Name: assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

Vi ønsker å erkjenne vår finansieringskilde: NIH R01 EY05661, Ines Gehring for å bistå med å generere aqp0a/b Double mutanter og sebrafisk husdyrhold, Dr Daniel Dranow for diskusjoner som fører til generering av Transgenics, Dr. Bruce Blumberg og Dr Ken Cho ' s Labs for bruk av deres dissekere mikroskop, og Dr. Megan Smith for hjelp med statistisk analyse.

Dyret protokollene som brukes i denne studien holder seg til ARVO statement for bruk av dyr i øye og Vision forskning og har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av University of California, Irvine.

1. sebrafisk og døds-
<ol><li>Heve og vedlikeholde sebrafisk (AB-belastning) under standard laboratorieforhold12. Raise embryo i embryo medium (EM)12. Legg 0,003% PTU til EM fra 20-24 h postfertilization (...

<ol>
	<li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens.">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li><li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+Zero+Puzzle.">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li><li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0.">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion.">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li><li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49.">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration.">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li><li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes.">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li><li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish.">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lens+development+in+the+zebrafish:+A+three-dimensional+time-lapse+analysis.">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. 261, 59-94 (2002).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+&#946;B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish.">Recapitulation of human &#946;B1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li><li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye.">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye.">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell &#38; Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li><li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens.">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li><li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics.">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68 (2016).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases.">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research.">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li><li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens.">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li><li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens.">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li><li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency.">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li><li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development.">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li><li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+(NKCC1)+and+sodium+chloride+cotransporter+(NCC)+and+their+effects+on+rat+lens+transparency.">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5/fibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish.">Integrin &#945;5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li><li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish.">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li></ol>

Analyse av sebrafisk linse morfologi er det første skrittet for å forstå fenotyper i mutanter, eller virkningene av farmakologiske intervensjoner som tar sikte på å studere biologi av øyelinsen. Vi skisserer metoder for å analysere linse sting, kortikale fiber celle morfologi og aspekter av linsen kjernen. Disse tilnærmingene er en kombinasjon av in vitro og in vivo (sammenlignet i tabell 1). In vitro metoder gir større detalj av den ytre kortikale celle morfologi, sam...

Den sebrafisk er en utmerket modell for å studere linsen utvikling og fysiologi på grunn av anatomiske likheter til pattedyr linser, relativ enkel genetisk og farmakologisk manipulasjon, hastighet av embryonale øyet utvikling, liten størrelse og åpenhet på tidlige stadier, noe som åpner for in vivo Imaging. Metodene som er beskrevet her ble utviklet for å analysere sebrafisk linse morfologi på embryonale og voksne stadier med fokus på sutural integritet, kortikale membran morfologi in vitro og in vivo, og plassering av linsen kjernefysiske posisjon langs fremre-bakre akse ex vivo. Disse metodene fungerer som et utgangspunkt for funksjonelle studier av linse utvikling og fysiologi, samt omvendt genetiske skjermer for objektiv fenotyper i sebrafisk.
Imaging sebrafisk linse morfologi
Aquaporin 0 (AQP0) er den mest tallrike linse membran protein og er avgjørende for både objektiv utvikling og klarhet, på grunn av flere viktige funksjoner i pattedyr. Sebrafisk har to Aqp0s (Aqp0a og Aqp0b) og vi har utviklet metoder for å analysere tap av sine funksjoner i både embryonale og voksne linser. Våre studier viser at aqp0a-/-mutanter utvikler fremre Polar dekkevne på grunn av ustabilitet i fremre Sutur, og aqp0a/b dobbel mutanter utvikle kjernefysisk gjennomsiktighet1. AQP0 har vist å spille roller i vann transport2, vedheft3,4, cytoskjelettkomponenter forankring5 og generering av brytningsindeksen gradient6, men disse studiene har i stor grad blitt utført i for å Sebrafisk gir en unik mulighet til å studere hvordan tap av funksjon, eller perturbed funksjon av Aqp0a eller Aqp0b vil påvirke morfologi og funksjon i en levende linse. For å vurdere objektiv celle morfologi og sutural integritet under utvikling, endret vi eksisterende in vitro immunhistokjemiske metoder7 for bruk i embryonale og voksne linser, og genererte transgenics for å overvåke denne prosessen in vivo .
Immunhistokjemiske analyse av plasma membran struktur og sutural integritet ble utført i hele faste embryo og voksen linser. Sebrafisk linser er svært små (linse diameter er ~ 100 μm i embryo og opp til 1 mm i voksne) sammenlignet med sine pattedyr kolleger og har punkt sting8, som sjelden fanges i cryosections. Dermed hele linser er avgjørende for å analysere sutural integritet. For in vivo analyse av fremre Sutur formasjon, og bilde av presis linse celle arkitektur, genererte vi Transgenics uttrykke mApple spesielt merking linse membraner.
Fordeler med live Imaging av linse membran transgenics inkluderer: 1) unngå fiksering gjenstander, 2) studere dynamiske morfologiske endringer i time-lapse filmer, og 3) muliggjør langsgående studier der tidligere hendelser kan være korrelert med senere fenotyper. Pigmentering av Iris hindrer normalt klar bilde av linsen periferi. Tillegg av 1-fenyl 2-thiourea (PTU) før Primordia-5 (prim-5) trinn9 forhindrer melanogenese og øye pigmentering opptil rundt 4 dager postfertilization (DPF). Men etter 4 DPF, linsen periferien er skjult i vivo, spesielt på eldre stadier. Videre tettheten av linsen selv tilslører bilde av sin bakre pol. Derfor, for å studere morfologi av linsen periferi, eller bakre Sutur, etter 4 DPF, linser må excised og fast.
Transgene sebrafisk-linjer har blitt brukt til å analysere embryonale linse membran strukturen i vivo10. Q01 transgene uttrykker en cyan fluorescerende protein smeltet til en membran rettet sekvens, Gap43, drevet av EF1α promoter og en heksamer av DF4 pax6 Enhancer element overalt i linse fiber celler11. Q01 har ekstra linse uttrykk, inkludert amacrine celler i Retina, som legger til bakgrunns signal hvis den primære interessen er objektivet. Vi utviklet en roman transgene line som uttrykker en membran-bundet mApple spesielt i objektivet, med sikte på å unngå eventuelle ekstra linse signal.
Lokalisering av linse kjerne
Vi oppdaget at linsen kjernen beveger seg fra en første fremre plassering i larvestadiet sebrafisk til et sentralt sted i fremre-bakre aksen i voksen linser. Dette skiftet i plasseringen av høy brytningsindeks linsen kjernen antas å være et krav for normal utvikling av sebrafisk linseoptikk1. Våre metoder tillater kvantifisering av objektiv kjernefysisk sentralisering i forhold til linsen radius. Ved hjelp av denne metoden, viste vi at Aqp0a er nødvendig for objektiv kjernefysisk sentralisering1, og denne enkle metoden kan brukes til andre studier av utvikling og fysiologi av linsen og dens optiske egenskaper i sebrafisk modellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">P7629</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; very toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:310px;">4% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:118px;">RT 157-4</td>
			<td>CAUTION &#8211; health hazard, combustible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Cryostat</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:118px;">CM3050S</td>
			<td style="width:258px;">Objective and chamber temperature set to -21&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">D1306</td>
			<td>CAUTION &#8211; irritating to eyes and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">D128</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; combustible, penetrates skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable base mold</td>
			<td style="width:196px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:118px;">15154-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable Pasteur glass pipets</td>
			<td style="width:196px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td>Keep forceps sharpened</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">A5040</td>
			<td>CAUTION - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)</td>
			<td style="width:196px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:118px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Glycerol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hu&#946;B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td>
			<td style="width:196px;">Addgene</td>
			<td style="width:118px;">ID:122451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">Wayne Rasband, NIH</td>
			<td style="width:118px;">v1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Low Melt Agarose (LMA)</td>
			<td style="width:196px;">Apex</td>
			<td style="width:118px;">902-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">V 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements AR software</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus&#160; with a model 2.1.1.183 controller</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus microscope&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phalloidin-Alexa Flour 546</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:118px;">A22283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phenol Red indicator (1% w/v)</td>
			<td style="width:196px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:118px;">5725-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">BP399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Photoshop</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Apo 60x/1.2 WD objective</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Power source</td>
			<td style="width:196px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:118px;">MTr 22</td>
			<td>Or equivalent power source&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Slide warmer model No. 26020FS</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:310px;">Sodium Hydroxide beads</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">S612-3</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Superfrost/Plus microscope slide</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Sylgard 184 silicone Dow Corning</td>
			<td style="width:196px;">World Prevision Instruments</td>
			<td style="width:118px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:196px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:118px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Triton X-100 BioXtra</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">T9284</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vannas micro-dissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:118px;">1346</td>
			<td>Sharp/sharp straight tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vectashield antifade mouting medium</td>
			<td style="width:196px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:118px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">W11262</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity

Sebrafisk er unikt egnet for genetisk manipulering og in vivo Imaging, noe som gjør den til en stadig mer populær modell for omvendte genetiske studier og for generering av transgenics for in vivo Imaging. Disse unike evnene gjør sebrafisk til en ideell plattform for utvikling og fysiologi av øyelinsen. Våre nylige funn at en Aquaporin-0, Aqp0a, er nødvendig for stabilitet av fremre linse Sutur, samt for forskyvning av linsen kjernen til linsen sentrum med alderen førte oss til å utvikle verktøy spesielt egnet til å analysere egenskapene til sebrafisk linser. Her har vi skissere detaljerte metoder for linse disseksjon som kan brukes til både larvestadiet og voksen linser, for å forberede dem for histologiske analyse, immunhistokjemi og Imaging. Vi fokuserer på analyse av objektiv Sutur integritet og kortikale celle morfologi og sammenligner data generert fra dissekert linser med data innhentet fra in vivo Imaging av linse morfologi gjort mulig av en roman transgene sebrafisk linje med en genetisk kodet fluorescerende markør. Analyse av dissekert linser vinkelrett på deres optiske aksen tillater kvantifisering av den relative plasseringen av linsen kjernen langs fremre-bakre akse. Bevegelse av linsen kjernen fra en første fremre posisjon til sentrum er nødvendig for normal linseoptikk i voksen sebrafisk. Således, en kvantitativ mål av linsen atomer holdning direkte samsvarer med dens optisk eiendom.

Voksen sebrafisk øye anatomi ligner det av pattedyr (figur 1a). Til tross for noen forskjeller mellom sebrafisk og pattedyr øyne, slik som å ha en ciliary sone i stedet for en ciliary kropp17, forskjeller i optiske egenskaper18, og forskjeller i morphogenesis under embryonale utviklingen19, den sebrafisk Eye er en utmerket modell for å studere øye utvikling og forstå øyensykdom<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Disse protokollene ble utviklet for å analysere kortikale linse morfologi, strukturelle integriteten til sebrafisk linsen sting i faste og levende linser og for å måle plasseringen av sebrafisk linsen kjernen langs fremre-bakre akse.

Vurdering av sebrafisk Lens nucleus lokalisering og Sutural integritet

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Våre protokoller gir et utgangspunkt for funksjonelle studier av linseutvikling og fysiologi og for omvendt genetisk screening av linsefenotyper i sebrafisk. Våre protokoller bro in vitro og in vivo analyser av sebrafisk linse membran morfologi og gir en ny og grei metode for å kvantifisere utviklingen av sebrafisk linse optikk. Analyse av sebrafisklinsemorfologi og optikk fører til innsikt i mekanismer som kontrollerer linseutvikling, normal fysiologi og patofysiologi.Denne innsikten kan igjen føre til en evne til å forsinke eller forhindre katarakt. Det har ikke vært noen rapporter i andre arter enn sebrafisk av asymmetrisk lokaliserte linsekjerner. Identifisering av linsesuger er avgjørende for riktig orientering av linsen for å måle kjerne lokalisering.Etter bekreftelse av tilstrekkelig sedasjon med Tricaine, bruk mikrodisseksjonsaks til umiddelbart å avgifte begge øynene fra enten en voksen eller en larval sebrafisk og legg begge øynene i en 35-millimeter skreddersydd petriskål med silikon disseksjonsform fylt med PBS. For å høste linsen fra en voksen sebrafisk, plasser øyeplakaten side opp og sett inn tang i en mindre enn 45-graders vinkel gjennom optisk plate. Bruk disseksjonsaks for å lage to eller tre radiale snitt gjennom netthinnen og sclera fra optisk plate til ciliary sonen i immobilisert øye og skrelle tilbake netthinnen og sclera som blomsterblader.Inverter øyet, hornhinnen-side opp, og bruk den flate siden av saksen til å immobilisere linsen indirekte via manipulering av sclera og hornhinnen ved hjelp av tang for å trekke bort netthinnen og festet vev, og deretter forsiktig trimme bort overflødig vev fra linsen. For larval sebrafisk linse høsting, plasser en larval øye bakre side opp på den flate delen av en silikon parabolen av PBS og bruk en skjerpet wolfram nål for å gjøre radiale kutt gjennom netthinnen og sclera mens immobilisere øyet med en annen nål eller tang, deretter forsiktig scoop linsen fra dissosiert øye med den stumpe siden av en skreddersydd wolfram-wire nål og forsiktig trekke bort det vedlagte vevet. For å måle den fremre-bakre akse linsekjerne lokalisering, orienterer de nyekssisede linsene aksialt i PBS i en 35-millimeters tallerken med et dekkglassbunn med polene og suturene orientert parallelt med fokusplanet.For å identifisere linsekjernen, se etter en forskjell i brytningsindeksen, som vanligvis oppstår i grensesnittet til linsecortex og linsekjerne. Hvis linsesuger ikke er synlige, viser en liten slikke med tang til linsekapselen suturene og linsekjernen, noe som bidrar til å orientere linsen for målingen. Plasser parabolen på scenen av et disseksjonsmikroskop utstyrt med et kamera og bilde linsene med linsekjernen i fokus under brightfield belysning eller med differensial interferenskontrastoptikk.Bilde et mikrometer under samme forstørrelse for kalibrering, og klikk På Live View. Klikk Øyeblikksbilde for å få et bilde og lagre bildet som en TIFF-fil. Hvis du vil kalibrere de oppkjøpte objektivbildene, velger du det rette linjeverktøyet i et passende bildebehandlingsprogram og tegner en linje med kjent lengde på mikrometerbildet.Klikk Analyser og angi skala, angi den kjente avstanden og enhetene, velg deretter Global kalibrering og klikk OK. For å måle avstanden fra midten av linsekjernen til den fremre stangen, identifiser plasseringen av linsesugen og bruk det rette linjeverktøyet til å tegne en linje over det avbildede midten av linsekjernen i en aksial orientering. Midten av denne linjen er midten av linsekjernen. Tegn en annen linje fra dette punktet til den fremre polen på objektivet, og velg Mål i Analyser-menyen for å måle avstanden.Tegn en annen linje fra fremre pol til bakre pol og mål denne avstanden som objektivdiameteren, kopier deretter disse lengdene fra Resultat-vinduet til et regneark og beregn den normaliserte lokaliseringen av linsekjernen med hensyn til linseradiusen. Ved tre dager etter befruktning dannes fremre suturer på den fremre polen, og den slående konvergensen av celler visualiseres tydelig av falloidinfarging av de smale fibercellemembranene i faste embryoer. Sterkere bredfibercellemerking i linsemembran lokalisert mApple transgen tillater levende visualisering av membranunderdomener, men mangler sutural konvergens.Bakre suturer kan visualiseres både in vitro og in vivo på tre dager etter befruktning. I et ekvatorisk plan merker fallosin sterkt de ytre kortikale fibercellene, og avslører en flat sekskantet form. Falloidin er utelukket fra den komprimerte linsekjernen og villtype og mutert linse ser umulig å skille.Den sterke merkingen av brede fiberceller i linsemembran-lokalisert mApple mosaikktransgene avslører forstyrrelser i cellevolumet i den muterte linsen. Siden transgeneuttrykk ikke er begrenset av permeabilitet, avslører noen mosaikker linsekjernemerking. I ville typer dyr starter linsekjernen nærmere den fremre linsestangen i de tidlige utviklingsstadiene før sentralisering i voksen alder.Uttrykk for grønn-merkede proteiner i en transgen vert der cellemembranene fluorescerer rødt tillater samtidig protein lokalisering samt vurdering av fibercellemorfologi in vivo. Sebrafisk er spesielt godt egnet for in vivo-studier. Ved hjelp av verktøyene som er beskrevet her, kan vi sondere linsemekanismer, i stor grad studert in vitro, i et in vivo-system.

Research

JoVE Journal

Biology

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo electroporation av Morpholinos til Adult sebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Lokalisering Bruke Photo-aktivert Lokalisering Mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analyse av LINE-en Retrotransposition på enkelt Nucleus nivå

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Objektivet-gratis Video mikroskopi for dynamisk og kvantitativ analyse av tilhenger cellekultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studere Ribonucleotide inkorporering: Strand-spesifikke påvisning av Ribonucleotides i gjær genomet og måler Ribonucleotide-indusert mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Dissekere mekanoenzymatiske egenskaper av prosessive myosiner med ultrafast kraft-klemmespektroskopi

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Vurdering av tarmbarriereintegritet hos mus ved bruk av fluorescein-isotiocyanatmerket dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Mikroinjeksjon av rekombinant RCAS(A) retrovirus i embryonal kyllinglinse

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...