Name: tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses
Uploaded: 2019-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) منح ممسحة-130465 و PJT-156295 إلى SMMH. ويدعم المعهد جزئيا منحه الملكة اليزابيث الثانية للدراسات العليا في العلوم والتكنولوجيا من وزاره التدريب والكليات والجامعات في اونتاريو. وكان جيم حاصلا علي منحه الدراسات العليا من العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) من الكسندر غراهام بيل كندا.

وتتبع التجارب الموصوفة هنا بروتوكولات استخدام الماشية التي وافقت عليها الكيانات المؤسسية والتزمت بالمبادئ التوجيهية الوطنية الراسخة.
1. تلقيح الفئران C57BL/6 مع T Ag-التعبير عن الخلايا السرطانية
<ol><li>تنمو SV40 الخلايا الليفية المتحولة خط C57SV (أو مماثله TAg + خط الخلية ملتصقة)...

<ol>
	<li>Yewdell, J. W., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+in+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+T+lymphocyte+responses.">Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses.</a> Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+in+the+immunodominance+hierarchy+in+secondary+CD8++T+cell+responses+to+influenza+A+virus:+roles+for+cross-presentation+and+lysis-independent+immunodomination.">Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).</li><li>Otahal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+cross-presentation+limits+the+CD8++T+cell+response+to+a+subdominant+tumor+antigen+epitope.">Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope.</a> The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).</li><li>Lauron, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+induces+immunodomination+in+the+presence+of+viral+MHC+class+I+inhibition.">Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).</li><li>Crowe, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+presentation+regulates+the+changing+patterns+of+CD8++T+cell+immunodominance+in+primary+and+secondary+influenza+virus+infections.">Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).</li><li>Probst, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+of+an+antiviral+cytotoxic+T+cell+response+is+shaped+by+the+kinetics+of+viral+protein+expression.">Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression.</a> The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).</li><li>Gileadi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immunodominant+CTL+epitope+is+affected+by+proteasome+subunit+composition+and+stability+of+the+antigenic+protein.">Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein.</a> The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).</li><li>Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+proteasomes+function+to+increase+viral+peptide+diversity+and+broaden+antiviral+CD8++T+cell+responses.">Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses.</a> The Journal of Immunology. 191 (1), 52-59 (2013).</li><li>Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+affinity,+peptide+liberation,+T+cell+repertoire,+and+immunodominance+all+contribute+to+the+paucity+of+MHC+class+I-restricted+peptides+recognized+by+antiviral+CTL.">MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL.</a> The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).</li><li>Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinant+selection+of+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+antigenic+peptides+is+explained+by+class+I-peptide+affinity+and+is+strongly+influenced+by+nondominant+anchor+residues.">Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues.</a> The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).</li><li>Kotturi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+precursor+frequencies+and+MHC+binding+rather+than+the+degree+of+epitope+diversity+shape+CD8++T+cell+immunodominance.">Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance.</a> The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).</li><li>Haeryfar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+deoxynucleotidyl+transferase+establishes+and+broadens+antiviral+CD8++T+cell+immunodominance+hierarchies.">Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies.</a> The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).</li><li>Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+immunodominance+hierarchies+of+influenza+A+virus-specific+H-2(b)-restricted+CD8++T+cells+in+the+absence+of+terminal+deoxynucleotidyl+transferase.">Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase.</a> Immunological Investigations. 37 (7), 714-725 (2008).</li><li>Kedl, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+compete+for+access+to+antigen-bearing+antigen-presenting+cells.">T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).</li><li>Kastenmuller, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-competition+of+CD8++T+cells+shapes+the+immunodominance+hierarchy+during+boost+vaccination.">Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).</li><li>Memarnejadian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Promotes+Epitope+Spreading+in+Anticancer+CD8(+)+T+Cell+Responses+by+Preventing+Fratricidal+Death+of+Subdominant+Clones+To+Relieve+Immunodomination.">PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).</li><li>Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+CD8++T+cell+responses+induced+by+direct+priming+and+cross-priming+and+moderate+immunodominance+disparities.">Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities.</a> The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).</li><li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+immunodominant+antitumor+and+antiviral+CD8++T+cell+responses+by+indoleamine+2,3-dioxygenase.">Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase.</a> PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).</li><li>Maleki Vareki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+simultaneous+antitumor+and+alloreactive+CD8(+)+T-cell+responses+in+the+same+host+by+rapamycin.">Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin.</a> American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).</li><li>Irvine, K., Bennink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+immunodominance+hierarchies+in+TCD8++-mediated+antiviral+responses.">Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).</li><li>Grossmann, M. E., Davila, T., Celis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+tolerance+against+prostatic+antigens+with+subdominant+peptide+epitopes.">Avoiding tolerance against prostatic antigens with subdominant peptide epitopes.</a> Journal of Immunotherapy. 24 (3), 237-241 (2001).</li><li>Schreiber, H., Wu, T. H., Nachman, J., Kast, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+and+tumor+escape.">Immunodominance and tumor escape.</a> Seminars in Cancer Biology. 12 (1), 25-31 (2002).</li><li>Mylin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+CD8(+)+T-lymphocyte+responses+to+multiple+epitopes+from+simian+virus+40+(SV40)+large+T+antigen+in+C57BL/6+mice+immunized+with+SV40,+SV40+T-antigen-transformed+cells,+or+vaccinia+virus+recombinants+expressing+full-length+T+antigen+or+epitope+minigenes.">Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).</li><li>Fu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoplasmic+reticulum-targeting+signal+sequence+enhances+the+immunogenicity+of+an+immunorecessive+simian+virus+40+large+T+antigen+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope.">An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+of+CD8++T+cells+by+viral+and+tumor+antigens+is+a+robust+phenomenon.">Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon.</a> European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).</li><li>Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Alloantibody-Mediated+Cytotoxicity+In+Vivo.">Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo.</a> Transplantation. 100 (5), 1041-1051 (2016).</li><li>Aichele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+antigen+treatment+of+naive+and+virus-immune+mice:+antigen-specific+tolerance+versus+immunopathology.">Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology.</a> Immunity. 6 (5), 519-529 (1997).</li><li>Oehen, S., Brduscha-Riem, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+naive+CTL+to+effector+and+memory+CTL:+correlation+of+effector+function+with+phenotype+and+cell+division.">Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division.</a> The Journal of Immunology. 161 (10), 5338-5346 (1998).</li><li>Coles, R. M., Mueller, S. N., Heath, W. R., Carbone, F. R., Brooks, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+armed+CTL+from+draining+lymph+node+to+spleen+shortly+after+localized+infection+with+herpes+simplex+virus+1.">Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 834-838 (2002).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> The Journal of Immunology. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Meilleur, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+superantigens+expand+and+activate,+rather+than+delete+or+incapacitate,+preexisting+antigen-specific+memory+CD8++T+cells.">Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Goldszmid, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+charged+with+apoptotic+tumor+cells+induce+long-lived+protective+CD4++and+CD8++T+cell+immunity+against+B16+melanoma.">Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).</li><li>Oberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+or+mismatch+of+MHC+class+I+is+sufficient+to+trigger+NK+cell-mediated+rejection+of+resting+lymphocytes+in+vivo+-+role+of+KARAP/DAP12-dependent+and+-independent+pathways.">Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways.</a> European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).</li><li>Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+cytotoxicity+by+invariant+NKT+cells+in+vivo+is+CD95/CD178-dependent+and+is+correlated+with+antigenic+potency.">Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency.</a> The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).</li><li>Brinster, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+harboring+SV40+T-antigen+genes+develop+characteristic+brain+tumors.">Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors.</a> Cell. 37 (2), 367-379 (1984).</li><li>Tatum, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+targeting+a+single+immunodominant+epitope+are+sufficient+for+elimination+of+established+SV40+T+antigen-induced+brain+tumors.">CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors.</a> The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).</li><li>Schell, T. D., Tevethia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+advanced+choroid+plexus+tumors+in+SV40+T+antigen+transgenic+mice+following+priming+of+donor+CD8(+)+T+lymphocytes+by+the+endogenous+tumor+antigen.">Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen.</a> The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).</li><li>Greenberg, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+in+a+transgenic+mouse.">Prostate cancer in a transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).</li></ol>

المستندة إلى CFSE في اختبارات الخلوية الحيوية تقدم العديد من المزايا علي اختبارات القتل التقليدية مثل الكروم المشعة (51Cr) الإفراج والقياس اللوني لاكتات نازعه (ldh) الإفراج عن الاختبارات. أولا ، انها تسمح برصد وظيفة CTL داخل الجهاز اللمفاوي الثانوي سليمه معماريا.
ثانيا ، ان ?...

التقليديةCD8 + t الخلايا (tCD8) تلعب أجزاء هامه في مراقبه المناعة المضادة للسرطان. انها تعمل في المقام الأول في قدره الخلايا اللمفاوية T لحل (ctls) التي تعترف الأورام الببتيد المرتبطة أو المقترنة (الحثالة) المعروضة داخل الشق المغلقة من مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (mhc) الفئة الاولي الجزيئات. CTLs المسلحة بالبالكامل استخدام ترسانتها السامة للخلايا لتدمير الخلايا الخبيثة. يمكن الكشف عن السرطان TCD8 في الدورة الدموية أو حتى داخل الجماهير الابتدائية والمنتشرة من العديد من مرضي السرطان والحيوانية الحاملة للورم. ومع ذلك ، فانها غالبا ما تكون أنجيك أو استنفدت وتفشل في القضاء علي السرطان. ولذلك ، تم تصميم العديد من طرائق العلاج المناعي لزيادة المضادة للسرطان TCD8 الترددات واستعاده وتعزيز وظائفها.
البروتينات السرطانية الميناء العديد من الببتيدات ، وبعضها يمكن ان تكون مناعية ويحتمل ان تكون مناعية. ومع ذلك ، يتم استخلاصها الاستجاباتCD8 T قابله للقياس الكمي مع احجام متفاوتة ضد الببتيدات قليله فقط. هذا يخلق "التسلسل الهرمي المناعي" بين TCD8 استنساخ1. وفقا لذلك ، المناعية (ID) TCD8 تحتل الرتب الهرمية البارزة ، والتي يتم الحكم عاده من قبل وفره بهم. وعلي النقيض من ذلك ، فان خلايا TCD8 التي تكون مستقبلات الخلايا التائية (TCR) الخاصة بها محدده للفوقية المهيمنة (SD) التي تحدث في ترددات اقل. وقد حددنا نحن وغيرنا بعض العوامل التي تملي أو تشكل المناعة في استجابات TCD8 . وتشمل هذه ، من بين أمور أخرى ، طريقه تقديم ag إلى السذاجة TCD8 (اي ، العرض المباشر ، عبر العرض ، عبر خلع الملابس)2،3،4، ونوع من الخلايا تقديم ag (apcs) المشاركة في التنشيط TCD8 5، وفره واستقرار البروتين الحثالة6،7 وكفاءه وحركيه تدهورها من قبل بروتياسميس7،8، و الانتقائية النسبية للناقل المرتبطة تجهيز Ag (الحنفية) ل الببتيدات9، وتقارب الببتيدات المحررة لجزيئات mhc I9،10، وجود ، والترددات السلائف وتنوع TCR مشابه tCD8 in t الخلية تجمعات11،12،13، عبر المنافسة بين الخلايا t للوصول إلى apcs14،15، وقدره الاشقاء من tCD8 استنساخ16. الاضافه إلى ذلك ، يتم إخضاع TCD8 المناعي إلى أليات المناعية بوساطة عده أنواع الخلايا المثبطة مثل التي تحدث بشكل طبيعي t (nTreg) الخلايا17، والخلية سطح مشترك المثبطة المبرمجة الموت-1 (PD-1)16، وبعض الانزيمات داخل الخلايا مثل indoleamine 2 ، 3-ديوكسيجيناسي (IDO)18 والهدف الثدييات من راباميسين (mtor)19. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان العوامل المذكورة أعلاه لا تمثل دائما بشكل كامل للمناعة.
وبصرف النظر عن البيولوجيا الاساسيه لل TCD8 المناعي ، فان فحص هذه الظاهرة المثيرة للاهتمام له اثار هامه في علم المناعة السرطانية والعلاج المناعي. أولا ، لا تمنح حاله المعرف بالضرورة القدرة علي منع بدء الورم أو التقدم فيه بالقياس إلى TCD8 . سواء وكيف ID و SD TCD8 المساهمة في المناعة انتيورم قد تكون معتمده علي نوع ومدي الأورام الخبيثة والنظام التجريبي المستخدمة. الثانية, ويعتقد ان معرف رCD8 استنساخ قد تكون ' مرئية جدا ' للجهاز المناعي التالي أكثر عرضه لليات التسامح المركزية و/أو المحيطي16,21. ثالثا ، قد تحتوي الأورام الميتوزي علي خلايا الأورام السرطانية التي تتجنب الكشف من قبل العديد ، ان لم يكن معظم ، CTLs من خلال عرض طيف ضيق من الببتيد: المجمعات MHC. في ظل هذه الظروف, TCD8 الردود من اتساع غير كافيه من المرجح ان تحمل مثل هذه الخلايا السرطانية ميزه البقاء علي قيد الحياة, التالي تحفيز نموها22. وللاسباب المذكورة أعلاه ان العديد من رؤية المناعية كعقبه لنجاح التلقيح القائم عليCD8T والعلاجات ضد السرطان.
تلقيح الفئران C57BL/6 مع الفيروس simian 40 (SV40)-الخلايا المتحولة التي تعبر عن الورم الكبير ag (t ag) يوفر نظام سريري قوي لدراسة TCD8 المناعي. هذا النموذج يقدم العديد من الفوائد. أولا ، وتتميز بشكل جيد في هذا الضغط الفار الببتيد من هذا البروتين oncoproteinه ذات الصلة سريريا ( الجدول1). الثانية ، T Ag المربية ، والتي تسمي المواقع الأول والثاني/الثالث والرابع والخامس ، والزناد TCD8 الردود التي يتم ترتيبها باستمرار في ترتيب التسلسل الهرمي التالي: الموقع الرابع > > موقع I ≥ الموقع الثاني/الثالث > > الموقع خامسا. جبل الاستجابة الأكثر قوه ل T Ag. وعلي النقيض من ذلك ، فان الموقعين الأول والثاني/الثالث مهيمنان ، والمواقع V الخاصة بالCD8 الخاصة هي اقل وفره وعاده ما تكون قابله للكشف فقط في غياب الاستجابة لغيرها من المرتوب23،24. ثالثا ، TAg + خط الخلايا السرطانية المستخدمة في البروتوكول الموصوف هنا ، وهي الخلايا الليفية C57SV ، وتلك المستخدمة في التحقيقات السابقة لدينا16،17،18،19 ,25,26, حولت مع [سوبجنومي] SV40 شظايا25. ولذلك ، فهي غير قادره علي تجميع والإفراج عن SV40 virions التي يحتمل ان تصيب APCs المضيف. الاضافه إلى ذلك ، C57SV الخلايا خاليه من جزيئات الكلاسيكية كوستيمولاتوري مثل CD80 (b7-1) ، CD86 (b7-2) ، و CD137 يجند (4-1bbl)16. السمات المذكورة أعلاه جعل هذه الخطوط مثاليه للفحص في الجسم الCD8 T تنشيط عبر فتيله. عبر فتيله هو المسار الرئيسي في حمل TCD8 الاستجابات ، وخاصه تلك التي أطلقت ضد الخلايا السرطانية من أصل غير الدم التي تفشل في الخلايا الاوليه الساذجة مباشره25.
ويمكن رصد الترددات المضادة للورم TCD8 و/أو وظائف من قبل mhc I تترامير تلطيخ ، تلطيخ داخل الخلايا للتوكسينات المستجيب (علي سبيل المثال ، مضادات التداخل [ifn]-γ) أو جزيئات الليتيك (علي سبيل المثال ، تثقيب) ، والانزيمات المرتبطة المناعية (elispot) والسابقين اختبارات الخلوية الفيفو. منذ بدايتها في 1990s27,28, كاربوكسيفلوريسسين الناجحة استر (cfse)-مقرها في الجسم الحيوي قتل اختبارات مكنت تقييم الاستجابات السامة للخلايا بوساطة ctls المضادة للفيروسات29,30 , 31، المضادة للورم ctls16،32، الطبيعية القاتلة (ناغورني كاراباخ) الخلايا33، glycolipid-الثابتة التفاعلية القاتل الطبيعي T (inkt) الخلايا34، والموجودة مسبقا والخاصة بالمانحين محدده الأجسام المضادة26. ولذلك ، فان تطبيقاتها يمكن ان تكون ذات فائده لقراء واسعه ، بما في ذلك ولكن لا تقتصر علي المحققين العاملين في مجالات المناعة الأورام والعلاج المناعي ، والمناعة المضادة للمرض ، وتصميم اللقاح الوقائي والعلاجي.
لتقييم الخلايا الخلوية بوساطة في السيناريوهات النموذجية ، يتم تسميه اثنين من السكان من الخلايا الطحال الساذجة التي تعرض اما Ag غير ذي صله أو Ag (s) المدرك مع جرعتين مختلفتين من CFSE ، مختلطة في اعداد متساوية وحقنها في ساذج (السيطرة) أو القاتل الفئران التي تاوي الخلايا. بعد ذلك يتم فحص وجود/غياب كل السكان المستهدفين عن طريق قياس التدفق الخلوي.
لدينا الأمثل والعاملين في الجسم الحيوي قتل الاختبارات في دراساتنا علي المناعية في كل من المضادة للفيروسات ومضادات الأورام TCD8 الاستجابات12,16,17. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتقييم في وقت واحد من الهوية و SD TCD8 الردود علي الملحقات t Ag ، والتي يمكن اعتمادها بسهوله لتحقيقات مماثله في النظم التجريبية الأخرى. كما نقدم نتائج تمثيليه تبين ان استنزاف الخلايا nTreg و PD-1 الحصار يمكن ان تعزز بشكل انتقائي ID TCD8-و SD tCD8المستحثة للخلايا ، علي التوالي. وفي النهاية ، سنناقش المزايا المتعددة لاختبارات القتل المجرية فضلا عن بعض القيود المتاصله فيها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:872px;" width="871">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">25200-056</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFSE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-150</td>
			<td>Heat-inactivate prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock is 100X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2)</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0116-01</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone HRPN)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0088</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone TNP6A7)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG2a (clone 2A3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0089</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM final concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses

كاربوكسيفلوريسسين الناجحة استر (cfse)-مقرها في اختبارات الخلايا الحيوية تمكين الحساسية ودقه الكمية منCD8 + لحل T اللمفاويات (CTL) الاستجابات التي اثارتها ضد الببتيدات المشتقة من الورم والممرض. هم يقدمون عده فوائد علي تقليديه قتل اختبارات. أولا ، انها تسمح برصد السمية الخلوية بوساطة CTL داخل الاجهزه اللمفاوية الثانوية سليمه معماريا ، وعاده في الطحال. ثانيا ، انها تسمح للدراسات الميكانيكية خلال المراحل فتيله ، المستجيب والاستدعاء من الاستجابات CTL. ثالثا ، انها توفر منصات مفيده لاختبار فعاليه اللقاح/المخدرات في بيئة الجسم الخارجي حقا. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لفحص الاستجابات CTL المصاحبة ضد أكثر من واحد من مرضبه الببتيد من نموذج مستضد الورم (Ag) ، وهي الفيروس simian 40 (SV40)-ترميز كبير T Ag (T Ag). مثل معظم البروتينات السرطانية ذات الصلة سريريا, T Ag الموانئ العديد من الببتيدات المناعية المحتملة. ومع ذلك ، فقط أربعه الببتيدات هذه للحث علي الاستجابات CTL للكشف في C57BL/6 الفئران. يتم ترتيب هذه الاستجابات باستمرار في ترتيب هرمي استنادا إلى حجمها ، والذي يشكل الأساس ل TCD8 "المناعية" في هذا النظام القوي. ووفقا لذلك ، يتركز الجزء الأكبر من الاستجابة tCD8 الخاصة t Ag ضد واحده السمية المناعية في حين يتم التعرف علي الثلاثة الأخرى المربه والرد علي ضعيف فقط. المناعي يهدد اتساع الاستجابات المضادة للورم TCD8 وهو ، علي هذا النحو ، يعتبره الكثيرون عائقا امام نجاح التطعيم ضد السرطان. ولذلك ، فمن المهم ان نفهم العوامل الخلوية والجزيئية واليات التي تملي أو تشكل TCD8 امودومنيانسي. البروتوكول الذي وصفناه هنا مصمم خصيصا لتحقيق هذه الظاهرة في نموذج التمنيع T Ag ، ولكن يمكن تعديله بسهوله وتوسيعه ليشمل دراسات مماثله في نماذج الأورام الأخرى. ونحن نقدم أمثله عن كيفيه قياس تاثير التدخلات العلاجية المناعية التجريبية باستخدام في اختبارات الخلوية الحيوية.

وكان الهدف من التجربة التي صورت نتائجها في الشكل 1 لتحديد ما إذا كان وجود ووظائف خلايا nTreg شكل أو تغيير التسلسل الهرمي المناعي لل t Ag الخاصة tCD8. C57BL/6 تم حقن الفئران i.p. مع تلفزيوني أو مع 0.5 ملغ من المضادة لCD25 ماب (استنساخ PC-61.5.3 [PC61]) قبل أربعه أيام تلقوا 2 × 107 C57SV الخلاي?...

Watch this Scientific Journal Video about Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses at JoVE.com

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

الخياطة في فيفو الاختبارات الخلوية لدراسة المناعي في الأورام الخاصةCD8 + T الاستجابات الخلية

ونحن هنا وصف تدفق الخلوية التي تستند في الجسم الحيوي قتل الفحص الذي يتيح النظر في المناعية في الاستجابات اللمفاوية T السامة للخلايا (CTL) لنموذج مستضد الورم. ونحن نقدم أمثله علي كيفيه استخدام هذا الفحص الأنيق للدراسات الميكانيكية ولاختبار فعاليه المخدرات.

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية مقابل اثنين من epitopes الببتيد المتميزة من مستضدات الورم في وقت واحد. في طبيعة الجسم الحي من هذا الفحص يسمح لوظيفة السامة للخلايا من الخلايا التائية التي يمكن قياسها داخل العمارة سليمة من الجهاز اللمفاوي الثانوي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القتل الملاحظ هو انعكاس دقيق للعدد المطلق للخلايا التائية، وليس فقط تردداتها، التي يمكن أن تكون مضللة.هذا الفحص يتيح فحص استجابات الخلايا التائية السامة للخلايا لمستضدات الورم المناعية وشبه المهيمنة. ولذلك فهو يوفر معلومات قيمة عند تصميم لقاح، فضلا عن بروتوكولات العلاج المناعي للسرطان. وقد تم تصميم بروتوكول لدينا لدراسة ردود الخلية CD8 T.ومع ذلك، يمكن تعديلها لقياس السمية الخلوية التي تثيرها أنواع الخلايا القاتلة الأخرى، مثل خلايا NK واللمفاوية T الشبيهة بالفطرة. هذا الفحص يتطلب خبرة في تقنية معقمة, الماوس معالجة الأنسجة, الإعدادية الخلية المستهدفة, فضلا عن الخبرة في حقن الوريد الذيل. يحتاج المرء إلى اكتساب هذه المهارات قبل محاولة في قتل في الجسم الحي.مرة واحدة في T-antigen-الإيجابية أتباع خط الخلايا السرطانية أصبح التقاء تماما أو قليلا أكثر من التقاء, بلطف شطف monolayer مع عقيمة, PBS الحارة, وفصل الخلايا السرطانية مع 0.25٪ التربسين EDTA في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. اضغط على جوانب قارورة الثقافة عدة مرات لتحرير الخلايا المتبقية من أتباع، ووقف رد فعل بعد حوالي خمس دقائق مع إضافة خمسة ملليلترات من المتوسط DMEM. Pipette حل الخلية عدة مرات قبل تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر المسام في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من العقيمة، برنامج تلفزيوني الباردة لأول ثلاثة يغسل تحت نفس الظروف. بعد الغسيل الثالث، resuspend الخلايا في أربع مرات 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر من تركيز PBS العقيمة، وحقن 500 ميكرولترات من T-antigen إيجابية تعليق الخلايا داخل الصفاق في كل ستة إلى 12 أسبوعا C57 الأسود 6 المتلقي الماوس. لإعداد الطحال الهدف، ضع فأر المتبرع القتل الرحيم في الوضع المعرض، ورش الحيوان بالإيثانول بنسبة 70٪.باستخدام ملقط معقم ومقص، ورفع الجلد وجعل شق متوسط البطنية الصغيرة. قطع الجلد بطريقة تشبه الصليب لفضح الصفاق، واستخدام ملقط لسحب ما يصل الصفاق بطريقة خيمة مثل، دون اصطياد أي من الأعضاء الداخلية. قطع فتح الصفاق لفضح تجويف الصفاق، ونقل بلطف الطحال إلى 15 ملليلتر طاحونة الأنسجة Dounce تحتوي على خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم.استخدام المكبس لتطبيق الضغط اليدوي حتى يتبدد الأنسجة الزليني في تعليق خلية حمراء متجانسة، ونقل التجانس إلى أنبوب 15 ملليلتر. جمع تعليق من قبل الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في أربعة ملليلتر من كلوريد الامونيوم ليسين العازلة للقضاء على كريات الدم الحمراء. بعد أربع دقائق، وقف العملية مع ثمانية ملليلتر من المتوسط الكامل، وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر المسام في أنبوب جديد 50 ملليلتر.فصل خلايا الدم البيضاء من حطام خلايا الدم الحمراء عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في 12 ملليلتر من المتوسط الكامل. ثم تقسيم تعليق splenocyte إلى ثلاثة متساوية أربع ملليلتر aliquots. لترميز الببتيد من الطحال المستهدفة، نبض واحد جهينوسيتي aliquot مع ميكروموللار واحد من الببتيد غير ذي صلة، aliquot واحد مع ميكرومولار واحد من ببتيد الموقع الأول، و aliquot واحد مع ميكرومولار واحد من ببتيد الموقع الرابع لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الببتيد الزائد عن طريق الطرد المركزي وغسل الطحال الببتيد النبضية مرتين في 12 ملليلتر من PBS العقيمة والباردة لكل غسل لكل أنبوب. بعد الغسيل الثاني، إعادة تثبيت الخلايا في أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد ومعقم لكل أنبوب. إضافة 025، 0.25، وCFSE اثنين من micromolar في غير ذي صلة، الموقع الأول، والموقع الرابع الببتيد نبضي الطحال تعليق على التوالي.ضع الأنابيب عند درجة 37 مئوية لمدة 15 دقيقة مع انعكاس يدوي مرة واحدة كل خمس دقائق. في نهاية الحضانة، إضافة ثلاثة ملليلتر من مصل البقر الجنينية المعطل للحرارة إلى كل أنبوب لوقف رد فعل CFSE وجلب الحجم النهائي في كل أنبوب تصل إلى 15 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني. ثم جمع الخلايا التي تحمل علامة صبغ عن طريق الطرد المركزي لاثنين من يغسل في 12 ملليلتر من الطازجة، معقمة PBS لكل غسل.لتأكيد تسمية CFSE كافية من الطحال المستهدفة، resuspend بيليه في ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني وخلط مع دوامة لطيف. نقل 10 ميكرولترات من كل تعليق الخلية المسمى CFSE إلى فردي جولة خمسة ملليلتر أسفل بوليستيرين الفلورين تنشيط فرز الخلايا، أو أنبوب FACS، التي تحتوي على PBS، وتحميل الأنبوب على تدفق الجهاز الخلوي مجهزة ليزر 488 نانومتر. في برنامج جهاز قياس الخلايا التدفقي، قم بإنشاء بوابة الخلايا اللمفاوية استنادًا إلى خصائص التشتت الجانبي والتشتت الجانبي للخلايا قبل الحصول على 5000 حدث تقع ضمن بوابة الخلايا اللمفاوية في قناة Fluorescence 1.ضمن السكان الأم CFSE إيجابية، رسم بوابات رسم بياني إضافية لتحديد الفئات الفرعية CFSE-المنخفضة، CFSE المتوسطة، وCFSE-عالية. ثم تأكيد عدد الحدث على قدم المساواة أو شبه متساوية داخل البوابات الثلاث لأنابيب اثنين آخرين من الخلايا المسماة. لحقن الخلايا المستهدفة، دوامة البداية بلطف أنابيب المصدر وتجمع ثلاثة تعليق الخلايا المسمى CFSE في أنبوب جديد بنسب متساوية.أعلى محتويات أنبوب مع برنامج تلفزيوني عقيمة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي للعد. ثم ضبط وحدة التخزين إلى 10 مرات واحدة إلى الخلايا المستهدفة المختلطة السبع لكل 200 ميكرولتر من PBS لكل تركيز المتلقي ، وحقن 200 وحدة تخزين ميكرولتر من تعليق الخلية في الوريد الذيل لكل مستلم C57 الأسود 6 الماوس. بعد ساعتين أو أربع ساعات من الحقن ، وإزالة ومعالجة الطحال من كل المتلقي كما هو موضح ، وإعادة ربط خلايا الدم البيضاء المعزولة في ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لكل طحال.نقل ما يقرب من واحد مرات 10 إلى الخلايا السبع من كل طحال المعالجة في أنبوب FACS نظيفة، وتشغيل الخلايا على الفور على مقياس تدفق الخلايا كما هو موضح لبوابة مجموعات الخلايا المستهدفة CFSE منخفضة، وسيطة، وعالية الهدف. ثم الحصول على ما مجموعه 2،000 الأحداث CFSE المنخفضة في قناة Fluorescence 1، وحساب تحلل محددة من كل مجموعة الخلايا المستهدفة cognate وفقا للصيغة مفصلة في النص. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تأكيد نجاح استنفاد الخلايا التائية التنظيمية التي تحدث بشكل طبيعي في الفئران المحقونة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة CD25 بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة.وكما هو متوقع، يمكن اكتشاف قمم شبه متساوية تقابل الخلايا المستهدفة الخاضعة للمراقبة والخلايا المستهدفة في الفئران الساذجة. وعلى النقيض من ذلك، كانت الخلايا المستهدفة التي تعرض الموقع IV غائبة تمامًا تقريبًا في الفئران المُعدّة لـ T-antigen، بغض النظر عن علاجها السابق بالأجسام المضادة أحادية النسيلة CD25 أو PBS. ومن المثير للاهتمام، التي تحدث بشكل طبيعي T ريج استنزاف الخلايا المضادة لـ CD25 أحادية النسيلة المعززة في الجسم المضاد للخلايا ال vivo T-lymphocyte-تحلل الخلايا المستهدفة الموقع-I-نبض.في هذا التحقيق التمثيلي الثاني ، برمجت الموت 1 الحصار تعزيز السيطرة دون المهيمنة CD8 إيجابية T الخلية مواقع واحدة واثنين من خفض ثلاثة ردود محددة ، مما يشير إلى أن التدخل في الموت المبرمج 1 / مبرمجة التفاعلات ligand الموت 1 قد تحفز epitope انتشار في المضادة للسرطان CD8 إيجابية ردود الخلية T. من المهم للغاية عند وضع علامة على الخلايا المانحة باستخدام CFSE ، تأكد من دقة تركيزاتك. وإلا فإن هذا قد يؤدي إلى تداخل قمم الرسم البياني، مما يجعل الحسابات المطلوبة وتفسير البيانات صعبة، إن لم يكن مستحيلا.سيكون من المهم لتحسين في vivo cytotoxicity المقايسة لتحديد وظائف المفعول التي أثارها مختلف أنواع الخلايا القاتلة التي تعترف مستضدات الببتيد وغير الببتيد في نفس المضيف.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي<em&gt; في الجسم الحي</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

وصف الاستجابات ايستب الغلوبولين المناعي تعتمد على الغدة الصعترية، والغدة الصعترية مستقلة في الفئران باستخدام مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

محسن انترفيرون-غاما السبت المقايسة لاستجابات الخلية تي التدبير في نموذج خنزير غينيا بعد التطعيم

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...