Name: assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity
Uploaded: 2019-05-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

Vi skulle vilja erkänna vår finansiering Källa: NIH r01 EY05661 till J. E. H, Ines Gehring för att bistå med att generera aqp0a/b dubbla mutanter och zebra fisk hållning, Dr Daniel Dranow för diskussioner som leder till generering av transgenics, Dr Bruce Blumberg och Dr Ken Cho labb för användning av deras dissekera Mikroskop, och Dr Megan Smith för hjälp med statistisk analys.

De djur protokoll som används i denna studie följa ARVO uttalande för användning av djur i oftalmisk och vision Research och har godkänts av den institutionella djur omsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of California, Irvine.

1. Zebrafish hållning och döds hjälp
<ol><li>Höj och Behåll zebra fiskar (AB-stam) under standard laboratorie förhållanden12. Uppfostra embryon i embryo medium (EM)12. Lägg till 0,0...

<ol>
	<li>Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqp0a+Regulates+Suture+Stability+in+the+Zebrafish+Lens.">Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).</li><li>Hall, J. E., Mathias, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+Zero+Puzzle.">The Aquaporin Zero Puzzle.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).</li><li>Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+C-loop+Domain+Plays+an+Important+Role+in+the+Cell+Adhesion+Function+of+Aquaporin+0.">The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0.</a> Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+AQP0+performs+cell-to-cell+adhesion.">Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).</li><li>Lindsey Rose, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+Terminus+of+Lens+Aquaporin+0+Interacts+with+the+Cytoskeletal+Proteins+Filensin+and+CP49.">The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).</li><li>Kumari, S. S., Varadaraj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+0+plays+a+pivotal+role+in+refractive+index+gradient+development+in+mammalian+eye+lens+to+prevent+spherical+aberration.">Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).</li><li>Uribe, R. A., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Cryosections+from+Embryonic+and+Adult+Zebrafish+Eyes.">Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).</li><li>Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+adult+morphology+of+the+eye+lens+in+the+zebrafish.">Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish.</a> Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lens+development+in+the+zebrafish:+A+three-dimensional+time-lapse+analysis.">Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis.</a> Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).</li><li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina.">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. 261, 59-94 (2002).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+&#946;B1-crystallin+promoter+activity+in+transgenic+zebrafish.">Recapitulation of human &#946;B1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).</li><li>Soules, K., Link, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+anterior+segment+in+the+zebrafish+eye.">Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye.</a> BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).</li><li>Greiling, T. M. S., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transparent+lens+and+cornea+in+the+mouse+and+zebra+fish+eye.">The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye.</a> Seminars in Cell &#38; Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).</li><li>Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fate+and+Differentiation+of+the+Developing+Ocular+Lens.">Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).</li><li>Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+eye-a+paradigm+for+investigating+human+ocular+genetics.">The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics.</a> Eye. 31, 68 (2016).</li><li>Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Visual+System+of+Zebrafish+and+its+Use+to+Model+Human+Ocular+Diseases.">The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases.</a> Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).</li><li>Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+the+move+towards+ophthalmological+research.">Zebrafish on the move towards ophthalmological research.</a> Eye. 28 (4), 367-380 (2014).</li><li>Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Microscopy+Reveals+Zones+of+Membrane+Remodeling+in+the+Outer+Cortex+of+the+Human+Lens.">Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).</li><li>Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Effects+of+Hyperbaric+Oxygen+on+the+Biochemical+and+Optical+Properties+of+the+Bovine+LensEffects+of+HBO+on+the+Bovine+Lens.">Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).</li><li>Gold, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKAP2+anchors+PKA+with+aquaporin-0+to+support+ocular+lens+transparency.">AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).</li><li>Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distributions+of+AQP5+and+AQP0+in+embryonic+and+postnatal+mouse+lens+development.">Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development.</a> Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).</li><li>Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+sodium+potassium+chloride+cotransporter+(NKCC1)+and+sodium+chloride+cotransporter+(NCC)+and+their+effects+on+rat+lens+transparency.">Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency.</a> Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+&#945;5/fibronectin1+and+focal+adhesion+kinase+are+required+for+lens+fiber+morphogenesis+in+zebrafish.">Integrin &#945;5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).</li><li>Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+proteasome+system+is+required+for+cell+proliferation+of+the+lens+epithelium+and+for+differentiation+of+lens+fiber+cells+in+zebrafish.">The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish.</a> Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).</li><li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens.">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li></ol>

Analys av zebra fiskar lins morfologi är det första steget för att förstå fenotyper i mutanter, eller effekterna av farmakologiska interventioner som syftar till att studera biologi av okulär linsen. Vi skisserar metoder för att analysera lins suturer, kortikal fiber cell morfologi och aspekter av linsen kärnan. Dessa metoder är en kombination av in vitro och in vivo (jämfört med tabell 1). In vitro -metoder möjliggör större detaljer i den yttre kortikal cell morf...

Den zebra fiskar är en utmärkt modell för att studera lins utveckling och fysiologi på grund av de anatomiska likheter med däggdjurs linser, relativ lätthet av genetisk och farmakologisk manipulation, snabbhet i embryonala ögat utveckling, liten storlek och transparens i tidiga skeden som möjliggör in vivo Imaging. De metoder som beskrivs här har utvecklats för att analysera zebra fiskar lins morfologi på embryonala och vuxna stadier med fokus på suturala integritet, kortikal membran morfologi in vitro och in vivo, och placeringen av linsen kärn kraft position längs främre-bakre axeln ex vivo. Dessa metoder fungerar som en utgångs punkt för funktionella studier av lins utveckling och fysiologi, samt omvänd genetiska skärmar för lins fenotyper i Zebrafish.
Avbildning zebra fiskar lins morfologi
Aquaporin 0 (AQP0) är det mest förekommande lins membran proteinet och är kritiskt för både lins utveckling och klarhet, på grund av flera viktiga funktioner hos däggdjur. Zebrafish har två Aqp0s (Aqp0a och Aqp0b) och vi har utvecklat metoder för att analysera förlust av deras funktioner i både embryonala och vuxna linser. Våra studier visar att aqp0a-/-mutanter utveckla främre polära opacitet på grund av instabilitet i främre suturen, och aqp0a/b dubbla mutanter utveckla nukleär opacitet1. AQP0 har visats spela roller i vatten transport2, adhesion3,4, cytoskeletanförankring5 och generering av brytnings index gradient6, men dessa studier har till stor del utförts i för in vitro. Den zebra fiskar ger en unik möjlighet att studera hur förlust av funktion, eller orolig funktion av Aqp0a eller Aqp0b skulle påverka morfologi och funktion i en levande lins. För att bedöma objektivets cell morfologi och suturural integritet under utveckling, modifierade vi befintliga in vitro immunhistokemiska metoder7 för användning i embryonala och vuxna linser, och genererade transgena att övervaka denna process in vivo .
Immunohistokemisk analys av plasma membran struktur och suturural integritet utfördes i hela fasta embryon och vuxna linser. Zebrafish linser är extremt små (lins diametern är ~ 100 μm i embryon och upp till 1 mm hos vuxna) jämfört med deras däggdjur motsvarigheter och har punkt suturer8, som sällan fångas i kryosnitt. Således, hela linser är viktiga för att analysera suturural integritet. För in vivo analys av främre sutur formation, och avbildning av exakt lins cell arkitektur, genererade vi transgena uttrycker Mapple specifikt märkning lins membran.
Fördelar med Live Imaging av lins membran transgena inkluderar: 1) att undvika fixering artefakter, 2) studerar dynamiska morfologiska förändringar i Time-lapse filmer, och 3) möjliggör longitudinella studier där tidigare händelser kan korreleras med senare Fenotyper. Pigmentering av Iris förhindrar normalt klar avbildning av objektivets periferi. Tillsats av 1-fenyl 2-Tiourea (PTU) före primordia-5 (Prim-5) Stage9 förhindrar melanogenes och ögonpigmentering upp till cirka 4 dagar postfertilisering (DPF). Men efter 4 DPF, linsen periferin är skymda in vivo, särskilt i äldre stadier. Dessutom, tätheten av linsen själv skymmer avbildning av sin bakre stolpe. Därför, för att studera morfologi av linsen periferi, eller den bakre suturen, efter 4 DPF, linser måste censurerade och fast.
Transgena zebrafisk linjer har använts för att analysera embryonal lins membran struktur in vivo10. Den Q01 transgena uttrycker en cyan fluorescerande protein smält till ett membran inriktning sekvens, Gap43, driven av EF1α Promotorn och en HEXAMER av DF4 pax6 Enhancer elementet ubiquitously i lins fiber celler11. Q01 har extra-lentikulär uttryck, inklusive amakrina celler i näthinnan, vilket ger bakgrunds signal om det primära intresset är linsen. Vi utvecklade en ny transgen linje som uttrycker en membran-tjudrad mApple specifikt i linsen, i syfte att undvika eventuella extra-lentikulär signal.
Lokalisering av objektiv kärnan
Vi upptäckte att linsen kärnan rör sig från en initial främre plats i larv zebra fiskar till en central plats i främre-bakre axeln i vuxna linser. Denna förskjutning i positionen av den höga brytnings index lins kärnan tros vara ett krav för normal utveckling av zebra fiskar lins optik1. Våra metoder möjliggör kvantifiering av objektivets kärn centralisering i förhållande till objektivets radie. Med hjälp av denna metod, visade vi att Aqp0a krävs för lins nukleär centralisering1, och denna enkla metod kan tillämpas på andra studier av utvecklingen och fysiologi linsen och dess optiska egenskaper i zebra fiskar modellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">P7629</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; very toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:310px;">4% Paraformaldehyde aqueous solution</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:118px;">RT 157-4</td>
			<td>CAUTION &#8211; health hazard, combustible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Cryostat</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:118px;">CM3050S</td>
			<td style="width:258px;">Objective and chamber temperature set to -21&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">DAPI</td>
			<td style="width:196px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:118px;">D1306</td>
			<td>CAUTION &#8211; irritating to eyes and skin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">D128</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; combustible, penetrates skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable base mold</td>
			<td style="width:196px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:118px;">15154-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Disposable Pasteur glass pipets</td>
			<td style="width:196px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:118px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Dumont # 5 forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td>Keep forceps sharpened</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:118px;">A5040</td>
			<td>CAUTION - toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)</td>
			<td style="width:196px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:118px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Glycerol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hu&#946;B1cry:mAppleCAAX DNA construct</td>
			<td style="width:196px;">Addgene</td>
			<td style="width:118px;">ID:122451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">ImageJ</td>
			<td style="width:196px;">Wayne Rasband, NIH</td>
			<td style="width:118px;">v1.51n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Low Melt Agarose (LMA)</td>
			<td style="width:196px;">Apex</td>
			<td style="width:118px;">902-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;">V 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">NIS-Elements AR software</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus&#160; with a model 2.1.1.183 controller</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">DP70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus microscope&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Olympus Corp</td>
			<td style="width:118px;">SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phalloidin-Alexa Flour 546</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:118px;">A22283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phenol Red indicator (1% w/v)</td>
			<td style="width:196px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:118px;">5725-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">BP399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Photoshop</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:196px;">Adobe</td>
			<td style="width:118px;">CS5 v12.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plan Apo 60x/1.2 WD objective</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:118px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Power source</td>
			<td style="width:196px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:118px;">MTr 22</td>
			<td>Or equivalent power source&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Slide warmer model No. 26020FS</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:310px;">Sodium Hydroxide beads</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">S612-3</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Superfrost/Plus microscope slide</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:118px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Sylgard 184 silicone Dow Corning</td>
			<td style="width:196px;">World Prevision Instruments</td>
			<td style="width:118px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:196px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:118px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Triton X-100 BioXtra</td>
			<td style="width:196px;">Sigma</td>
			<td style="width:118px;">T9284</td>
			<td style="width:258px;">CAUTION &#8211; Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vannas micro-dissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:118px;">1346</td>
			<td>Sharp/sharp straight tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:310px;">Vectashield antifade mouting medium</td>
			<td style="width:196px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:118px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:310px;">Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594</td>
			<td style="width:196px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:118px;">W11262</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of zebrafish lens nucleus localization and sutural integrity

Zebra fisken är unikt lämpad för genetisk manipulation och in vivo Imaging, vilket gör den till en alltmer populär modell för omvända genetiska studier och för generering av transgena för in vivo Imaging. Dessa unika funktioner gör zebra fiskar en idealisk plattform för att studera okulär lins utveckling och fysiologi. Våra senaste rön att en Aquaporin-0, Aqp0a, krävs för stabiliteten i främre linsen sutur, liksom för förskjutning av linsen kärnan till linsen centrum med åldern ledde oss att utveckla verktyg som är särskilt lämpade för att analysera egenskaperna hos zebra fisk linser. Här beskriver vi detaljerade metoder för lins dissektion som kan appliceras på både larv och vuxna linser, för att förbereda dem för histologisk analys, immunhistokemi och Imaging. Vi fokuserar på analys av lins sutur integritet och kortikal cell morfologi och jämföra data som genereras från dissekerade linser med data från in vivo Imaging av lins morfologi möjliggjorts genom en ny transgena zebra fiskar linje med en genetiskt kodad fluorescerande markör. Analys av dissekeras linser vinkel rätt mot sin optiska axel möjliggör kvantifiering av den relativa positionen av linsen kärnan längs den främre-bakre axeln. Förflyttning av linsen kärnan från en initial främre position till centrum krävs för normal lins optik i vuxen Zebrafish. Således, ett kvantitativt mått på linsen kärn kraft position direkt korrelerar med dess optiska egenskaper.

Vuxen zebra fiskar öga anatomi liknar mycket av däggdjur (figur 1a). Trots vissa skillnader mellan zebra fiskar och däggdjur ögon, såsom att ha en ciliär zon i stället för en ciliär kropp17, skillnader i optiska egenskaper18, och skillnader i morfogenes under embryonal utveckling19, den Zebra fiskar Eye är en utmärkt modell för att studera ögonutveckling och förstå oftalmis...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity at JoVE.com

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

Dessa protokoll utvecklades för att analysera kortikal lins morfologi, strukturell integritet av zebra fiskar lins suturer i fasta och levande linser och för att mäta positionen av zebra fiskar lins kärnan längs den främre-bakre axeln.

Bedömning av Zebrafish lins Nucleus lokalisering och Suturural integritet

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

Våra protokoll ger en utgångspunkt för funktionella studier av linsutveckling och fysiologi och för omvänd genetisk screening av lins fenotyper i zebrafisk. Våra protokoll överbryggar in vitro- och in vivo-analyser av zebrafisklinsmembranmorfologi och ger en ny och okomplicerad metod för att kvantifiera utvecklingen av zebrafisklinsoptik. Analysera zebrafish lins morfologi och optik leder till insikter i mekanismer som styr linsutveckling, normal fysiologi, och patofysiologi.Dessa insikter kan i sin tur leda till en förmåga att fördröja eller förhindra katarakt. Det har inte förekommit några rapporter i andra arter än zebrafisk av asymmetriskt lokaliserade linskärnor. Identifiera lins suturer är avgörande för korrekt orientering linsen för att mäta kärnan lokalisering.Efter bekräftelse av tillräcklig sedering med Tricaine, använd mikrodisseksax för att omedelbart punktskatter båda ögonen från antingen en vuxen eller en larv zebrafish och placera båda ögonen i en 35-millimeters skräddarsydda Petri skålen med en silikon dissekering mögel fylld med PBS. För att skörda linsen från en vuxen zebrafisk, placera ögat bakre sidan upp och infoga tlyckor på mindre än 45-graders vinkel genom den optiska skivan. Använd dissekering sax för att göra två eller tre radiella snitt genom näthinnan och sclera från den optiska skivan till ciliärzonen i immobiliserade ögat och skala tillbaka näthinnan och sclera som blomblad.Invertera ögat, hornhinna-sidan upp, och använda den platta sidan av saxen för att immobilisera linsen indirekt via manipulation av sclera och hornhinna genom att använda tång för att dra bort näthinnan och bifogade vävnader, sedan försiktigt trimma bort eventuellt överskott vävnad från linsen. För larv zebrafisk lins skörd, placera en larv öga bakre sidan upp på den platta delen av en silikon maträtt av PBS och använda en vässad volfram nål för att göra radiella skär genom näthinnan och sclera medan immobilisera ögat med en annan nål eller tlys, sedan försiktigt skopa linsen från det dissocierade ögat med den trubbiga sidan av en skräddarsydd tungsten-tråd nål och försiktigt dra bort den bifogade vävnaden. För att mäta den främre-bakre axeln linskärnan lokalisering, orientera ny-strukits linser axiellt i PBS i en 35-millimeters maträtt med ett lockglas botten med poler och suturer orienterade parallellt med plan av fokus.För att identifiera linskärnan, leta efter en skillnad i brytningsindex, som vanligtvis sker vid gränssnittet mellan linsen cortex och linskärnan. Om lins suturer inte är uppenbara, en liten slicka med tlyckor till linsen kapseln avslöjar suturer och linsen kärnan, hjälpa orientera linsen för mätningen. Placera skålen på scenen i ett dissekering mikroskop utrustad med en kamera och bild linserna med linskärnan i fokus under Brightfield belysning eller med differentialinterdiktion kontrast optik.Avbilda en mikrometer under samma förstoring för kalibrering och klicka på Live-vy. Klicka på Snapshot om du vill skaffa en bild och spara bilden som en TIFF-fil. För att kalibrera de förvärvade linsbilderna, i ett lämpligt program för bildbehandlingsprogram, välj det rät linjeverktyget och rita en linje med känd längd på mikrometerbilden.Klicka på Analysera och ange skala och ange den kända sträckan och enheter, välj sedan Global kalibrering och klicka på OK. För att mäta avståndet från mitten av linskärnan till den främre polen, identifiera placeringen av linsen sutur och använda den raka linjen verktyget för att dra en linje över den avbildade mitten av linsen kärnan i en axiell orientering. Mitten av denna linje är centrum av linskärnan. Dra en annan linje från denna punkt till linsens främre pol och välj Mät i menyn Analysera för att mäta avståndet.Dra en annan linje från den främre polen till den bakre polen och mäta detta avstånd som linsdiameter, sedan kopiera dessa längder från resultat fönstret till ett kalkylblad och beräkna normaliserade lokalisering av lins kärnan med avseende på linsen radien. Genom tre dagar efter befruktning, främre suturer bildas vid främre polen och den slående konvergens av celler är tydligt visualiseras genom phalloidin färgning av de smala membran fiber cell i fasta embryon. Starkare bred-fiber cell märkning i linsmembran lokaliserade mApple transgenic tillåter levande visualisering av membran underdomäner men saknar den sutural konvergens.Posterior suturer kan visualiseras både in vitro och in vivo vid tre dagar efter befruktning. I ett ekvatorialplan, phalloidin etiketter starkt de yttre när fiberceller, avslöjar en tillplattad sexkantiga form. Phalloidin är utesluten från den komprimerade linskärnan och vild typ och mutant linsen ser omöjlig att skilja.Den starka märkningen av breda fiberceller i linsmembranlokaliserade mApple-mosaiker transgena avslöjar störningar i cellvolymen inom mutantlinsen. Som transgena uttryck inte begränsas av permeabilitet, vissa mosaiker avslöja lins kärnan märkning. Hos vilda typdjur börjar linskärnan närmare den främre linsstången under de tidiga utvecklingsstadier innan den centraliseras under vuxenlivet.Uttryck av grön-taggade proteiner i en transgena värd där cellmembranen fluorescer röd tillåter samtidig protein lokalisering samt bedömning av fiber cell morfologi in vivo. Zebrafiskar lämpar sig särskilt väl för in vivo-studier. Med hjälp av de verktyg som beskrivs här, kan vi sond lins mekanismer, till stor del studerade in vitro, i ett in vivo-system.

Research

JoVE Journal

Biology

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Lens Transplantation i Zebrafish och dess tillämpning i analysen av Eye Mutanter

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo elektroporering av Morpholinos i Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: proteinlokalisering Använda Photo-aktiverad lokalisering Mikroskopi och elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analys av LINE-1 retrotransposition på den inre Nucleus nivå

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Lins-gratis Video mikroskopi för dynamiskt och kvantitativ analys av fastsittande cellkultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studerar ribonucleotid införlivande: Strand-detektering av ribonukleotider i jäst genomet och mäta ribonucleotid-inducerad mutagenes

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Dissekera mekanoenzymatiska egenskaper hos processiva myosiner med ultrasnabb kraftklämspektroskopi

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Bedömning av tarmbarriärens integritet hos möss med användning av fluorescein-isotiocyanatmärkt dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Studying Protein Expression During Chicken Lens Development

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Investigating Lens Development and Function Through Microinjection of RCAS(A) Retrovirus in Embryonic Chicken Lens (Video) | JoVE

Mikroinjektion av rekombinant RCAS(A)-retrovirus i embryonal kycklinglins

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...