Name: assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

Мы хотели бы отметить наш источник финансирования: низ R01 EY05661 к J. E. H, Инес Герринг для оказания помощи в генерации aqp0a/b двойных мутантов и рерио рыбоводства, д-р Даниэль Дранов для дискуссий, ведущих к генерации transgenics, д-р Брюс Лаборатории Блумберга и доктора Кена Чо для использования их анатомический микроскопов, и д-р Меган Смит за помощью в статистическом анализе.

Животных протоколов, используемых в этом исследовании придерживаются ARVO заявление по использованию животных в офтальмологических и Vision исследований и были одобрены институционального ухода за животными и Комитета по использованию (ИАКУК) Калифорнийского университета в Ирвине.
</...

<ol>
	<li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens.">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li><li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+Zero+Puzzle.">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li><li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0.">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion.">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li><li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49.">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration.">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li><li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes.">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li><li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish.">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lens+development+in+the+zebrafish:+A+three-dimensional+time-lapse+analysis.">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. 261, 59-94 (2002).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+&#946;B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish.">Recapitulation of human &#946;B1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li><li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye.">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye.">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell &#38; Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li><li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens.">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li><li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics.">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68 (2016).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases.">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research.">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li><li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens.">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li><li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens.">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li><li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency.">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li><li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development.">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li><li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+(NKCC1)+and+sodium+chloride+cotransporter+(NCC)+and+their+effects+on+rat+lens+transparency.">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5/fibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish.">Integrin &#945;5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li><li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish.">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li></ol>

Анализ морфологии линзы данио рерио является начальным шагом в понимании фенотипов в мутантах, или эффекты фармакологических вмешательств, направленных на изучение биологии глазной линзы. Мы обрисовать методы для анализа швов объектива, корковых морфологии клеток волокна и аспекты о...

Рыба данио является отличной моделью для изучения развития и физиологии объектива из-за анатомического сходства с объективами млекопитающих, относительной легкости генетических и фармакологических манипуляций, скорости эмбрионального развития глаз, небольшого размера и прозрачности на ранних стадиях, позволяющий в естественных условиях визуализации. Методы, описанные здесь были разработаны для анализа морфологии рерио рыбы объектива в эмбриональных и взрослых этапах с акцентом на культурной целостности, корковых мембранных морфологии в пробирке и в естественныхусловиях, и местоположение объектива ядерной позиции вдоль передней задней оси ex естественныхусловиях. Эти методы служат отправной точкой для функциональных исследований развития и физиологии линз, а также обратных генетических экранов для фенотипов объектива в рыбе данио.
Морфология рыб изображения данио зебрая
Аквапорин 0 (AQP0) является наиболее распространенным белком мембранный объектив и имеет решающее значение для обоих, объектив развития и ясности, из-за нескольких основных функций у млекопитающих. У рыбы данио есть два Aqp0s (Aqp0a и Aqp0b), и мы разработали методы анализа потери их функций как в эмбриональных, так и взрослых объективах. Наши исследования показывают, чтоaqp0a-/-мутанты развивают переднюю полярную непрозрачность из-за нестабильности переднего шва, и aqp0a/b Двойные мутанты развивают ядерную непрозрачность1. AQP0 было показано, играть роли в водный транспорт2, адгезия3,4, цитоскелетная якорь5 и генерация градиента индекса преломления6, но эти исследования в значительной степени были выполнены в пробирке. Рыба данио дает уникальную возможность изучить, как потеря функции, или Возмущенные функции Aqp0a или Aqp0b повлияет на морфологию и функции в живых линз. Для оценки морфологии клеток объектива и культурной целостности во время разработки, мы модифицировали существующие в пробирке иммуногистхимических методов7 для использования в эмбриональных и взрослых линз, и генерируемые трансгенов, чтобы контролировать этот процесс в естественных условиях .
Иммуногистизухимический анализ структуры мембраны плазмы и культурной целостности был выполнен в цельных фиксированных эмбрионах и взрослых объективах. Линзы зебрая рыбы чрезвычайно малы (диаметр объектива ~ 100 мкм в зародыши и до 1 мм у взрослых) по сравнению со своими коллегами млекопитающих и имеют точешвы8, которые редко улавливаются в криометазах. Таким образом, целые линзы необходимы для анализа культурной целостности. Для в естественных условиях анализ формирования переднего шва, и визуализации точной архитектуры клеток объектива, мы генерируются transgenics выражая Mapple конкретно маркировки линз мембраны.
Преимущества живой визуализации transgenics мембраны объектива включают в себя: 1) избежать фиксации артефактов, 2) изучение динамических морфологических изменений в покадровой фильмов, и 3) позволяет продольных исследований, в которых ранее события могут быть коррелированы с более поздней Фенотипов. Пигментация радужки обычно предотвращает четкое изображение периферии объектива. Добавление 1-фенил 2-тиуреа (PTU) до Примордия-5 (прим-5) стадия9 предотвращает Меланогенез и пигментацию глаз до примерно 4 дней постоплодотворения (DPF). Однако, после 4 DPF, периферия объектива скрыта в естественныхусловиях, особенно на старших стадиях. Кроме того, плотность объектива сама затемняет изображения его заднего полюса. Поэтому, чтобы изучить морфологию периферии объектива, или задний шов, после 4 DPF, линзы должны быть иссечено и исправлено.
Трансгенные линии рыбы данио были использованы для анализа эмбриональных мембранные структуры объектива в естественныхусловиях10. Q01 трансгенных выражает голубого флуоресцентного белка сливается с мембраны таргетинга последовательности, Gap43, движимый EF1α промоутер и гексамера DF4 PAX6 усилитель элемента повсеместно в линзы волокна клетки11. Q01 имеет экстра-линзовидные выражения, в том числе амакрин клеток в сетчатке, которая добавляет фоновый сигнал, если основной интерес является объектив. Мы разработали новую трансгенную линию, которая выражает мембранно-привязку mApple специально в объективе, с целью избежать любого экстра-линзовидные сигнала.
Локализация ядра объектива
Мы обнаружили, что ядро объектива перемещается из первоначального переднего расположения в личиночной данио, к центральному расположению в передней-задней оси во взрослых линз. Этот сдвиг в положении ядра объектива преломления индекса, как полагают, является требованием для нормального развития рыбы-объектива зебрано-оптики1. Наши методы позволяют количественно определять ядерную централизацию объектива по отношению к радиусу объектива. Используя этот метод, мы показали, что Aqp0a требуется для объектива ядерная централизация1, и этот простой метод может быть применен к другим исследованиям развития и физиологии объектива и его оптических свойств в модели рыбы данио.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">P7629</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; very toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:310px;">4% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:118px;">RT 157-4</td>
			<td>CAUTION &#8211; health hazard, combustible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Cryostat</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:118px;">CM3050S</td>
			<td style="width:258px;">Objective and chamber temperature set to -21&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">D1306</td>
			<td>CAUTION &#8211; irritating to eyes and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">D128</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; combustible, penetrates skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable base mold</td>
			<td style="width:196px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:118px;">15154-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable Pasteur glass pipets</td>
			<td style="width:196px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td>Keep forceps sharpened</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">A5040</td>
			<td>CAUTION - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)</td>
			<td style="width:196px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:118px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Glycerol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hu&#946;B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td>
			<td style="width:196px;">Addgene</td>
			<td style="width:118px;">ID:122451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">Wayne Rasband, NIH</td>
			<td style="width:118px;">v1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Low Melt Agarose (LMA)</td>
			<td style="width:196px;">Apex</td>
			<td style="width:118px;">902-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">V 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements AR software</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus&#160; with a model 2.1.1.183 controller</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus microscope&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phalloidin-Alexa Flour 546</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:118px;">A22283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phenol Red indicator (1% w/v)</td>
			<td style="width:196px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:118px;">5725-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">BP399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Photoshop</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Apo 60x/1.2 WD objective</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Power source</td>
			<td style="width:196px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:118px;">MTr 22</td>
			<td>Or equivalent power source&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Slide warmer model No. 26020FS</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:310px;">Sodium Hydroxide beads</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">S612-3</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Superfrost/Plus microscope slide</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Sylgard 184 silicone Dow Corning</td>
			<td style="width:196px;">World Prevision Instruments</td>
			<td style="width:118px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:196px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:118px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Triton X-100 BioXtra</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">T9284</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vannas micro-dissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:118px;">1346</td>
			<td>Sharp/sharp straight tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vectashield antifade mouting medium</td>
			<td style="width:196px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:118px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">W11262</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity

В данио рыба уникально подходит для генетических манипуляций и в естественных условиях визуализации, что делает его все более популярной моделью для обратного генетических исследований и для генерации transgenics для в естественных условиях визуализации. Эти уникальные возможности делают рыбу данио идеальной платформой для изучения развития и физиологии глазной линзы. Наши недавние выводы о том, что Аквапорин-0, Aqp0a, необходим для устойчивости шва переднего объектива, а также для смещения ядра объектива к центру объектива с возрастом привели нас к разработке инструментов, особенно подходящих для анализа свойств рыб-рыбок данио. Здесь мы очертить подробные методы рассечения объектива, которые могут быть применены как для личинок и взрослых линз, чтобы подготовить их для гистологического анализа, иммуногистохимии и визуализации. Мы фокусируемся на анализе целостности линз шва и морфологии клеток корковых и сравнить данные, полученные от расчлененных линз с данными, полученными в естественных условиях визуализации морфологии объектива стало возможным благодаря новой трансгенной рыбы-данио линии с генетически закодированный флуоресцентный маркер. Анализ расчлененных линз, перпендикулярных их оптической оси, позволяет количественно определять относительное положение ядра объектива вдоль передней-задней оси. Движение ядра объектива от начального переднего положения к центру необходимо для нормальной оптики объектива у взрослых рыб данио. Таким образом, количественная мера ядерной позиции объектива напрямую коррелирует с его оптическими свойствами.

Анатомия взрослой рыбы в глазном зебрае очень напоминает млекопитающих (рис. 1a). Несмотря на некоторые различия между рыбами данио и млекопитающихся глаз, таких, как с ресеплярной зоны вместо ресницах тела17, различия в оптических свойств<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Эти протоколы были разработаны для анализа морфологии коры головного хрусталика, структурную целостность швами рыбы данио рерио в фиксированных и живых линз и для измерения положения ядра рыбы объектива данио, по передней задней оси.

Оценка «локализация ядра» и «культурное целостность» Зебрая

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Наши протоколы являются отправной точкой для функциональных исследований развития линз и физиологии, а также для обратного генетического скрининга фенотипов линз у зебры. Наши протоколы мост в пробирке и in vivo анализы зебры линзы мембранной морфологии и обеспечить новый и простой метод количественной оценки развития оптики объектива зебры. Анализ морфологии линз зебры и оптики приводит к пониманию механизмов, контролирующих развитие хрусталика, нормальной физиологии и патофизиологии.Эти идеи, в свою очередь, может привести к способности задерживать или предотвращать катаракту. Там не было никаких сообщений в видах, кроме зебры асимметрично локализованных ядер объектива. Определение шовов объектива имеет решающее значение для правильного ориентировки объектива для измерения локализации ядра.После подтверждения достаточного sedation с Tricaine, используйте ножницы microdissection немедленно excise оба глаза от или взрослого или larval zebrafish и поместите оба глаза в 35-миллиметровую изготовленную на заказ чашку Петри с силиконовой формой вскрытия заполненной с PBS. Чтобы собрать объектив у взрослой зебры, поместите заднюю сторону глаза вверх и вставьте миппы под углом менее 45 градусов через оптический диск. Используйте ножницы для вскрытия, чтобы сделать два или три радиальных разреза через сетчатку и склеру от оптического диска до цилиарной зоны в обездвиженные глаза и очистить назад сетчатки и склеры, как лепестки цветов.Инвертировать глаз, роговицы стороне вверх, и использовать плоскую сторону ножниц для обездвиживания объектива косвенно с помощью манипуляции склеры и роговицы с помощью миппов, чтобы вытащить сетчатки и прилагается тканей, а затем тщательно обрезать любые избыточные ткани из объектива. Для личинки зебрафиш объектив урожая, место личинки глаз задней стороне вверх на плоскую часть силиконовой блюдо PBS и использовать заточенные вольфрама иглы, чтобы сделать радиальные разрезы через сетчатку и склеру в то время как иммобилизация глаза с другой иглой или типсами, а затем осторожно черпать объектив из диссоциированного глаза с тупой стороной на заказ вольфрама проволоки иглы и тщательно вытащить. Для измерения локализации ядра передней и задней оси объектива ориентируйте свежевырезанные линзы аксиально в PBS в 35-миллиметровое блюдо с крышкой стекла с полюсами и швами, ориентированными параллельно плоскости фокусировки.Чтобы определить ядро объектива, ищите разницу в рефракционном индексе, который обычно возникает на стыке коры хрусталика и ядра объектива. Если линзы швы не являются очевидными, небольшое лизать с миппами к капсуле объектива показывает швы и ядро объектива, помогая сориентировать объектив для измерения. Поместите блюдо на сцену микроскопа вскрытия, оснащенного камерой и изображением линз с ядром объектива в фокусе под ярким освещением поля или с дифференциальной интерференционной контрастной оптикой.Изображение микрометра под тем же увеличением для калибровки и нажмите Live View. Нажмите Snapshot, чтобы получить изображение и сохранить изображение в качестве файла TIFF. Для калибровки полученных изображений объектива в соответствующей программе обработки изображений выберите инструмент прямой линии и нарисуйте линию известной длины на микрометровом изображении.Нажмите Анализ и Установите шкалу и введите известное расстояние и единицы, затем выберите глобальную калибровку и нажмите OK. Для измерения расстояния от центра ядра объектива до переднего полюса определите расположение шва объектива и используйте инструмент прямой линии, чтобы нарисовать линию через изображенный центр ядра объектива в осяной ориентации. Центром этой линии является центр ядра объектива. Нарисуйте другую линию от этой точки к передней полюса объектива и выберите Мера в меню анализа для измерения расстояния.Нарисуйте другую линию от переднего полюса до заднего полюса и измерьте это расстояние как диаметр объектива, затем скопировать эти длины из окна Результатов в электронную таблицу и рассчитать нормализованную локализацию ядра объектива по отношению к радиусу объектива. К трем дням после оплодотворения на передней части полюса образуются передние швы, и поразительное сближение клеток четко визуализируется фаллоидином, окрашивая узкие мембраны волоконных клеток в фиксированные эмбрионы. Более сильная маркировка клеток широкого волокна в мембране объектива локализованных трансгенных mApple позволяет живая визуализация мембранных субдоменов, но не имеет sutural конвергенции.Задние швы можно визуализировать как в пробирке, так и в виво в течение трех дней после оплодотворения. В экваториальной плоскости фаллоидин сильно маркирует наружные клетки корковых волокон, открывая сплющенную шестиугольную форму. Фаллоидин исключен из уплотненого ядра объектива и дикий тип и мутант объектив выглядят неотличимыми.Сильная маркировка широких волоконных клеток в мембранных мембранах линз, локализованных трансгеникой mApple, выявляет нарушения в объеме клеток в объективе мутанта. Поскольку трансгенное выражение не ограничено проницаемостью, некоторые мозаики показывают маркировку ядра объектива. У диких животных типа, ядро объектива начинается ближе к передней полюса объектива на ранних стадиях развития до централизации во взрослом возрасте.Выражение зеленых белков в трансгенном хозяине, в котором клеточные мембраны флуоресцентный красный позволяет одновременно локализации белка, а также оценки морфологии клеток волокна in vivo. Зебрафиш особенно хорошо подходит для исследований in vivo. Используя описанные здесь инструменты, мы можем исследовать механизмы объектива, в значительной степени изученные в пробирке, в системе in vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Объективы трансплантации в данио рерио и его применение в анализе глаз Мутанты

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Retina взрослых данио рерио

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Нано-FEM: Белка Локализация с использованием фото-активированного микроскопии локализации и электронная микроскопия

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Анализ LINE-1 ретротранспозиции на уровне одного ядра

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Объектив Бесплатные видео микроскопии для динамического и количественный анализ культуры адэрентных клеток

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Изучение рибонуклеотид включение: Обнаружение Strand конкретных Ribonucleotides в геноме дрожжей и измерения рибонуклеотид индуцированного мутагенеза

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Рассечение механоферментных свойств процессивных миозидов с помощью сверхбыстрой силово-зажимной спектроскопии

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Оценка целостности кишечного барьера у мышей с использованием меченного флуоресцеин-изотиоцианатом декстрана

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Микроинъекция рекомбинантного ретровируса RCAS(A) в хрусталик эмбриона курицы

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...