Name: assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00
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Gostaríamos de reconhecer a nossa fonte de financiamento: NIH R01 EY05661 para J. E. H, Ines Gehring para ajudar com a geração do aqp0a/b mutantes duplos e husbandry zebrafish, Dr. Daniel Dranow para as discussões que levam à geração dos transgênicos, Dr. Bruce Blumberg e os laboratórios do Dr. Ken Cho para o uso de seus microscópios de dissecação, e Dr. Megan Smith para ajudar com a análise estatística.

Os protocolos animais utilizados neste estudo aderem à declaração de ARVO para o uso de animais em pesquisa oftalmológica e visão e foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais institucionais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Irvine.

1. husbandry de zebrafish e eutanásia
<ol><li>Elevar e manter o zebrafish (cepa AB) condições laboratoriais padrão12. Elevar embriões em meio embrionário (EM)12. Adicionar 0, 3...

<ol>
	<li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens.">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li><li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+Zero+Puzzle.">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li><li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0.">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion.">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li><li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49.">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration.">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li><li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes.">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li><li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish.">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lens+development+in+the+zebrafish:+A+three-dimensional+time-lapse+analysis.">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. 261, 59-94 (2002).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+&#946;B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish.">Recapitulation of human &#946;B1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li><li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye.">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye.">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell &#38; Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li><li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens.">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li><li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics.">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68 (2016).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases.">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research.">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li><li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens.">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li><li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens.">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li><li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency.">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li><li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development.">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li><li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+(NKCC1)+and+sodium+chloride+cotransporter+(NCC)+and+their+effects+on+rat+lens+transparency.">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5/fibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish.">Integrin &#945;5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li><li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish.">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li></ol>

A análise da morfologia da lente zebrafish é o passo inicial na compreensão de fenótipos em mutantes, ou os efeitos de intervenções farmacológicas destinadas a estudar a biologia da lente ocular. Nós esboçam métodos para analisar suturas da lente, morfologia cortical da pilha da fibra e aspectos do núcleo da lente. Estas abordagens são uma combinação de in vitro e in vivo (em comparação com a tabela 1). Os métodos in vitro permitem maior detalhamento da morfolo...

O zebrafish é um modelo excelente para estudar o desenvolvimento e a fisiologia da lente devido às similaridades anatômicas às lentes de mamíferos, à facilidade relativa da manipulação genética e farmacológica, à velocidade do desenvolvimento embrionário do olho, ao tamanho pequeno e à transparência em estágios iniciais permitindo in vivo Imaging. Os métodos descritos aqui foram desenvolvidos para analisar a morfologia da lente zebrafish em estágios embrionários e adultos com foco na integridade sutural, morfologia da membrana cortical in vitro e in vivo, e localização da posição nuclear da lente ao longo do eixo ântero-posterior ex vivo. Estes métodos servem como um ponto de partida para estudos funcionais do desenvolvimento e da fisiologia da lente, assim como telas genéticas reversas para fenótipos da lente no zebrafish.
Morfologia da lente do zebrafish da imagem latente
Aquaporin 0 (AQP0) é a proteína mais abundante da membrana da lente e é crítico para o desenvolvimento da lente e a claridade, devido às funções essenciais múltiplas nos mamíferos. Zebrafish tem dois Aqp0s (Aqp0a e Aqp0b) e nós desenvolvemos métodos para analisar a perda de suas funções nas lentes embrionárias e adultas. Nossos estudos revelam que aqp0a-/-mutantes desenvolvem a opacidade polar anterior devido à instabilidade da sutura anterior, e aqp0a/b os mutantes duplos desenvolvem a opacidade nuclear1. AQP0 tem demonstrado desempenhar papéis no transporte de água2, adesão3,4, fixação citoesquelética5 e geração do gradiente de índice de refração6, mas estes estudos foram amplamente realizados em em vitro. O zebrafish fornece uma oportunidade única de estudar como a perda de função, ou a função perturbada de Aqp0a ou Aqp0b afetaria a morfologia e a função em uma lente viva. Para avaliar a morfologia das células da lente e a integridade sutural durante o desenvolvimento, modificamos os métodos imunohistoquímicos in vitro existentes7 para uso em lentes embrionárias e adultas, e geramos transgênicos para monitorar esse processo in vivo .
A análise de immunohistochemical da estrutura da membrana do plasma e da integridade sutural foi executada em embriões fixos inteiros e em lentes adultas. As lentes de zebrafish são extremamente pequenas (o diâmetro da lente é ~ 100 μm nos embriões e até 1 milímetro nos adultos) comparados com seus homólogos mamíferos e tem as suturas de ponto8, que são capturadas infrequëntemente nos Cryosections. Assim, as lentes inteiras são essenciais para analisar a integridade sutural. Para a análise in vivo da formação anterior da sutura, e a imagem latente da arquitetura precisa da pilha da lente, nós geramos transgênicos expressando Mapple especificamente as membranas de rotulagem da lente.
As vantagens da imagem latente viva de transgênicos da membrana da lente incluem: 1) evitando artefatos da fixação, 2) estudando mudanças morfológicas dinâmicas em filmes do tempo-lapso, e 3) permitindo estudos longitudinais em que os eventos mais adiantados podem ser correlacionados com mais tarde Fenótipos. A pigmentação da íris impede normalmente a imagem latente desobstruída da periferia da lente. A adição de 1-phenyl 2-thiourea (PTU) antes do primordia-5 (Prim-5) estágio9 impede o melanogênese e a pigmentação do olho até ao redor 4 dias postfertilização (DPF). No entanto, após 4 DPF, a periferia da lente é obscurecida in vivo, particularmente em estágios mais antigos. Além disso, a densidade da lente própria obscurece a imagem latente de seu pólo do posterior. Portanto, para estudar a morfologia da periferia da lente, ou a sutura posterior, após 4 DPF, as lentes precisam ser excisadas e fixas.
As linhas de zebrafish transgênicas têm sido utilizadas para analisar a estrutura da membrana da lente embrionária in vivo10. O Q01 transgênicas expressa uma proteína fluorescente ciano fundida a uma seqüência da segmentação da membrana, Gap43, conduzida pelo promotor EF1α e por um hexamer do elemento de DF4 pax6 Enhancer ubiquitously em pilhas de fibra da lente11. Q01 tem a expressão extra-lenticular, incluindo as pilhas do amácrinas no retina, que adiciona o sinal do fundo se o interesse preliminar é a lente. Nós desenvolvemos uma linha transgénica nova que expresse um mApple membrana-tethered especificamente na lente, com a finalidade de evitar todo o sinal extra-lenticular.
Localização do núcleo da lente
Nós descobrimos que o núcleo da lente se move de uma posição anterior inicial no zebrafish larval a uma posição central no eixo anterior-posterior em lentes adultas. Esta mudança na posição do núcleo elevado da lente do índice refração é pensada para ser uma exigência para o desenvolvimento normal do sistema ótico da lente do zebrafish1. Nossos métodos permitem a quantificação da centralização nuclear da lente em relação ao raio da lente. Usando este método, nós mostramos que Aqp0a é exigido para a centralização nuclear da lente1, e este método simples pode ser aplicado a outros estudos do desenvolvimento e da fisiologia da lente e de suas propriedades óticas no modelo do zebrafish.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">P7629</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; very toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:310px;">4% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:118px;">RT 157-4</td>
			<td>CAUTION &#8211; health hazard, combustible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Cryostat</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:118px;">CM3050S</td>
			<td style="width:258px;">Objective and chamber temperature set to -21&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">D1306</td>
			<td>CAUTION &#8211; irritating to eyes and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">D128</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; combustible, penetrates skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable base mold</td>
			<td style="width:196px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:118px;">15154-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable Pasteur glass pipets</td>
			<td style="width:196px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td>Keep forceps sharpened</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">A5040</td>
			<td>CAUTION - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)</td>
			<td style="width:196px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:118px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Glycerol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hu&#946;B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td>
			<td style="width:196px;">Addgene</td>
			<td style="width:118px;">ID:122451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">Wayne Rasband, NIH</td>
			<td style="width:118px;">v1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Low Melt Agarose (LMA)</td>
			<td style="width:196px;">Apex</td>
			<td style="width:118px;">902-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">V 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements AR software</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus&#160; with a model 2.1.1.183 controller</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus microscope&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phalloidin-Alexa Flour 546</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:118px;">A22283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phenol Red indicator (1% w/v)</td>
			<td style="width:196px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:118px;">5725-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">BP399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Photoshop</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Apo 60x/1.2 WD objective</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Power source</td>
			<td style="width:196px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:118px;">MTr 22</td>
			<td>Or equivalent power source&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Slide warmer model No. 26020FS</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:310px;">Sodium Hydroxide beads</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">S612-3</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Superfrost/Plus microscope slide</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Sylgard 184 silicone Dow Corning</td>
			<td style="width:196px;">World Prevision Instruments</td>
			<td style="width:118px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:196px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:118px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Triton X-100 BioXtra</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">T9284</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vannas micro-dissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:118px;">1346</td>
			<td>Sharp/sharp straight tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vectashield antifade mouting medium</td>
			<td style="width:196px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:118px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">W11262</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity

O zebrafish é serido excepcionalmente à manipulação genética e à imagem latente in vivo , fazendo lhe um modelo cada vez mais popular para estudos genéticos reversos e para a geração de transgênicos para in vivo Imaging. Estas capacidades únicas fazem o zebrafish uma plataforma ideal para estudar o desenvolvimento e a fisiologia da lente da ocular. Nossos resultados recentes que um Aquaporin-Aqp0a, é exigido para a estabilidade da sutura anterior da lente, assim como para o deslocamento do núcleo da lente ao centro da lente com idade conduziu-nos desenvolver as ferramentas seridos especialmente para analisar as propriedades de lentes do zebrafish. Aqui nós esboçam métodos detalhados para a dissecção da lente que pode ser aplicada às lentes larval e adultas, para prepará-las para a análise histológica, immunohistochemistry e imagem latente. Nós focalizamos na análise da integridade da sutura da lente e da morfologia da pilha cortical e comparar dados gerados das lentes dissecadas com os dados obtidos da imagem latente in vivo da morfologia da lente feita possível por uma linha transgénica nova do zebrafish com um geneticamente marcador fluorescente codificado. A análise das lentes dissecadas perpendiculares ao seu eixo óptico permite quantificar a posição relativa do núcleo da lente ao longo do eixo ântero-posterior. O movimento do núcleo da lente de uma posição anterior inicial ao centro é exigido para o sistema ótico normal da lente no zebrafish adulto. Assim, uma medida quantitativa da posição nuclear da lente correlaciona-se diretamente com suas propriedades óticas.

A anatomia ocular adulta do zebrafish assemelha-se pròxima àquela dos mamíferos (Figura 1a). Apesar de algumas diferenças entre os olhos de zebrafish e de mamíferos, tais como ter uma zona ciliar em vez de um corpo ciliar17, diferenças em propriedades óticas18, e diferenças na morfogênese durante o desenvolvimento embrionário19, o o olho de zebrafish é um modelo excelente para ...

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Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Estes protocolos foram desenvolvidos para analisar a morfologia da lente cortical, a integridade estrutural das suturas da lente do zebrafish em lentes fixas e vivas e para medir a posição do núcleo da lente do zebrafish ao longo do eixo anterior-posterior.

Avaliação da localização do núcleo da lente de zebrafish e integridade sutural

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Nossos protocolos fornecem um ponto de partida para estudos funcionais de desenvolvimento de lentes e fisiologia e para rastreamento genético reverso de fenótipos de lentes em zebrafish. Nossos protocolos fazem uma ponte in vitro e in vivo de análises in vitro e in vivo da morfologia da membrana da lente zebrafish e fornecem um novo e simples método para quantificar o desenvolvimento da óptica das lentes de zebrafish. Analisar a morfologia e a óptica das lentes de zebrafish leva a insights sobre mecanismos que controlam o desenvolvimento das lentes, a fisiologia normal e a fisiopatologia.Esses insights, por sua vez, podem levar a uma capacidade de retardar ou prevenir a catarata. Não houve relatos em espécies além de zebrafish de núcleos de lentes assimétricamente localizados. Identificar suturas de lentes é fundamental para orientar corretamente a lente para medir a localização do núcleo.Após a confirmação de sedação suficiente com Tricaine, use uma tesoura de microdisseção para extirir imediatamente ambos os olhos de um peixe-zebra adulto ou larval e colocar ambos os olhos em uma placa de Petri personalizada de 35 milímetros com um molde de dissecção de silicone preenchido com PBS. Para colher a lente de um zebrafish adulto, coloque o lado posterior do olho para cima e insira fórceps em um ângulo de menos de 45 graus através do disco óptico. Use a tesoura de dissecção para fazer duas ou três incisões radiais através da retina e esclera do disco óptico para a zona ciliar no olho imobilizado e descascar a retina e esclera como pétalas de flores.Inverta o olho, cornea-side para cima, e use o lado plano da tesoura para imobilizar a lente indiretamente através da manipulação da esclera e córnea usando fórceps para afastar a retina e tecidos ligados, em seguida, cuidadosamente cortar qualquer excesso de tecido da lente. Para a colheita da lente de zebrafish larval, coloque um lado posterior do olho larval sobre a parte plana de um prato de silicone de PBS e use uma agulha de tungstênio afiada para fazer cortes radiais através da retina e esclera enquanto imobiliza o olho com outra agulha ou fórceps, em seguida, colher suavemente a lente do olho dissociado com o lado contundente de uma agulha de fio de tungstênio feito sob medida e cuidadosamente puxar o tecido ligado. Para medir a localização do núcleo de lentes do eixo anterior-posterior, oriente as lentes recém-excisadas axially em PBS em um prato de 35 milímetros com um fundo de vidro de cobertura com os polos e suturas orientadas paralelamente ao plano de foco.Para identificar o núcleo da lente, procure uma diferença no índice de refração, que geralmente ocorre na interface do córtex da lente e núcleo da lente. Se as suturas das lentes não forem aparentes, uma leve lambida com fórceps na cápsula da lente revela as suturas e o núcleo da lente, ajudando a orientar a lente para a medição. Coloque o prato no palco de um microscópio de dissecção equipado com uma câmera e imagem das lentes com o núcleo da lente em foco sob iluminação brightfield ou com sensibilidade de contraste de interferência diferencial.Imagem um micrômetro sob a mesma ampliação para calibração e clique em Live View. Clique em Snapshot para obter uma imagem e salvar a imagem como um arquivo TIFF. Para calibrar as imagens da lente adquirida, em um programa de software apropriado de processamento de imagem, selecione a ferramenta de linha reta e desenhe uma linha de comprimento conhecido na imagem do micrômetro.Clique em Analisar e Definir escala e digitar a distância e unidades conhecidas, em seguida, selecione Calibração Global e clique em OK. Para medir a distância do centro do núcleo da lente até o polo anterior, identifique a localização da sutura da lente e use a ferramenta de linha reta para desenhar uma linha através do centro de imagens do núcleo da lente em uma orientação axial. O centro desta linha é o centro do núcleo das lentes. Desenhe outra linha deste ponto para o polo anterior da lente e selecione Medir no menu Analisar para medir a distância.Desenhe outra linha do polo anterior para o polo posterior e meça essa distância como diâmetro da lente, em seguida, copie esses comprimentos da janela Resultados para uma planilha e calcule a localização normalizada do núcleo da lente em relação ao raio da lente. Por três dias após a fertilização, as suturas anteriores formam-se no polo anterior e a convergência marcante das células é claramente visualizada pela coloração da fábula das membranas celulares de fibra estreita em embriões fixos. A rotulagem celular de fibra ampla mais forte na membrana de lente localizada mApple transgênico permite visualização ao vivo de subdomínios de membrana, mas não tem a convergência sutural.As suturas posteriores podem ser visualizadas tanto in vitro quanto in vivo em três dias após a fertilização. Em um plano equatorial, a faloideina rotula fortemente as células externas de fibra cortical, revelando uma forma hexagonal achatada. A falooidina é excluída do núcleo de lentes compactadas e do tipo selvagem e das lentes mutantes parecem indistinguíveis.A forte rotulagem de células de fibra ampla em mosaicos mApple localizados em membrana de lentes revelam interrupções no volume celular dentro da lente mutante. Como a expressão transgênica não é limitada pela permeabilidade, alguns mosaicos revelam rotulagem do núcleo de lentes. Em animais do tipo selvagem, o núcleo das lentes começa mais perto do polo de lente anterior durante os estágios iniciais de desenvolvimento antes de centralizar durante a vida adulta.Expressão de proteínas com marca verde em um hospedeiro transgênico no qual as membranas celulares fluoresce vermelho permite a localização simultânea da proteína, bem como a avaliação da morfologia das células de fibra in vivo. Os zebrafish são especialmente adequados para estudos in vivo. Usando as ferramentas descritas aqui, podemos sondar mecanismos de lentes, em grande parte estudados in vitro, em um sistema in vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Transplante de lente em Zebrafish e sua Aplicação na Análise de Mutantes Eye

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Biologia

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: localização de proteínas usando a foto-ativada Microscopia Localização e Microscopia Eletrônica

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Análise de LINE-1 retrotransposição no Núcleo de nível único

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Dissecando as propriedades mecanoenzimáticas de miosinas processivas com espectroscopia de força-braçadeira ultrarrápida

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Avaliação da integridade da barreira intestinal em camundongos usando Dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Microinjeção de Retrovírus RCAS(A) Recombinante em Lentes de Galinha Embrionárias

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...