre les yeux de zébrafish et de mammifères, comme la présence d’une zone ciliaire au lieu d’un corps ciliaire17, les différences dans les propriétés optiques18, et les différences de morphogenèse au cours du développement embryonnaire19, ...

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Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Ces protocoles ont été élaborés pour analyser la morphologie des lentilles corticales, l’intégrité structurale des sutures de lentilles poisson zèbre dans les lentilles fixes et vivantes et pour mesurer la position du noyau de lentille de zébrafish le long de l’axe antérieur-postérieur.

Évaluation de la localisation des noyaux de lentilles zebrafish et de l’intégrité suturale

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Nos protocoles fournissent un point de départ pour les études fonctionnelles du développement et de la physiologie des lentilles et pour le dépistage génétique inverse des phénotypes des lentilles chez le poisson zèbre. Nos protocoles permettent de faire le pont entre les analyses in vitro et in vivo de la morphologie de la membrane de la lentille du poisson zèbre et fournissent une méthode nouvelle et simple pour quantifier le développement de l’optique des lentilles de poisson zèbre. L’analyse de la morphologie et de l’optique des lentilles de poisson zèbre permet de mieux comprendre les mécanismes contrôlant le développement des lentilles, la physiologie normale et la pathophysiologie.Ces idées peuvent à leur tour conduire à une capacité de retarder ou de prévenir la cataracte. Il n’y a eu aucun rapport chez d’autres espèces que le poisson zèbre de noyaux de lentilles localisés asymétriquement. L’identification des sutures de lentille est essentielle pour orienter correctement la lentille pour mesurer la localisation du noyau.Après confirmation d’une sédation suffisante avec Tricaine, utilisez des ciseaux de microdissection pour exciser immédiatement les deux yeux d’un poisson zèbre adulte ou larvaire et placez les deux yeux dans une boîte petri sur mesure de 35 millimètres avec un moule de dissection en silicone rempli de PBS. Pour récolter la lentille à partir d’un poisson zèbre adulte, placez le côté postérieur de l’œil vers le haut et insérez des forceps à un angle inférieur à 45 degrés à travers le disque optique. Utilisez des ciseaux de dissection pour faire deux ou trois incisions radiales à travers la rétine et la sclère du disque optique à la zone ciliaire dans l’œil immobilisé et peler la rétine et la sclère comme des pétales de fleurs.Inverser l’œil, côté cornée vers le haut, et utiliser le côté plat des ciseaux pour immobiliser la lentille indirectement par la manipulation de la sclère et la cornée en utilisant des forceps pour retirer la rétine et les tissus attachés, puis soigneusement couper tout excès de tissu de la lentille. Pour la récolte larvaire de lentille de poisson zèbre, placez un côté postérieur d’oeil larvaire vers le haut sur la partie plate d’un plat de silicone de PBS et emploiez une aiguille aiguisée de tungstène pour faire des coupures radiales par la rétine et la sclère tout en immobilisant l’oeil avec une autre aiguille ou forceps, puis ramassez doucement la lentille de l’oeil dissocié avec le côté émoussé d’une aiguille faite sur commande de fil de tungstène et retirez soigneusement le tissu attaché. Pour mesurer la localisation du noyau de l’axe antérieur-postérieur, orientez les lentilles fraîchement excisées axially dans PBS dans un plat de 35 millimètres avec un fond de verre de couverture avec les poteaux et les sutures orientées parallèlement au plan de mise au point.Pour identifier le noyau de la lentille, recherchez une différence dans l’indice réfractif, qui se produit habituellement à l’interface du cortex de la lentille et du noyau de la lentille. Si les sutures de lentille ne sont pas apparentes, un léger léchage avec des forceps à la capsule de la lentille révèle les sutures et le noyau de la lentille, aidant à orienter la lentille pour la mesure. Placez le plat sur la scène d’un microscope de dissection équipé d’une caméra et imagez les lentilles avec le noyau de l’objectif au point sous l’éclairage lumineux ou avec l’optique différentielle de contraste d’interférence.Imagez un micromètre sous le même grossissement pour l’étalonnage et cliquez sur Live View. Cliquez sur Instantané pour obtenir une image et enregistrer l’image en tant que fichier TIFF. Pour calibrer les images de lentilles acquises, dans un logiciel de traitement d’image approprié, sélectionnez l’outil en ligne droite et tracez une ligne de longueur connue sur l’image du micromètre.Cliquez sur Analyser et définir l’échelle et entrez la distance et les unités connues, puis sélectionnez Étalonnage global et cliquez sur OK. Pour mesurer la distance entre le centre du noyau de la lentille et le pôle antérieur, identifiez l’emplacement de la suture de la lentille et utilisez l’outil en ligne droite pour tracer une ligne à travers le centre image du noyau de la lentille dans une orientation axiale. Le centre de cette ligne est le centre du noyau de la lentille. Tracez une autre ligne à partir de ce point vers le pôle antérieur de la lentille et sélectionnez Mesurer dans le menu Analyser pour mesurer la distance.Tracez une autre ligne du pôle antérieur au pôle postérieur et mesurez cette distance comme diamètre de la lentille, puis copiez ces longueurs de la fenêtre Résultats à une feuille de calcul et calculez la localisation normalisée du noyau de la lentille par rapport au rayon de la lentille. Par trois jours après la fécondation, des sutures antérieures se forment au pôle antérieur et la convergence frappante des cellules est clairement visualisée par la coloration de phalloidin des membranes étroites de cellules de fibre dans les embryons fixes. L’étiquetage plus fort de cellules à fibres larges dans la membrane de lentille localisée mApple transgénique permet la visualisation en direct des sous-bois membranaires, mais n’a pas la convergence suturale.Les sutures postérieures peuvent être visualisées in vitro et in vivo à trois jours après la fécondation. Dans un plan équatorial, la phalloidine étiquette fortement les cellules externes de fibre corticale, révélant une forme hexagonale aplatie. Phalloidin est exclu du noyau de lentille compacté et de type sauvage et lentille mutante look indiscernable.La forte étiquetage des cellules à fibres larges dans les mosaïques mApple localisées par la membrane des lentilles transgéniques révèlent des perturbations du volume cellulaire dans la lentille mutante. Comme l’expression transgénique n’est pas limitée par la perméabilité, certaines mosaïques révèlent l’étiquetage du noyau de la lentille. Chez les animaux de type sauvage, le noyau de la lentille commence plus près du pôle de lentille antérieur au cours des premiers stades du développement avant de se centraliser à l’âge adulte.L’expression de protéines étiquetées vertes dans un hôte transgénique dans lequel les membranes cellulaires fluoresce rouge permet la localisation simultanée des protéines ainsi que l’évaluation de la morphologie des cellules fibreuses in vivo. Le poisson zèbre est particulièrement bien adapté pour les études in vivo. En utilisant les outils décrits ici, nous pouvons sonder les mécanismes de lentille, largement étudiés in vitro, dans un système in vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Objectif transplantation chez le poisson zèbre et son application dans l&#39;analyse de mutants Eye

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Recherche

Biologie

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: la localisation des protéines en utilisant la microscopie Localisation Photo-actif et microscopie électronique

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analyse de LINE-1 Rétrotransposition au Nucleus Simple Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

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Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

La microscopie vidéo sans lentille pour la dynamique et l’analyse Quantitative de la Culture de cellules adhérentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Incorporation de ribonucléotide Experimentation : Strand spécifiques détection des ribonucléotides dans le génome de la levure et mutagénèse induite par la ribonucléotide de mesure

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Dissection des propriétés mécanoenzymatiques des myosines processives avec la spectroscopie ultrarapide à pince de force

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Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Évaluation de l’intégrité de la barrière intestinale chez la souris à l’aide de dextrane marqué à la fluorescéine-isothiocyanate

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Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Micro-injection d’un rétrovirus RCAS(A) recombinant dans une lentille embryonnaire de poulet

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...