Name: assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

Wir möchten unsere Finanzierungsquelle würdigen: NIH R01 EY05661 an J.E.H, Ines Gehring für die Unterstützung bei der Generierung der aqp0a/b Doppelmutanten und Zebrafischhaltung, Dr. Daniel Dranow für Diskussionen, die zur Generierung der Transgenik führen, Dr. Bruce Die Labore von Blumberg und Dr. Ken Cho für die Verwendung ihrer sektoralen Mikroskope und Dr. Megan Smith für die Hilfe bei der statistischen Analyse.

Die in dieser Studie verwendeten Tierprotokolle halten sich an das ARVO-Statement für die Verwendung von Tieren in der Augen-und Sehforschung und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California, Irvine, genehmigt.

1. Zebrafisch Husbandry und Euthanasie
<ol><li>Zebrafische (AB-Stamm) unter normalen Laborbedingungen zu züchten und zu pflegen12. Embryonen im Embryomedium (EM) 12erhöhen. Fügen...

<ol>
	<li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens.">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li><li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+Zero+Puzzle.">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li><li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0.">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion.">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li><li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49.">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration.">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li><li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes.">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li><li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish.">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lens+development+in+the+zebrafish:+A+three-dimensional+time-lapse+analysis.">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. 261, 59-94 (2002).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+&#946;B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish.">Recapitulation of human &#946;B1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li><li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye.">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye.">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell &#38; Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li><li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens.">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li><li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics.">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68 (2016).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases.">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research.">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li><li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens.">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li><li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens.">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li><li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency.">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li><li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development.">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li><li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+(NKCC1)+and+sodium+chloride+cotransporter+(NCC)+and+their+effects+on+rat+lens+transparency.">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5/fibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish.">Integrin &#945;5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li><li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish.">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li></ol>

Die Analyse der Zebrafisch-Linsenmorphologie ist der erste Schritt, um Phenotypen bei Mutanten zu verstehen, oder die Auswirkungen pharmakologischer Eingriffe, die auf die Erforschung der Biologie der Augenlinse abzielen. Wir skizzieren Methoden zur Analyse von Linsennähten, kortikalen Faserzellmorphologie und Aspekten des Linsenkerns. Diese Ansätze sind eine Kombination von in vitro und in vivo (im Vergleich in Tabelle 1). Die In-vitro-Methoden ermöglichen eine größere De...

Der Zebrafisch ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der Linsenentwicklung und Physiologie aufgrund der anatomischen Ähnlichkeiten mit Säugetierlinsen, der relativen Leichtigkeit der genetischen und pharmakologischen Manipulation, der Geschwindigkeit der embryonalen Augenentwicklung, der geringen Größe und Transparenz. In der Anfangsphase , die es in vivo der Bildgebung erlaubt. Die hier beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um die Morphologie der Zebrafischlinse in Embryonal-und Erwachsenenstadien zu analysieren, wobei der Schwerpunkt auf der heilsamen Integrität, der kortikalen Membranmorphologie in vitro und in vivoliegt, sowie die Lage der nuklearen Position der Linse entlang der Anterior-nachträgiere Achse ex vivo. Diese Methoden dienen als Ausgangspunkt für funktionelle Studien zur Linsenentwicklung und Physiologie sowie für umgekehrte genetische Bildschirme für Linsenphänotypen in Zebrafischen.
Bildgebung Zebrafisch-Linsenmorphologie
Aquaporin 0 (AQP0) ist das am häufigsten vorkommende Linsenmembranprotein und ist sowohl für die Entwicklung der Linsen als auch für die Klarheit der Linsen von entscheidender Bedeutung, da es bei Säugetieren viele wesentliche Funktionen gibt. Zebrafische haben zwei Aqp0s (Aqp0a und Aqp0b) und wir haben Methoden entwickelt, um den Verlust ihrer Funktionen sowohl in embryonalen als auch in erwachsenen Linsen zu analysieren. Unsere Studien zeigen, dass aqp0a---Mutanten aufgrund der Instabilität der vorderen Naht eine vordere polare Deckkraft entwickeln, und aqp0a/b Doppelmutanten die nukleare Deckkraft 1 entwickeln. AQP0 hat sich als eine Rolle im Wassertransport 2,Haftung3,4, Zytoskelett-Verankerung 5 und Erzeugung des Brechungsindex Gradienten6, aber diese Studien wurden weitgehend inder vitro. Der Zebrafisch bietet eine einzigartige Gelegenheit, zu untersuchen, wie Funktionsverlust, oder gestörte Funktion von Aqp0a oder Aqp0b die Morphologie und Funktion in einer lebenden Linse beeinflussen würde. Um die Morphologie der Linsenzellen und die Integrität der Sutural während der Entwicklung zu beurteilen, haben wir die bestehenden In-vitro-immunhistochemischen Methoden 7 für den Einsatz in embryonalen und erwachsenen Linsen modifiziert und Transgenik erzeugt, um diesen Prozess in vivo zu überwachen. .
Die immunhistochemische Analyse der Plasma-Membranstruktur und der sutural integtären Struktur wurde in ganzen festen Embryonen und erwachsenen Linsen durchgeführt. Zebrafischlinsen sind extrem klein (der Linsendurchmesser beträgt ~ 100 μm bei Embryonen und bei Erwachsenen bis zu 1 mm) im Vergleich zu ihren Säugetier-Pendants und haben Punktzahl8, die in Kryoschnitten selten erfasst werden. Daher sind ganze Objektive für die Analyse der Integrität des uturalen. Denn in vivo-Analyse der vorderen Nahtbildung und Abbildung der präzisen Linsenzellen-Architektur haben wir Transgenik erzeugt, die mApple-spezifisch kennzeichnende Linsenmembranen ausdrückt.
Die Vorteile der Live-Bildgebung von Objektivmembrantransgenik sind: 1) Vermeidung von Fixierungsarten, 2) das Studium dynamischer morphologischer Veränderungen in Zeitraffer-Filmen und 3) die Möglichkeit länglicher Studien, in denen frühere Ereignisse mit späteren Phänotypen. Die Pigmentierung der Iris verhindert in der Regel eine klare Abbildung der Linsenperipherie. Die Zugabe von 1-Phenyl-2-Thiourea (PTU) vor der Primordia-5 (Prim-5) Stufe9 verhindert Melanogenese und Augenpigmentierung bis zu etwa 4 Tagen Postfertilisation (dpf). Nach 4 dpf wird die Linsenperipherie jedoch in vivoverdeckt, besonders in älteren Stadien. Darüber hinaus verdeckt die Dichte der Linse selbst die Abbildung des hinteren Pols. Um die Morphologie der Linsenperipherie oder der hinteren Naht nach 4 dpf zu studieren, müssen die Linsen daher exzessiv und fixiert werden.
Mit transgenen Zebrafischlinien wurden die embryonalen Linsenmembranstrukturen in vivo10analysiert. Das transgene Q01 drückt ein cyan fluoreszierendes Protein aus, das zu einer Membranzielsequenz, Gap43, verschmolzen ist, angetrieben vom EF1 α-Promoter und einem Hexamer des DF4 pax6-Enhancer-Elements, das in Linsenfaserzellen 11 allgegenwärtig ist. Q01 hat einen extra-Lentikelausdruck, einschließlich Amacrin-Zellen in der Netzhaut, was Hintergrundsignal hinzufügt, wenn das primäre Interesse die Linse ist. Wir haben eine neuartige transgene Linie entwickelt, die einen Membran-gebärten mApple speziell in der Linse ausdrückt, mit dem Ziel, jedes extra-linsenförmige Signal zu vermeiden.
Lens nucleus Lokalisierung
Wir entdeckten, dass sich der Linsenkern von einer anfänglichen vorderen Position in Larvenzebrafischen zu einem zentralen Ort in der anterior-nachträglichen Achse in erwachsenen Linsen bewegt. Diese Verschiebung der Position des hochbrechenden Indexlinsenkerns gilt als Voraussetzung für die normale Entwicklung der Zebrafischlinsen-Optik1. Unsere Methoden ermöglichen die Quantifizierung der nuklearen Zentralisierung der Linse in Bezug auf den Linsenradius. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass Aqp0a für die Atomzentralisierung1benötigt wird, und diese einfache Methode kann auf andere Studien zur Entwicklung und Physiologie des Objektivs und seiner optischen Eigenschaften im Zebrafischmodell angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">P7629</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; very toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:310px;">4% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:118px;">RT 157-4</td>
			<td>CAUTION &#8211; health hazard, combustible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Cryostat</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:118px;">CM3050S</td>
			<td style="width:258px;">Objective and chamber temperature set to -21&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">D1306</td>
			<td>CAUTION &#8211; irritating to eyes and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">D128</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; combustible, penetrates skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable base mold</td>
			<td style="width:196px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:118px;">15154-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable Pasteur glass pipets</td>
			<td style="width:196px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td>Keep forceps sharpened</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">A5040</td>
			<td>CAUTION - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)</td>
			<td style="width:196px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:118px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Glycerol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hu&#946;B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td>
			<td style="width:196px;">Addgene</td>
			<td style="width:118px;">ID:122451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">Wayne Rasband, NIH</td>
			<td style="width:118px;">v1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Low Melt Agarose (LMA)</td>
			<td style="width:196px;">Apex</td>
			<td style="width:118px;">902-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">V 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements AR software</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus&#160; with a model 2.1.1.183 controller</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus microscope&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phalloidin-Alexa Flour 546</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:118px;">A22283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phenol Red indicator (1% w/v)</td>
			<td style="width:196px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:118px;">5725-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">BP399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Photoshop</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Apo 60x/1.2 WD objective</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Power source</td>
			<td style="width:196px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:118px;">MTr 22</td>
			<td>Or equivalent power source&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Slide warmer model No. 26020FS</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:310px;">Sodium Hydroxide beads</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">S612-3</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Superfrost/Plus microscope slide</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Sylgard 184 silicone Dow Corning</td>
			<td style="width:196px;">World Prevision Instruments</td>
			<td style="width:118px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:196px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:118px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Triton X-100 BioXtra</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">T9284</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vannas micro-dissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:118px;">1346</td>
			<td>Sharp/sharp straight tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vectashield antifade mouting medium</td>
			<td style="width:196px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:118px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">W11262</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity

Der Zebrafisch eignet sich eindeutig für die Genmanipulation und die In-vivo-Bildgebung und ist damit ein immer beliebter werdendes Modell für umgekehrte genetische Studien und für die Generierung von Transgenik für die In-vivo-Bildgebung. Diese einzigartigen Fähigkeiten machen den Zebrafisch zu einer idealen Plattform, um die Entwicklung und Physiologie der Augenlinsen zu untersuchen. Unsere jüngsten Erkenntnisse, dass ein Aquaporin-0, Aqp0a, für die Stabilität der vorderen Linsennaht sowie für die Verschiebung des Linsenkerns in das Linsenzentrum mit zunehmendem Alter erforderlich ist, haben uns dazu gebracht, Werkzeuge zu entwickeln, die besonders geeignet sind, die Eigenschaften von Zebrafischlinsen zu analysieren. Hier skizzieren wir detaillierte Methoden für die Linsenabtration, die sowohl auf Larven-als auch auf erwachsene Linsen angewendet werden können, um sie auf histologische Analysen, Immunhistochemie und Bildgebung vorzubereiten. Wir konzentrieren uns auf die Analyse der Linsen-Naht-Integrität und der kortikalen Zellmorphologie und vergleichen Daten, die aus zerschnittenen Linsen generiert werden, mit Daten, die aus der in vivo-Bildgebung gewonnenen Bildgebung der Linsenmorphologie gewonnen werden, die durch eine neuartige transgene Zebrafischlinie mit einer genetischen Kodiert fluoreszierenden Marker. Die Analyse von zersplitterten Linsen, die senkrecht zu ihrer optischen Achse stehen, ermöglicht eine Quantifizierung der relativen Position des Linsenkerns entlang der anterior-nachträglichen Achse. Die Bewegung des Linsenkerns von einer anfänglichen vorderen Position in die Mitte ist für die normale Linsenoptik bei erwachsenen Zebrafischen erforderlich. So korreliert eine quantitative Messung der nuklearen Position der Linse direkt mit ihren optischen Eigenschaften.

Erwachsene Zebrafische Augenanatomie ähneln der von Säugetieren (Abbildung 1A). Trotz einiger Unterschiede zwischen Zebrafischen und Säugetieren Augen, wie mit einer Ziliarzone statt mit einem Ziliarkörper 17,Unterschiede in den optischen Eigenschaften18, und Unterschiede in der Morphogenese während der Embryonalentwicklung 19, die Zebrafischauge ist ein ausgezeichnetes Modell für d...

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Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Diese Protokolle wurden entwickelt, um die Morphologie der kortikalen Linsen, die strukturelle Integrität der Nähte von Zebrafischen in festen und lebenden Linsen zu analysieren und die Position des Zebrafischlinsennkerns entlang der Anterior-nachträglichen Achse zu messen.

Bewertung von Zebrafischen Lens Nukleus-Lokalisierung und Suturenintegrität

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Unsere Protokolle bieten einen Ausgangspunkt für funktionelle Studien zur Linsenentwicklung und Physiologie sowie für das umgekehrte genetische Screening von Linsenphänotypen in Zebrafischen. Unsere Protokolle überbrücken In-vitro- und In-vivo-Analysen der Morphologie der Zebrafischlinsenmembran und bieten eine neue und einfache Methode zur Quantifizierung der Entwicklung von Zebrafischlinsenoptiken. Die Analyse der Morphologie und Optik von Zebrafischlinsen führt zu Erkenntnissen über Mechanismen zur Steuerung der Linsenentwicklung, der normalen Physiologie und der Pathophysiologie.Diese Erkenntnisse können wiederum zu einer Fähigkeit führen, Katarakt zu verzögern oder zu verhindern. Es gab keine Berichte über andere Arten als Zebrafische asymmetrisch lokalisierter Linsenkerne. Das Identifizieren von Linsennähten ist entscheidend für die korrekte Ausrichtung der Linse, um die Kernlokalisierung zu messen.Nach Bestätigung einer ausreichenden Sedierung mit Tricaine verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere, um beide Augen entweder von einem Erwachsenen oder einem Larvenzebrafisch sofort zu verbrauchen und beide Augen in eine 35-Millimeter-Petrischale mit einer mit PBS gefüllten Silikon-Sektionsform zu legen. Um die Linse von einem erwachsenen Zebrafisch zu ernten, legen Sie das Auge hintere Seite nach oben und setzen Sie Zangen in einem Weniger als 45-Grad-Winkel durch die optische Scheibe ein. Verwenden Sie Eine Sezierschere, um zwei oder drei radiale Einschnitte durch die Netzhaut und Sklera von der optischen Scheibe in die Ziliarzone im immobilisierten Auge zu machen und die Netzhaut und Sklera wie Blütenblätter zu schälen.Invertieren Sie das Auge, Hornhautseite nach oben, und verwenden Sie die flache Seite der Schere, um die Linse indirekt durch Manipulation der Sklera und Hornhaut durch die Verwendung von Zangen zu immobilisieren, um die Netzhaut und das angehängte Gewebe wegzuziehen, und schneiden Sie dann sorgfältig überschüssiges Gewebe von der Linse weg. Für Larven Zebrafisch-Objektiv Ernte, legen Sie ein Larvenauge hintere Seite auf den flachen Teil einer Silikonschale von PBS und verwenden Sie eine geschärfte Wolframnadel, um radiale Schnitte durch die Netzhaut und Sklera zu machen, während das Auge mit einer anderen Nadel oder Zange immobilisieren, dann schaufeln Sie die Linse vorsichtig aus dem dissoziierten Auge mit der stumpfen Seite einer maßgeschneiderten Wolfram-Draht-Nadel und ziehen Sie vorsichtig weg. Um die vordere-posterior E-Achsen-Linsenkernlokalisierung zu messen, orientieren Sie die frisch geschnittenen Linsen axial in PBS in einer 35-Millimeter-Schale mit einem Abdeckungsglasboden mit den Parallelen und Nähten, die parallel zur Fokusebene ausgerichtet sind.Um den Linsenkern zu identifizieren, suchen Sie nach einem Unterschied im Brechungsindex, der normalerweise an der Schnittstelle des Linsenrinden und des Linsenkerns auftritt. Wenn Linsennähte nicht erkennbar sind, zeigt ein leichtes Leck enden mit Zangen zur Linsenkapsel die Nähte und den Linsenkern und hilft, die Linse für die Messung zu orientieren. Stellen Sie die Schale auf die Bühne eines mit einer Kamera ausgestatteten Seziermikroskops und fotografieren Sie die Linsen mit dem Linsenkern im Fokus unter HellerFeldbeleuchtung oder mit Differentialinterferenzkontrastoptik.Zeigen Sie ein Mikrometer unter derselben Vergrößerung für die Kalibrierung ab und klicken Sie auf Live View. Klicken Sie auf Snapshot, um ein Bild abzuspeichern und das Bild als TIFF-Datei zu speichern. Um die erfassten Objektivbilder zu kalibrieren, wählen Sie in einem geeigneten Bildverarbeitungssoftwareprogramm das gerade Linienwerkzeug aus und zeichnen Sie eine Linie bekannter Länge auf dem Mikrometerbild.Klicken Sie auf Analysieren und Skalieren festlegen, und geben Sie die bekannte Entfernung und Einheiten ein, wählen Sie dann Globale Kalibrierung und klicken Sie auf OK. Um den Abstand vom Zentrum des Linsenkerns zum vorderen Pol zu messen, identifizieren Sie die Position der Linsennaht und verwenden Sie das gerade Linienwerkzeug, um eine Linie über den abgebildeten Mittelpunkt des Linsenkerns in axialer Ausrichtung zu zeichnen. Die Mitte dieser Linie ist die Mitte des Linsenkerns. Zeichnen Sie eine weitere Linie von diesem Punkt zum vorderen Pol der Linse, und wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messen aus, um den Abstand zu messen.Zeichnen Sie eine andere Linie vom vorderen Pol zum hinteren Pol und messen Sie diesen Abstand als Linsendurchmesser, kopieren Sie diese Längen dann aus dem Ergebnisfenster in eine Tabelle und berechnen Sie die normalisierte Lokalisierung des Linsenkerns in Bezug auf den Linsenradius. Durch drei Tage nach der Befruchtung bilden sich an der vorderen Stelle vordere Nähte und die markante Konvergenz der Zellen wird durch Phalloidin-Färbung der schmalen Faserzellmembranen in festen Embryonen deutlich visualisiert. Eine stärkere Breitfaser-Zellbeschriftung in der Linsenmembran lokalisiert mApple transgenic ermöglicht eine Live-Visualisierung von Membransubdomains, aber es fehlt die suturale Konvergenz.Hintere Nähte können sowohl in vitro als auch in vivo an drei Tagen nach der Befruchtung visualisiert werden. In einer äquatorialen Ebene beschriftet Phalloidin die äußeren kortikalen Faserzellen stark und zeigt eine abgeflachte sechseckige Form. Phalloidin ist vom verdichteten Linsenkern ausgeschlossen und Wildtyp und mutierte Linse sehen nicht zu unterscheiden.Die starke Kennzeichnung von breiten Faserzellen in linsenmembranlokalisierten mApple-Mosaiken transgenen zeigen Störungen des Zellvolumens innerhalb der mutierten Linse. Da die transgene Expression nicht durch Durchlässigkeit eingeschränkt ist, offenbaren einige Mosaike die Linsenkernbeschriftung. Bei Wildtieren beginnt der Linsenkern in den frühen Entwicklungsstadien näher am vorderen Linsenpol, bevor er sich im Erwachsenenalter zentralisiert.Die Expression von grün getaggten Proteinen in einem transgenen Wirt, in dem die Zellmembranen Fluoreszenrot fluoreszierend, ermöglicht die gleichzeitige Proteinlokalisierung sowie die Beurteilung der Faserzellmorphologie in vivo. Zebrafische eignen sich besonders gut für In-vivo-Studien. Mit den hier beschriebenen Werkzeugen können wir Linsenmechanismen, die größtenteils in vitro untersucht wurden, in einem In-vivo-System untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Objektiv Transplantation in Zebrafisch und ihre Anwendung in der Analyse von Eye-Mutanten

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Forschung

Biologie

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Objektiv-kostenlose Videomikroskopie für die Dynamik und Quantitative Analyse der adhärente Zellkultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Analyse der mechanoenzymatischen Eigenschaften prozessiver Myosine mit ultraschneller Kraftklemmenspektroskopie

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Beurteilung der Integrität der Darmbarriere bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Mikroinjektion von rekombinantem RCAS(A)-Retrovirus in embryonale Hühnerlinse

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...