Name: assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00
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우리는 우리의 자금 출처를 인정 하 고 싶습니다: NIH R01 EY05661에 게 J. H, 네 스 Gehring aqp0a/b 이중 돌연변이와 zebrafish를 생성 하는 것을 돕기 위한, 박사 다니엘 Dranow transgenics의 세대에 이르는 논의를 위해, 브루스 박사 블 룸 베르크와 박사는 하 부 현미경 사용을 위한 연구소와 미 건 스미스 박사는 통계 분석에 도움을 주었습니다.

이 연구에서 사용 되는 동물 프로토콜은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대 한 ARVO 문을 준수 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 캘리포니아 대학의 어바인.

1. 제 브라 생선 축산 및 안락사
<ol><li>표준 실험실 조건에서 제 브라 피시 (AB 스트레인)를 올리고 유지 합니다12. 배아 배지 (EM)12에서 배아를 올립...

<ol>
	<li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens.">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li><li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+Zero+Puzzle.">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li><li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0.">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion.">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li><li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49.">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration.">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li><li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes.">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li><li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish.">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lens+development+in+the+zebrafish:+A+three-dimensional+time-lapse+analysis.">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. 261, 59-94 (2002).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+&#946;B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish.">Recapitulation of human &#946;B1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li><li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye.">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye.">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell &#38; Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li><li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens.">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li><li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics.">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68 (2016).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases.">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research.">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li><li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens.">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li><li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens.">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li><li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency.">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li><li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development.">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li><li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+(NKCC1)+and+sodium+chloride+cotransporter+(NCC)+and+their+effects+on+rat+lens+transparency.">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5/fibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish.">Integrin &#945;5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li><li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish.">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li></ol>

제 브라 피시 렌즈 형태학의 분석은 돌연변이 체의 표현 형을 이해 하는 초기 단계, 또는 안구 렌즈의 생물학을 연구 하기 위한 약리학 적 개입의 효과입니다. 렌즈 봉합, 대뇌 피 질 섬유 세포 형태학 및 렌즈 핵의 측면을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 접근법은 시험관 내 및 생체 내에서의 조합 ( 표 1과 비교 하 여) 이다. 시험관 내 방법은 외부 피 질 세포...

제 브라 피쉬는 포유류 렌즈에 대 한 해부학 적 유사성, 유전 및 약리 조작의 상대적인 용이성, 배아 눈 발달 속도, 작은 크기 및 투명성으로 인해 렌즈 개발과 생리학을 연구 하는 훌륭한 모델입니다 초기 단계에서 생체 내 이미징에 대 한 허용. 여기에 설명 된 방법은 조직 무결성에 초점을 맞춘 배아 및 성인 단계에서 zebrafish 렌즈 형태학을 분석 하기 위해 개발 되었으며, 체 외 및 생체내에서의 대뇌 피 질 막 형태학 및 렌즈 핵 위치의 위치 전방-후부 축 ex 생체 내. 이러한 방법은 렌즈 개발 및 생리학의 기능적 연구를 위한 출발점으로 서, zebrafish의 렌즈 표현 형에 대 한 역 유전 화면 역할을 합니다.
이미징 제 브라 피시 렌즈 형태학
아쿠아 포린 0(AQP0)은 가장 풍부한 렌즈 멤브레인 단백질 이며 포유류의 여러 필수 기능으로 인해 렌즈 개발과 선명도 모두에 중요 합니다. 제 브라 피쉬는 두 개의 Aqp0s (Aqp0a 및 Aqp0b)를가지고 있으며 배아 및 성인 렌즈 모두에서 기능 상실을 분석 하는 방법을 개발 했습니다. 우리의 연구 결과에 따르면aqp0a-/-돌연변이 체는 전방 봉합 사의 불안정성으로 인해 전방 극성 불투명도를 개발 하 고 aqp0a/b 이중 돌연변이는 핵 불투명도1을 개발 합니다. AQP0는 물 수송2, 접착 력3,4, 세포 골격 고정5 및 굴절률 구배6의 생성에서 역할을 하는 것으로 알려져 있으 나 이러한 연구는 크게 시험관. 제 브라 피쉬는 살아있는 렌즈의 형태와 기능에 영향을 미치는 기능 상실 또는 Aqp0a 또는 Aqp0b의 교란 기능에 대해 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공 합니다. 개발 중에 렌즈 셀 형태학 및 조직 무결성을 평가 하기 위해, 우리는 배아 및 성인 렌즈에 사용 하기 위한 시험관 내 면역 세포 화학적 방법7 을 수정 하 고, 생체 내에서이 과정을 모니터링 하기 위해 트랜스 젠 시를 생성 .
면역 조직 화학적 분석은 혈장 막의 구조 및 수 중 무결성을 전체 고정 배아 및 성인 렌즈에서 수행 하였다. 제 브라 피시 렌즈는 매우 작은 (렌즈 직경은 태아에서 ~ 100 µm 및 성인에서 1 mm까지) 그들의 포유류 대조 군과 비교 하 여 점 봉합 사 (8)가 자주 저온 단면에서 포착 됩니다. 따라서 전체 렌즈는 조직 무결성을 분석 하는 데 필수적입니다. 전방 봉합 사 형성 및 정밀한 렌즈 셀 구조의 이미징에 대 한 생체 내 분석을 위해, 우리는 특히 렌즈 멤브레인을 라벨링 mapple을 표현 transgenics를 생성 했습니다.
렌즈 멤브레인 트랜스 젠 시의 라이브 이미징의 장점: 1) 고정 아티팩트를 피하고, 2) 타임 랩 스 영화의 동적 형태학 적 변화를 연구 하 고, 3) 이전 이벤트를 나중에 상호 연관 시킬 수 있는 종단 연구 활성화 고기. 홍 채의 색소 침착은 일반적으로 렌즈 주변부의 선명한 이미징을 방지 합니다. 1-페 닐 2 티 오 요소 (PTU)의 첨가 전에 프리모 르 디 아-5(프림) 단계9 는 멜 라 닌 생성 및 눈 색소 침착을 약 4 일 후에 (dpf)까지 방지 한다. 그러나 4 dpf 이후, 렌즈 주변부는 생체 내, 특히 구형 단계에서 가려집니다. 또한 렌즈 자체의 밀도는 후방 극의 이미징을 모호 하 게 합니다. 따라서 렌즈 주변부의 형태학을 연구 하거나 후부 봉합을 하 여 4 dpf 후에 렌즈를 절제 하 고 고정 시켜야 합니다.
제 브라이 선 형질 전환 체는 생체 내10 의배아 렌즈 막 구조를 분석 하는데 사용 되어 왔다. 상기 Q01 형질 전환 체는 렌즈 섬유 세포 (11)에서 DF4 pax6 증강 요소 ubiquitously의 EF1α 프로모터 및 hexamer에 의해 구동 되는 , Gap43의 멤브레인 표적화 서 열에 융합 된 시안 형광 단백질을 표현 한다. Q01 에는 망막의 무 축 삭 세포를 포함 한 추가적인 렌즈 표현이 있어 주요 관심사 인 경우 배경 신호를 추가 합니다. 우리는 여분의 렌즈 모양 신호를 피하는 것을 목표로 하 여 렌즈에 특별히 멤브레인 테더를 표현 하는 새로운 트랜스 제 닉 라인을 개발 했습니다.
렌즈 핵 현지화
우리는 렌즈 핵이 애벌레 zebrafish의 초기 전방 위치에서 성인 렌즈의 전방 후부 축의 중앙 위치로 이동 한다는 것을 발견 했습니다. 이러한 고 굴절 렌즈 핵의 위치 변화는 제 브라 피시 렌즈 광학1의 정상적인 발달에 요구 되는 것으로 생각 된다. 우리의 방법은 렌즈 반경과 관련 하 여 렌즈 핵 중앙 집중화를 정량화 할 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 Aqp0a가 렌즈 핵 중앙 집중화1에 필요 하다는 것을 보여 주었고,이 간단한 방법은 제 브라 피쉬 모델에서의 렌즈 및이의 광학 특성의 발달 및 생리학에 대 한 다른 연구에도 적용 될 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">P7629</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; very toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:310px;">4% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:118px;">RT 157-4</td>
			<td>CAUTION &#8211; health hazard, combustible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Cryostat</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:118px;">CM3050S</td>
			<td style="width:258px;">Objective and chamber temperature set to -21&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">D1306</td>
			<td>CAUTION &#8211; irritating to eyes and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">D128</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; combustible, penetrates skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable base mold</td>
			<td style="width:196px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:118px;">15154-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable Pasteur glass pipets</td>
			<td style="width:196px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td>Keep forceps sharpened</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">A5040</td>
			<td>CAUTION - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)</td>
			<td style="width:196px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:118px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Glycerol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hu&#946;B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td>
			<td style="width:196px;">Addgene</td>
			<td style="width:118px;">ID:122451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">Wayne Rasband, NIH</td>
			<td style="width:118px;">v1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Low Melt Agarose (LMA)</td>
			<td style="width:196px;">Apex</td>
			<td style="width:118px;">902-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">V 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements AR software</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus&#160; with a model 2.1.1.183 controller</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus microscope&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phalloidin-Alexa Flour 546</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:118px;">A22283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phenol Red indicator (1% w/v)</td>
			<td style="width:196px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:118px;">5725-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">BP399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Photoshop</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Apo 60x/1.2 WD objective</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Power source</td>
			<td style="width:196px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:118px;">MTr 22</td>
			<td>Or equivalent power source&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Slide warmer model No. 26020FS</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:310px;">Sodium Hydroxide beads</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">S612-3</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Superfrost/Plus microscope slide</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Sylgard 184 silicone Dow Corning</td>
			<td style="width:196px;">World Prevision Instruments</td>
			<td style="width:118px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:196px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:118px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Triton X-100 BioXtra</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">T9284</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vannas micro-dissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:118px;">1346</td>
			<td>Sharp/sharp straight tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vectashield antifade mouting medium</td>
			<td style="width:196px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:118px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">W11262</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity

Zebrafish는 유전 조작 및 생체 내 이미징에 유일 하 게 적합 하며 역 유전 연구와 생체 내 이미징에 대 한 transgenics 생성을 위한 점점 더 인기 있는 모델입니다. 이러한 독특한 기능은 제 브라 피시 안구 렌즈 개발과 생리학을 연구 하는 이상적인 플랫폼을 만든다. 우리의 최근 발견 된 아쿠아 포린-0, Aqp0a, 전방 렌즈의 안정성을 위해 요구 되는 봉합 사, 뿐만 아니라 렌즈 핵의 시프트에 대 한 렌즈 중심을 나이에 우리는 zebrafish 렌즈의 특성을 분석 하는 데 특히 적합 한 도구를 개발 하기 위해 우리를 이끌었다. 여기에서 우리는 조직 학적 분석, 면역 조직 화학 및 이미징을 위해 준비 하기 위해 애벌레 및 성인용 렌즈 모두에 적용 할 수 있는 렌즈 해 부에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. 우리는 렌즈 봉합 사 무결성 및 대뇌 피 질의 세포 형태학의 분석에 집중 하 고 유전적으로 새로운 형질 전환 zebrafish 라인에 의해 가능 하 게 만든 렌즈 형태학의 생체 내 이미징에서 얻은 데이터로 해 부 렌즈에서 생성 된 데이터를 비교 인코딩된 형광 표식입니다. 광 축에 수직인 해 부 렌즈의 분석을 통해 전방 후부 축을 따라 렌즈 핵의 상대적인 위치를 정량화 할 수 있습니다. 렌즈 핵을 초기 전방 위치에서 중심으로 이동 하는 것은 성인 제 브라 피시의 일반 렌즈 광학에 필요 합니다. 따라서, 렌즈 핵 위치를 정량적으로 측정 하는 것은 광학적 특성과 직접적으로 관련이 있습니다.

성인 제 브라 피쉬 아이 해부학은 포유류와 밀접 하 게 유사 합니다 (그림 1a). 제 브라 피쉬와 포유동물 눈의 차이에도 불구 하 고, 모양 체 체 (17) 대신에 모양 체 지 대를 갖는 것은 광학적 성질 (18)의 차이, 배아 발달 동안 형태 형성에 있어서의 차이 (19), 제 브라 피시 아이는 눈 발달 및 이해 안?...

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Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

이러한 프로토콜은 피 질 렌즈 형태학을 분석 하기 위해 개발 되었으며, 고정 및 라이브 렌즈에서 제 브라 피시 렌즈 봉합 사의 구조적 완전성을 측정 하 고, 전방 후부 축을 따라 제 브라 피시 렌즈 핵의 위치를 측정할 수 있다.

제 브라 피쉬 렌즈의 평가 핵 현지화 및 조직 무결성

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

우리의 프로토콜은 렌즈 발달과 생리학의 기능적 연구와 제브라피시의 렌즈 표현형의 역유전 적 스크리닝을 위한 출발점을 제공합니다. 당사의 프로토콜은 체외 및 제브라피시 렌즈 막 형태에 대한 생체 내 분석을 교개하고 제브라피시 렌즈 광학의 개발을 정량화하는 새롭고 간단한 방법을 제공합니다. Zebrafish 렌즈 형태와 광학을 분석하면 렌즈 개발, 정상적인 생리학 및 병리학을 제어하는 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.이러한 통찰력은 백내장을 지연하거나 방지하는 기능으로 이어질 수 있습니다. 비대칭 국소화 된 렌즈 핵의 제브라피 이외의 종에 있는 보고가 없었습니다. 렌즈 봉합사를 식별하는 것은 렌즈를 올바르게 방향을 지정하여 핵 국소화를 측정하는 데 중요합니다.트리카인으로 충분한 식기 처리가 확인된 후, 미세 절부 가위를 사용하여 성인 또는 유충 얼룩말에서 두 눈을 즉시 소비하고 PBS로 채워진 실리콘 해부 몰드가있는 35 mm 의 맞춤형 페트리 접시에 두 눈을 배치하십시오. 성인 얼룩말물고기에서 렌즈를 수확하려면 눈 뒤쪽 면을 위로 올려 놓고 광학 디스크를 통해 45도 미만의 각도로 집게를 삽입합니다. 해부 가위를 사용하여 망막과 클클레라를 통해 망막과 경각증을 통해 정광된 눈의 섬모 영역까지 두 개 또는 세 개의 방사형 절개를 하고 꽃잎처럼 망막과 경감을 벗깁니다.눈을 반전시키고 각막면을 위로 하고 가위의 평평한 면을 사용하여 포셉을 사용하여 렌즈를 밀착한 후 렌즈에서 여분의 조직을 조심스럽게 다듬어 서 스클레라와 각막의 조작을 통해 렌즈를 간접적으로 고정시합니다. 애벌레 얼룩말 렌즈 수확을 위해, PBS의 실리콘 접시의 평평한 부분에 애벌레 눈 후방 측면을 배치하고 다른 바늘이나 집게로 눈을 고정하는 동안 망막과 sclera를 통해 방사형 컷을 만들기 위해 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여, 부드럽게 다른 바늘이나 집게로 눈을 고정한 다음 부드럽게 분리 된 눈의 무딘 측면과 함께 분리 된 눈의 렌즈를 스쿱합니다. 전방 후방 축 렌즈 핵 국소화를 측정하기 위해 PBS에서 갓 익힌 렌즈를 35mm 접시에 넣고 표지 유리 바닥과 초점 평면과 평행하게 향합니다.렌즈 핵을 식별하려면 일반적으로 렌즈 피질 및 렌즈 핵의 인터페이스에서 발생하는 굴절률의 차이를 찾습니다. 렌즈 봉합사가 명백하지 않은 경우 렌즈 캡슐에 집게로 약간 핥으면 봉합사와 렌즈 핵이 드러나므로 측정을 위해 렌즈를 방향을 지정하는 데 도움이됩니다. 카메라를 장착한 해부 현미경의 무대에 접시를 놓고 렌즈 핵을 밝은 시야 조명 아래 또는 차동 간섭 대비 광학으로 이미지화합니다.교정을 위해 동일한 배율 아래 마이크로미터를 이미지화하고 Live View를 클릭합니다. 스냅샷을 클릭하여 이미지를 가져오고 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 획득한 렌즈 이미지를 적절한 이미지 처리 소프트웨어 프로그램에서 보정하려면 직선 도구를 선택하고 마이크로미터 이미지에 알려진 길이의 선을 그립니다.스케일 분석 및 설정을 클릭하고 알려진 거리와 단위를 입력한 다음 전역 보정을 선택하고 확인을 클릭합니다. 렌즈 핵의 중심에서 전방 극까지의 거리를 측정하려면 렌즈 봉합사의 위치를 식별하고 직선 도구를 사용하여 축 방향으로 렌즈 핵의 이미지 중앙을 가로 질러 선을 그립니다. 이 선의 중심은 렌즈 핵의 중심입니다. 이 점에서 렌즈의 전방 기둥에 다른 선을 그리고 분석 메뉴에서 측정값을 선택하여 거리를 측정합니다.전방 기둥에서 후방 극에 다른 선을 그리고 렌즈 직경으로 이 거리를 측정한 다음 결과 창에서 스프레드시트에 이러한 길이를 복사하고 렌즈 반경과 관련하여 렌즈 핵의 정규화된 현지화를 계산합니다. 3일 후 수정함으로써 전방 봉합사는 전방 기둥에서 형성되며 세포의 눈에 띄는 수렴은 고정 배아에서 좁은 섬유 세포막의 파종염 염색에 의해 명확하게 시각화된다. 렌즈 막국화 mApple 형질화에서 강력한 광섬유 세포 라벨은 멤브레인 하위 도메인의 라이브 시각화를 허용하지만 봉제 수렴이 부족합니다.후방 봉합사는 3일 후에 시험관내와 생체내에서 모두 시각화할 수 있다. 적도 평면에서, phalloidin 강하게 외부 피질 섬유 세포를 레이블, 평평한 육각형을 공개. Phalloidin은 압축 렌즈 핵과 야생 유형 및 돌연변이 렌즈 구별 할 수없는 모양에서 제외됩니다.렌즈 멤브레인 국소화 된 mApple 모자이크 트랜스제닉에서 광범위한 섬유 세포의 강력한 라벨은 돌연변이 렌즈 내의 세포 부피의 혼란을 보여줍니다. 트랜스진 발현은 투과성에 의해 제한되지 않기 때문에 일부 모자이크는 렌즈 핵 라벨링을 드러냅니다. 야생 형 동물에서, 렌즈 핵은 성인기 도중 중앙 집중화하기 전에 발달의 초기 단계 도중 전방 렌즈 극에 더 가깝게 시작합니다.세포막이 적색형광을 하는 형질전환 숙주에서 녹색 태그가 달린 단백질의 발현은 생체 내 섬유 세포 형태에 대한 평가뿐만 아니라 동시 단백질 국소화를 허용한다. Zebrafish는 특히 생체 내 연구에 적합합니다. 여기에 설명된 도구를 사용하여, 우리는 생체 내 시스템에서 주로 시험관 내에서 연구된 렌즈 메커니즘을 프로브할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

연구

생물학

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

초고속 포스 클램프 분광법을 사용한 공정 미오신의 기계적 효소 특성 해부

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Fluorescein-Isothiocyanate-labeled dextran을 사용한 생쥐의 장 장벽 무결성 평가

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

재조합 RCAS(A) 레트로바이러스를 배아 닭 수정체에 미세주입

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...