Name: assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00
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Vorremmo riconoscere la nostra fonte di finanziamento: NIH R01 EY05661 a J. E. H, Ines Gehring per aver assistito alla generazione del aqp0a/b doppio mutanti e allevamento di pesce zebra, Dr Daniel dranow per le discussioni che portano alla generazione dei transgenici, il dottor Bruce I laboratori di Blumberg e Dr Ken Cho per l'uso dei loro microscopi dissezione, e il dottor Megan Smith per l'aiuto con l'analisi statistica.

I protocolli animali utilizzati in questo studio aderiscono alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della California, Irvine.

1. allevamento di zebrafish e eutanasia
<ol><li>Sollevare e mantenere il pesce zebra (ceppo AB) in condizioni di laboratorio standard12. Sollevare embrioni nel mezzo embrionale (EM)<sup cl...

<ol>
	<li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens.">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li><li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+Zero+Puzzle.">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li><li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0.">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion.">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li><li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49.">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration.">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li><li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes.">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li><li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish.">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lens+development+in+the+zebrafish:+A+three-dimensional+time-lapse+analysis.">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. 261, 59-94 (2002).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+&#946;B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish.">Recapitulation of human &#946;B1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li><li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye.">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye.">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell &#38; Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li><li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens.">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li><li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics.">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68 (2016).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases.">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research.">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li><li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens.">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li><li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens.">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li><li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency.">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li><li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development.">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li><li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+(NKCC1)+and+sodium+chloride+cotransporter+(NCC)+and+their+effects+on+rat+lens+transparency.">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5/fibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish.">Integrin &#945;5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li><li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish.">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li></ol>

L'analisi della morfologia delle lenti pesce zebra è il primo passo nella comprensione dei fenotipi nei mutanti, o degli effetti degli interventi farmacologici finalizzati allo studio della biologia della lente oculare. Delineamo metodi per analizzare le suture lente, la morfologia delle cellule della fibra corticale e gli aspetti del nucleo della lente. Questi approcci sono una combinazione di in vitro e in vivo (rispetto alla tabella 1). I metodi in vitro consentono un maggi...

Il pesce zebra è un ottimo modello per studiare lo sviluppo e la fisiologia delle lenti a causa delle somiglianze anatomiche con le lenti dei mammiferi, la relativa facilità di manipolazione genetica e farmacologica, la velocità di sviluppo embrionale degli occhi, le piccole dimensioni e la trasparenza fasi iniziali che consentono l'imaging in vivo . I metodi qui descritti sono stati sviluppati per analizzare la morfologia delle lenti pesce zebra a stadi embrionali e adulti con particolare attenzione all'integrità suturale, alla morfologia della membrana corticale in vitro e in vivoe alla posizione della posizione nucleare dell'obiettivo lungo la asse anteriore-posteriore ex vivo. Questi metodi fungono da punto di partenza per gli studi funzionali sullo sviluppo e la fisiologia delle lenti, nonché sugli schermi genetici inversi per i fenotipi delle lenti nel pesce zebra.
Imaging morfologia delle lenti pesce zebra
Aquaporin 0 (AQP0) è la proteina di membrana della lente più abbondante ed è fondamentale per entrambi, lo sviluppo della lente e la chiarezza, a causa di molteplici funzioni essenziali nei mammiferi. I zebrafish hanno due Aqp0s (Aqp0a e Aqp0b) e abbiamo sviluppato metodi per analizzare la perdita delle loro funzioni sia nelle lenti embrionali che in quelle adulte. I nostri studi rivelano cheaqp0a-/-mutanti sviluppano opacità polare anteriore a causa dell'instabilità della sutura anteriore, e aqp0a/b doppi mutanti sviluppano opacità nucleare1. AQP0 ha dimostrato di svolgere ruoli nel trasporto dell'acqua2, adesione3,4, citoscheletro ancoraggio5 e generazione del gradiente indice di rifrazione6, ma questi studi sono stati in gran parte eseguiti in in vitro. Il pesce zebra fornisce un'opportunità unica per studiare come la perdita di funzione o la funzione perturbata di Aqp0a o Aqp0b influenzerebbero la morfologia e la funzione in una lente vivente. Per valutare la morfologia delle cellule lente e l'integrità suturale durante lo sviluppo, abbiamo modificato i metodi immunoistochimici esistenti in vitro 7 per l'uso in lenti embrionali e adulte, e hanno generato transgenici per monitorare questo processo in vivo .
L'analisi immunoistochimica della struttura della membrana plasmatica e dell'integrità suturale è stata eseguita in embrioni fissi interi e lenti per adulti. Le lenti zebrafish sono estremamente piccole (il diametro della lente è ~ 100 μm in embrioni e fino a 1 mm negli adulti) rispetto ai loro omologhi di mammiferi e hanno punti di sutura8, che sono raramente catturati in criosezioni. Pertanto, le lenti intere sono essenziali per l'analisi dell'integrità suturale. Per l'analisi in vivo della formazione di sutura anteriore e per l'imaging di un'architettura delle cellule lente precisa, abbiamo generato delle transgeniche che esprimono Mapple etichettando specificatamente le membrane delle lenti.
I vantaggi dell'Imaging Live della membrana transgenica delle lenti includono: 1) evitando artefatti di fissazione, 2) studiando cambiamenti morfologici dinamici nei film time-lapse e 3) consentendo studi longitudinali in cui gli eventi precedenti possono essere correlati con i successivi Fenotipi. La pigmentazione dell'iride normalmente previene la chiara Imaging della periferia dell'obiettivo. L'aggiunta di 1-phenyl 2-Thiourea (PTU) prima della Primordia-5 (prim-5) fase9 previene la melanogenesi e la pigmentazione oculare fino a circa 4 giorni dopo la fertilizzazione (DPF). Tuttavia, dopo 4 DPF, la periferia dell'obiettivo è oscurata in vivo, in particolare nelle fasi più vecchie. Inoltre, la densità della lente stessa oscura l'imaging del suo palo posteriore. Pertanto, per studiare la morfologia della periferia della lente, o la sutura posteriore, dopo 4 DPF, le lenti devono essere asportate e fissate.
Le linee pesce zebra transgeniche sono state utilizzate per analizzare la struttura della membrana embrionale della lente in vivo10. L' Q01 transgenici esprime una proteina ciano fluorescente fusa ad una sequenza di targeting per membrana, Gap43, guidata dal promotore EF1α e un ESAMER dell'elemento DF4 PAX6 Enhancer onnipresente nelle cellule della fibra ottica11. Q01 ha un'espressione extra-lenticolare, comprese le cellule amacrine nella retina, che aggiunge il segnale di fondo se l'interesse primario è l'obiettivo. Abbiamo sviluppato una nuova linea transgenica che esprime un mApple legato a membrana specificamente nella lente, con l'obiettivo di evitare qualsiasi segnale extra-lenticolare.
Localizzazione del nucleo dell'obiettivo
Abbiamo scoperto che il nucleo della lente si muove da una posizione anteriore iniziale nel pesce zebra larvale in una posizione centrale nell'asse anteriore-posteriore nelle lenti adulte. Questo cambiamento nella posizione del nucleo dell'obiettivo ad alto indice di rifrazione è pensato per essere un requisito per lo sviluppo normale dell'ottica delle lenti pesce zebra1. I nostri metodi consentono la quantificazione della centralizzazione nucleare dell'obiettivo in relazione al raggio della lente. Utilizzando questo metodo, abbiamo mostrato che Aqp0a è necessario per la centralizzazione nucleare dell'obiettivo1, e questo metodo semplice può essere applicato ad altri studi dello sviluppo e della fisiologia della lente e delle sue proprietà ottiche nel modello pesce zebra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">P7629</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; very toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:310px;">4% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:118px;">RT 157-4</td>
			<td>CAUTION &#8211; health hazard, combustible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Cryostat</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:118px;">CM3050S</td>
			<td style="width:258px;">Objective and chamber temperature set to -21&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">D1306</td>
			<td>CAUTION &#8211; irritating to eyes and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">D128</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; combustible, penetrates skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable base mold</td>
			<td style="width:196px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:118px;">15154-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable Pasteur glass pipets</td>
			<td style="width:196px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td>Keep forceps sharpened</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">A5040</td>
			<td>CAUTION - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)</td>
			<td style="width:196px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:118px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Glycerol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hu&#946;B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td>
			<td style="width:196px;">Addgene</td>
			<td style="width:118px;">ID:122451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">Wayne Rasband, NIH</td>
			<td style="width:118px;">v1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Low Melt Agarose (LMA)</td>
			<td style="width:196px;">Apex</td>
			<td style="width:118px;">902-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">V 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements AR software</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus&#160; with a model 2.1.1.183 controller</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus microscope&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phalloidin-Alexa Flour 546</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:118px;">A22283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phenol Red indicator (1% w/v)</td>
			<td style="width:196px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:118px;">5725-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">BP399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Photoshop</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Apo 60x/1.2 WD objective</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Power source</td>
			<td style="width:196px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:118px;">MTr 22</td>
			<td>Or equivalent power source&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Slide warmer model No. 26020FS</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:310px;">Sodium Hydroxide beads</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">S612-3</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Superfrost/Plus microscope slide</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Sylgard 184 silicone Dow Corning</td>
			<td style="width:196px;">World Prevision Instruments</td>
			<td style="width:118px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:196px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:118px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Triton X-100 BioXtra</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">T9284</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vannas micro-dissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:118px;">1346</td>
			<td>Sharp/sharp straight tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vectashield antifade mouting medium</td>
			<td style="width:196px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:118px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">W11262</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity

Il pesce zebra è particolarmente adatto alla manipolazione genetica e all'imaging in vivo , rendendolo un modello sempre più diffuso per gli studi genetici inversi e per la generazione di transgeniche per l'imaging in vivo . Queste capacità uniche rendono il pesce zebra una piattaforma ideale per studiare lo sviluppo e la fisiologia delle lenti oculari. I nostri recenti risultati che un aquaporin-0, Aqp0a, è necessario per la stabilità della sutura dell'obiettivo anteriore, così come per lo spostamento del nucleo della lente al centro dell'obiettivo con l'età ci ha portato a sviluppare strumenti particolarmente adatti ad analizzare le proprietà delle lenti pesce zebra. Qui delineamo metodi dettagliati per la dissezione delle lenti che possono essere applicate sia alle lenti larvale che agli adulti, per prepararle per l'analisi istologica, l'immunoistochimica e l'imaging. Ci concentriamo sull'analisi dell'integrità della sutura dell'obiettivo e della morfologia delle cellule corticali e confrontiamo i dati generati dalle lenti dissezionate con i dati ottenuti dall'imaging in vivo della morfologia delle lenti resa possibile da una nuova linea di pesce zebra transgenica con un geneticamente marcatore fluorescente codificato. L'analisi delle lenti dissezionate perpendicolari al loro asse ottico consente di quantificare la posizione relativa del nucleo dell'obiettivo lungo l'asse anteriore-posteriore. Il movimento del nucleo dell'obiettivo da una posizione anteriore iniziale al centro è necessario per le ottiche lente normali nel pesce zebra adulto. Pertanto, una misura quantitativa della posizione nucleare dell'obiettivo è direttamente correlata alle sue proprietà ottiche.

L'anatomia degli occhi di pesce zebra adulto assomiglia molto a quella dei mammiferi (Figura 1a). Nonostante alcune differenze tra gli occhi di pesce zebra e mammiferi, come avere una zona ciliare invece di un corpo ciliare17, differenze nelle proprietà ottiche18, e differenze nella morfogenesi durante lo sviluppo embrionale19, il pesce zebra Eye è un ottimo modello per studiare lo svil...

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Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Questi protocolli sono stati sviluppati per analizzare la morfologia delle lenti corticali, l'integrità strutturale delle suture delle lenti pesce zebra in lenti fisse e Live e per misurare la posizione del nucleo della lente pesce zebra lungo l'asse anteriore-posteriore.

Valutazione del nucleo di lenti zebrafish localizzazione e integrità suturale

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

I nostri protocolli forniscono un punto di partenza per studi funzionali sullo sviluppo e la fisiologia delle lenti e per lo screening genetico inverso dei fenotipi delle lenti nel pesce zebra. I nostri protocolli ponteno analisi in vitro e in vivo della morfologia della membrana delle lenti zebrafish e forniscono un metodo nuovo e diretto per quantificare lo sviluppo dell'ottica delle lenti zebrafish. L'analisi della morfologia e dell'ottica delle lenti zebrafish porta a intuizioni sui meccanismi che controllano lo sviluppo delle lenti, la fisiologia normale e la fisiopatologia.Queste intuizioni possono a loro volta portare alla capacità di ritardare o prevenire la cataratta. Non ci sono stati rapporti in specie diverse dal pesce zebra di nuclei lenti localizzati asimmetricamente. Identificare le suture delle lenti è fondamentale per orientare correttamente l'obiettivo per misurare la localizzazione del nucleo.Dopo la conferma di una sedazione sufficiente con Tricaine, utilizzare le forbici a microdisezione per asportare immediatamente entrambi gli occhi da un adulto o da un pesce zebra larvale e posizionare entrambi gli occhi in una piastra di Petri su misura da 35 millimetri con uno stampo di dissezione in silicone riempito con PBS. Per raccogliere la lente da un zebrafish adulto, posizionare il lato posteriore dell'occhio verso l'alto e inserire le forcep con un angolo inferiore a 45 gradi attraverso il disco ottico. Usa le forbici di dissezione per fare due o tre incisioni radiali attraverso la retina e lo sclera dal disco ottico alla zona ciliaria nell'occhio immobilizzato e sbucciare la retina e lo sclera come petali di fiori.Invertire l'occhio, lato cornea verso l'alto, e utilizzare il lato piatto delle forbici per immobilizzare l'obiettivo indirettamente attraverso la manipolazione della sclera e della cornea usando le forcelle per allontanare la retina e i tessuti attaccati, quindi tagliare con cura qualsiasi tessuto in eccesso dalla lente. Per la raccolta delle lenti zebrafish larvali, posizionare un lato posteriore dell'occhio larvale sulla parte piatta di un piatto di silicone di PBS e utilizzare un ago di tungsteno affilato per effettuare tagli radiali attraverso la retina e lo sclera immobilizzando l'occhio con un altro ago o pinza, quindi raccogliere delicatamente la lente dall'occhio dissociato con il lato smussato di un ago di filo di tungsteno su misura e allontanare con cura il tessuto attaccato. Per misurare la localizzazione del nucleo delle lenti dell'asse anteriore-posteriore, orientare le lenti appena asportate assialmente in PBS in un piatto da 35 millimetri con un fondo di vetro di copertura con i pali e le suture orientati parallelamente al piano di messa a fuoco.Per identificare il nucleo dell'obiettivo, cercare una differenza nell'indice di rifrazione, che di solito si verifica all'interfaccia della corteccia dell'obiettivo e del nucleo dell'obiettivo. Se le suture dell'obiettivo non sono evidenti, una leggera leccata con forcep alla capsula dell'obiettivo rivela le suture e il nucleo dell'obiettivo, aiutando ad orientare l'obiettivo per la misurazione. Posizionare il piatto sul palco di un microscopio a dissezione dotato di una fotocamera e posizionare gli obiettivi con il nucleo dell'obiettivo a fuoco sotto illuminazione a campo luminoso o con ottiche a contrasto di interferenza differenziale.Immagine di un micrometro con lo stesso ingrandimento per la calibrazione e fare clic su Visualizzazione live. Fare clic su Snapshot per ottenere un'immagine e salvare l'immagine come file TIFF. Per calibrare le immagini dell'obiettivo acquisite, in un programma software di elaborazione delle immagini appropriato, selezionare lo strumento linea retta e disegnare una linea di lunghezza nota sull'immagine del micrometro.Fare clic su Analizza e imposta scala e immettere la distanza e le unità note, quindi selezionare Calibrazione globale e fare clic su OK. Per misurare la distanza dal centro del nucleo dell'obiettivo al polo anteriore, identificare la posizione della sutura dell'obiettivo e utilizzare lo strumento linea retta per disegnare una linea attraverso il centro immaginato del nucleo dell'obiettivo in orientamento assiale. Il centro di questa linea è il centro del nucleo dell'obiettivo. Disegnate un'altra linea da questo punto al polo anteriore dell'obiettivo e selezionate Misura (Measure) nel menu Analizza (Analyze) per misurare la distanza.Disegnare un'altra linea dal polo anteriore al polo posteriore e misurare questa distanza come diametro dell'obiettivo, quindi copiare queste lunghezze dalla finestra Risultati in un foglio di calcolo e calcolare la localizzazione normalizzata del nucleo dell'obiettivo rispetto al raggio dell'obiettivo. Entro tre giorni dopo la fecondazione, le suture anteriori si formano al polo anteriore e la sorprendente convergenza delle cellule è chiaramente vista dalla colorazione della falloidina delle membrane cellulari a fibre strette in embrioni fissi. Un'etichettatura cellulare a fibra larga più forte nella membrana lente localizzata mApple transgenica consente la visualizzazione dal vivo dei sottodomini di membrana ma manca della convergenza suturale.Le suture posteriori possono essere visualizzate sia in vitro che in vivo a tre giorni dopo la fecondazione. In un piano equatoriale, la falloidina etichetta fortemente le cellule esterne della fibra corticale, rivelando una forma esagonale appiattita. La phalloidina è esclusa dal nucleo dell'obiettivo compattato e il tipo selvaggio e l'obiettivo mutante sembrano indistinguibili.La forte etichettatura di ampie cellule in fibra nei mosaici mApple localizzati nella membrana delle lenti transgenica rivela interruzioni nel volume cellulare all'interno della lente mutante. Poiché l'espressione transgena non è limitata dalla permeabilità, alcuni mosaici rivelano l'etichettatura del nucleo delle lenti. Negli animali di tipo selvatico, il nucleo della lente inizia più vicino al polo della lente anteriore durante le prime fasi di sviluppo prima di centralizzare durante l'età adulta.Espressione di proteine con tag verde in un ospite transgenico in cui le membrane cellulari fluoresce rosso consentono la localizzazione simultanea delle proteine e la valutazione della morfologia delle cellule fibre in vivo. Gli zebrafish sono particolarmente adatti per studi in vivo. Utilizzando gli strumenti qui descritti, possiamo sondare i meccanismi delle lenti, in gran parte studiati in vitro, in un sistema in vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Lens trapianto in Zebrafish e la sua applicazione nell&#39;analisi dei Mutanti Eye

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Ricerca

Biologia

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

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Nano-Fem: la localizzazione delle proteine ​​Usando Photo-attivato Microscopia Localizzazione e microscopia elettronica

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Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analisi di LINE-1 retrotrasposizione al Nucleo livello singolo

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Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

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Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Microiniezione di retrovirus RCAS(A) ricombinante nel cristallino embrionale di pollo

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