Name: tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses
Uploaded: 2019-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den kanadischen Instituten of Health Research (CIHR) unterstützt, die MOP-130465 und PJT-156295 an SMMH vergeben. JC wird teilweise von einem Queen Elizabeth II Graduate Stipendium in Wissenschaft und Technologie des Ministeriums für Ausbildung, Hochschulen und Universitäten in Ontario unterstützt. CEM erhielt ein Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship (doctoral) von Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

Die hier beschriebenen Experimente folgen Tierverbrauchsprotokollen, die von institutionellen Stellen genehmigt wurden und sich an die festgelegten nationalen Richtlinien hielten.
1. Inoculation von C57BL-6 Mäusen mit T Ag-ausdrückenden Tumorzellen
<ol><li>Die SV40-verwandelte Fibrosarko-Zelllinie C57SV (oder eine ähnliche T Ag+ anhaftende Zelllinie) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 4,5 g/L D-Glukose und L-Glutamin (1x) und ergänzt mit 1 mM-Sodiumpyruvat und ...

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	<li>Yewdell, J. W., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+in+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+T+lymphocyte+responses.">Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses.</a> Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+in+the+immunodominance+hierarchy+in+secondary+CD8++T+cell+responses+to+influenza+A+virus:+roles+for+cross-presentation+and+lysis-independent+immunodomination.">Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).</li><li>Otahal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+cross-presentation+limits+the+CD8++T+cell+response+to+a+subdominant+tumor+antigen+epitope.">Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope.</a> The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).</li><li>Lauron, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+induces+immunodomination+in+the+presence+of+viral+MHC+class+I+inhibition.">Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).</li><li>Crowe, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+presentation+regulates+the+changing+patterns+of+CD8++T+cell+immunodominance+in+primary+and+secondary+influenza+virus+infections.">Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).</li><li>Probst, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+of+an+antiviral+cytotoxic+T+cell+response+is+shaped+by+the+kinetics+of+viral+protein+expression.">Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression.</a> The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).</li><li>Gileadi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immunodominant+CTL+epitope+is+affected+by+proteasome+subunit+composition+and+stability+of+the+antigenic+protein.">Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein.</a> The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).</li><li>Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+affinity,+peptide+liberation,+T+cell+repertoire,+and+immunodominance+all+contribute+to+the+paucity+of+MHC+class+I-restricted+peptides+recognized+by+antiviral+CTL.">MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL.</a> The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).</li><li>Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinant+selection+of+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+antigenic+peptides+is+explained+by+class+I-peptide+affinity+and+is+strongly+influenced+by+nondominant+anchor+residues.">Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues.</a> The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).</li><li>Kotturi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+precursor+frequencies+and+MHC+binding+rather+than+the+degree+of+epitope+diversity+shape+CD8++T+cell+immunodominance.">Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance.</a> The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).</li><li>Haeryfar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+deoxynucleotidyl+transferase+establishes+and+broadens+antiviral+CD8++T+cell+immunodominance+hierarchies.">Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies.</a> The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).</li><li>Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+compete+for+access+to+antigen-bearing+antigen-presenting+cells.">T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).</li><li>Kastenmuller, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-competition+of+CD8++T+cells+shapes+the+immunodominance+hierarchy+during+boost+vaccination.">Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).</li><li>Memarnejadian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Promotes+Epitope+Spreading+in+Anticancer+CD8(+)+T+Cell+Responses+by+Preventing+Fratricidal+Death+of+Subdominant+Clones+To+Relieve+Immunodomination.">PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).</li><li>Haeryfar, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+CD8(+)+T-lymphocyte+responses+to+multiple+epitopes+from+simian+virus+40+(SV40)+large+T+antigen+in+C57BL/6+mice+immunized+with+SV40,+SV40+T-antigen-transformed+cells,+or+vaccinia+virus+recombinants+expressing+full-length+T+antigen+or+epitope+minigenes.">Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).</li><li>Fu, T. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+superantigens+expand+and+activate,+rather+than+delete+or+incapacitate,+preexisting+antigen-specific+memory+CD8++T+cells.">Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Goldszmid, R. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+harboring+SV40+T-antigen+genes+develop+characteristic+brain+tumors.">Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors.</a> Cell. 37 (2), 367-379 (1984).</li><li>Tatum, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+targeting+a+single+immunodominant+epitope+are+sufficient+for+elimination+of+established+SV40+T+antigen-induced+brain+tumors.">CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors.</a> The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).</li><li>Schell, T. D., Tevethia, S. 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CFSE-basierte in vivo Cytotoxicity-Assays bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Tötungsuntersuchungen wie radioaktives Chrom (51Cr)-Freisetzung und farbimetrisches Laktat-Dehydrie-Dehydrogenase (LDH). Zunächst erlauben sie die Überwachung der CTL-Funktion innerhalb eines architektonisch intakten sekundären Lymphorgan.
Zweitens spiegelt die spezifische Tötung von Zielzellen in vivo zytotoxicity Assays die absolute Anzahl der Ag-spezifischen TCD8 wider, die...

Herkömmliche CD8+ T-Zellen (TCD8) spielen wichtige Rollen in der antikantikanten Immunüberwachung. Sie funktionieren in erster Linie in der Kapazität von zytolytischen T-Lymphozyten (CTLs), die tumorspezifische oder-assoziierte Peptid-Antigene (Ags) erkennen, die innerhalb der geschlossenen Spalte der großen Histokompatibilitätskomplexen (MHC)-Klasse-I-Moleküle angezeigt werden. Voll bewaffnete CTLs nutzen ihr zytotoxisches Arsenal, um bösartige Zellen zu zerstören. Der Antikörper TCD8 kann im Kreislauf oder sogar in primären und metastasierenden Massen vieler Krebspatienten und tumortragenden Tieren nachgewiesen werden. Sie sind jedoch oft anergisch oder erschöpft und versäumen es, Krebs auszurotten. Daher sind viele immuntherapeutische Modalitäten so konzipiert, dass sie die T-CD8 -Frequenzen erhöhen und ihre Funktionen wiederherstellen und steigern.
Tumorproteine beherbergen viele Peptide, von denen einige immunogen und potenziell immunoprotektiv sein können. Allerdings werden quantifizierbare T CD8-Antworten mit unterschiedlichen Größenordnungen nur gegen wenige Peptide ausgelöst. Dadurch entsteht eine "Immunodominanz-Hierarchie" unter TCD8 Klonen1. Dementsprechend besetzen die immunodominanten (ID)T CD8 prominente hierarchische Ränge, die gemeinhin an ihrer Fülle gemessen werden. Im Gegensatz dazu treten T-CD8-Zellen, deren T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für subdominante (SD)-Epitope ist, in niedrigeren Frequenzen auf. Wir und andere haben einige der Faktoren identifiziert, die die Immunodominanz in den T-CD8-Reaktionen diktieren oder formen. Dazu gehören unter anderem der Modus der GB-Präsentation zu naivem TCD8 (z.B. direkte Präsentation, Cross-Präsentation, Cross-Dressing)2,3, 4,dieArt der Ag-präsentierenden Zellen (APCs) Die Teilnahme ander T CD8-Aktivierung5, die Fülle undStabilität des ProteinsAgs 6,7und die Effizienz und Kinetik ihrer Degradierung durch Proteasome 7,8,die Die relative Selektivität des Transporters, der mit der API-Verarbeitung (TAP) fürPeptide 9 verbunden ist, die Affinität der befreiten Peptide für MHC-I-Moleküle9, 10,die Anwesenheit, Vorläuferfrequenzen und die TCR-Vielfalt von CognateT CD8 in T-Zellpools 11,12, 13,Konkurrenzzwischen T-Zellen für den Zugang zu APCs14,15und die Bruderkapazität von T CD8 Klone16. Darüber hinaus wird die T CD8-Immunominanz von mehreren Suppressorzelltypen vermittelt, wie zum Beispiel den natürlich vorkommenden regulatorischen T (nTreg) Zellen17, dem koinhibitorischen Molekül der Zelloberfläche, programmiert Todes-1 (PD-1) 16, und bestimmte intrazelluläre Enzyme wie Indoleamin 2,3 Dioxygenase (IDO)18 und das Säugetierziel von Rapamycin (mTOR)19. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die oben genannten Faktoren nicht immer vollständig für die Immunominanz verantwortlich sind.
Neben der Grundbiologie der TCD8 -Immunodominanz hat die Untersuchung dieses faszinierenden Phänomens wichtige Auswirkungen auf die Krebs-Immunologie und Immuntherapie. Erstens verleiht ein ID-Status nicht unbedingt einem gegebenen T-CD8-Klon die Fähigkeit, Tumorinitiation oder Progression20zu verhindern. Ob und wie ID und SD TCD8 zur Antitumorimmunität beitragen, kann von der Art und dem Ausmaß der Bösartigkeit und dem verwendeten Versuchssystem abhängen. Zweitens wird angenommen, dass ID-T CD8-Klonefür das Immunsystem "zu sichtbar" sein können und daher anfälliger für zentrale and/oder periphere Toleranzmechanismen 16,21. Drittens können heterogene Tumoren neoplastische Zellen enthalten, die die Erkennung durch viele, wenn nicht sogar die meisten CTLs vermeiden, indem sie nur ein schmales Spektrum von Peptid-Komplexen anzeigen: MHC-Komplexe. Unter diesen Umständen dürften TCD8 -Reaktionen in unzureichender Breite solchen Tumorzellen einen Überlebensvorteil verschaffen und so ihr Auswachsen steigern 22. Aus den oben genannten Gründen sehen viele die Immunominanz als Hürde für eine erfolgreiche T-CD8-basierte Impfung und Therapie gegen Krebs.
Die Inokulation von C57BLACH 6 Mäuse mit Silavirus 40 (SV40)-transformierte Zellen, die großen Tumor Ag (T Ag) ausdrücken, bietet ein leistungsfähiges präklinisches System, um T CD8-Immunmodulare zu untersuchen. Dieses Modell bietet mehrere Vorteile. Zunächst sind die Peptid-Epitope dieses klinisch relevanten Onkoproteins in diesem Maus-Stamm23 gut charakterisiert (Tabelle 1). Zweitens, T Ag Epitope, die Standorte I, II/III, IV und V, Trigger TCD8 Antworten, die konsequent in der folgenden hierarchischen Reihenfolge angeordnet sind: Website IV > > Website I, Website I, Website > Website V> I. mounten Sie die robusteste Reaktion auf T Ag. Im Gegensatz dazu sind die Standorte I und II/III subdominant, und die standortV-spezifischen TCD8 sind am wenigsten vorhanden und in der Regel nur in Ermangelung der Reaktionsfähigkeitauf andere Epitope 23,24nachweisbar. Drittens, die T Ag+ Tumorzelllinie, die in dem hier beschriebenen Protokoll verwendet wird, nämlich die C57SV Fibrosarkom-Zellen,und die, die in unseren vorherigen Untersuchungen 16,17, 18,19verwendetwurden. ,25,26, werdenmit subgenomischen SV40-Fragmenten 25 verwandelt. Daher sind sie nicht in der Lage, SV40-Virions zu montieren und freizugeben, die möglicherweise Host-APCs infizieren könnten. Darüber hinaus sind die C57SV-Zellen frei von klassischen Costimulationsmolekülen wie CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) und CD137 ligand (4-1BBL)16. Die obigen Attribute machen diese Linien ideal für die Untersuchung der In-vivoT CD8-Aktivierung durch Cross-Priming. Cross-Priming ist ein wichtiger Weg, um TCD8 -Reaktionen zu induzieren, vor allem jene, die gegen Tumorzellen nichthämatopoetischen Ursprungs gestartet werden, die es nicht direktversäumen, die naiven T-Zellen direkt zu unterstützen.
Antitumor TCD8 Frequenzen and/oder Funktionen können durch MHC I Tetramer-Färbung überwacht werden, Intrazelluläre Färbung für Effektzytokine (z.B. Interferon [IFN]--oder lytische Moleküle (z.B. Perforin), enzymgebundene Immunospots (ELISpot) und Ex-Untersuchungen vivo zytotoxicity Assays. Seit ihrer Gründung in den 1990er Jahren von27, 28 Jahrenermöglichte Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) auf vivo-Totoring-Assays die Auswertung von zytotoxischen Reaktionen, die durch antivirale CTLs 29,30vermittelt wurden. , 31, Antitumor CTLs 16,32,Naturkiller (NK)Zellen 33, glykolipid-reaktive invariante Naturkiller T(iNKT) Zellen 34, und bereits vorhanden und de novo donor-spezifisch Legantikörper26. Daher können ihre Anwendungen für eine breite Leserschaft von Interesse sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Forscher, die in den Bereichen Tumorimmunologie und Immuntherapie, Anti-Erreger-Immunität und präventiven und therapeutischen Impfstoff-Design arbeiten.
Um die zellvermittelte Zytotoxizität in typischen Szenarien zu beurteilen, werden zwei Populationen naiver Splenozyten, die entweder eine irrelevante Ag oder ein kognates Ag (s) aufweisen, mit zwei verschiedenen Dosen CFSE gekennzeichnet, in gleicher Zahl gemischt und in naive (Kontrolle) oder Killer injiziert. Zellgehärtete Mäuse. Die Voraussetzung für das Fehlen jeder Zielpopulation wird dann durch die Strömungszytometrie untersucht.
Wir haben in unseren Studien zur Immunodominanz in antiviralen und antitumororartigen TCD8-Reaktionen 12,16, 17optimiert und in vivo-Tötungsuntersuchungeneingesetzt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur gleichzeitigen Bewertung von ID-und SD T CD8-Antworten auf T Ag-Epitope zur Verfügung, das für ähnliche Untersuchungen in anderen Versuchssystemen problemlos übernommen werden kann. Darüber hinaus liefern wir repräsentative Ergebnisse, die zeigen, dass die NTreg-Zellabnahme und die PD-1-Blockade die ID-T-CD8-bzw. die SD-T-CD8-induzierte Zytotoxizität selektiv verbessern können. Am Ende werden wir mehrere Vorteile von in vivo Tötungsuntersuchungen sowie einige ihrer inhärenten Einschränkungen zu diskutieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:872px;" width="871">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">25200-056</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFSE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-150</td>
			<td>Heat-inactivate prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock is 100X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2)</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0116-01</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone HRPN)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0088</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone TNP6A7)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG2a (clone 2A3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0089</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM final concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses

Carboxyfluorescein suinimidyl ester (CFSE) auf Basis von vivo zytotoxicity-Assays ermöglichen eine sensible und genaue Quantifizierung von CD8+ zytolytischen T-Lymphozyten (CTL), die gegen Tumor-und pathogene Peptide ausgelöst werden. Sie bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Tötungsuntersuchungen. Erstens erlauben sie die Überwachung der CTL-vermittelten Zytotoxizität innerhalb architektonisch intakter sekundärer Lymphorgane, typischerweise in der Milz. Zweitens ermöglichen sie mechanistische Studien während der Grundide-, Wirkungs-und Rückrufungsphasen der CTL-Reaktionen. Drittens bieten sie nützliche Plattformen für Impfungen bei der Wirksamkeit von Medikamenten in einer wahrhaft in vivo-Umgebung. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung von begleiteten CTL-Antworten gegen mehr als ein Peptid-Ept eines Modelltumorantigen (Ag) zur Verfügung, nämlich das simianische Virus 40 (SV40)-kodiert großes T Ag (T Ag). Wie die meisten anderen klinisch relevanten Tumorproteine beherbergt T Ag viele potenziell immunogene Peptide. Allerdings führen nur vier solcher Peptide zu nachweisbaren CTL-Antworten bei C57BL-6-Mäusen. Diese Reaktionen sind konsequent in einer hierarchischen Reihenfolge angeordnet, die auf ihrer Größe basiert und die Grundlage für die "Immunodominanz" TCD8 in diesem mächtigen System bildet. Dementsprechend konzentriert sich der Großteil der T-Ag-spezifischen T CD8-Reaktion auf ein einzelnes immunominantes Epiope, während die anderen drei Epitope erkannt werden und nur schwach reagieren. Die Immunominanz beeinträchtigt die Breite der Antitumor-T-CD8-Reaktionen und wird als solche von vielen als Hindernis für eine erfolgreiche Impfung gegen Krebs angesehen. Daher ist es wichtig, die zellulären und molekularen Faktoren und Mechanismen zu verstehen, die die TCD8 -Immunodominanz diktieren oder formen. Das Protokoll, das wir hier beschreiben, ist auf die Untersuchung dieses Phänomens im T Ag-Immunisierungsmodell zugeschnitten, kann aber leicht modifiziert und auf ähnliche Studien in anderen Tumormodellen ausgeweitet werden. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie die Auswirkungen experimenteller immuntherapeutischer Eingriffe mit Hilfe von vivo Zytotoxizitätsuntersuchungen gemessen werden können.

Ziel des Experiments, dessen Ergebnisse in Abbildung 1 abgebildet sind, war es, festzustellen, ob die Präsenz und die Funktionen von nTreg-Zellen die Immunodominanz-Hierarchie von T Ag-spezifischem TCD8formen oder verändern. C57BL/6 Mäuse wurden vier Tage vor dem Erhalt von 2 x 10 7 C57SV-Tumorzellen i.p. mit PBS oder mit 0,5 mg eines Anti-CD25 mAb (Klon PC- 61.5.3 [PC61]) injiziert. In separaten Experimenten wurde anstelle von PBS eine Ratte IgG1-Isotypenkontrolle e...

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Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Dieser Assay kann verwendet werden, um T-Zell-vermittelte Zytotoxizität gegen zwei unterschiedliche Peptid-Epitope von Tumorantigenen gleichzeitig zu quantifizieren. Die in vivo Natur dieses Assays ermöglicht es, die zytotoxische Funktion von T-Zellen innerhalb der intakten Architektur eines sekundären Lymphorgans zu messen. Darüber hinaus ist die beobachtete Tötung eine genaue Widerspiegelung der absoluten Anzahl von T-Zellen, und nicht nur ihrer Frequenzen, die irreführend sein können.Dieser Test ermöglicht die Untersuchung von zytotoxischen T-Zell-Antworten auf immundominante und subdominante Tumorantigene. Es liefert daher wertvolle Informationen, wenn Sie einen Impfstoff entwerfen, sowie immuntherapeutische Protokolle für Krebs. Unser Protokoll wurde auf die Untersuchung von CD8 T-Zellreaktionen zugeschnitten.Es kann jedoch modifiziert werden, um die Zytotoxizität zu messen, die von anderen Killerzelltypen wie NK-Zellen und angeborenen T-Lymphozyten ausgelöst wird. Dieser Test erfordert Erfahrung in der aseptischen Technik, Mausgewebehandhabung, Zielzellvorbereitung, sowie Expertise in Schwanzveneninjektionen. Man muss diese Fertigkeit erwerben, bevor man den in vivo Töten assay versucht.Sobald die T-Antigen-positive anhängliche Tumorzelllinie vollständig konfluent oder leicht überflussend geworden ist, spülen Sie die Monoschicht vorsichtig mit sterilem, warmem PBS ab und lösen Sie die Tumorzellen mit 0,25% Trypsin EDTA in einem Biosicherheitsschrank. Tippen Sie mehrmals auf die Seiten des Kulturkolbens, um die verbleibenden haftenden Zellen freizusetzen, und stoppen Sie die Reaktion nach etwa fünf Minuten mit der Zugabe von fünf MilliliterDM-Medium. Pipette die Zelllösung ein paar Mal vor der Filterung der Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Porenzellsieb in eine 50-Milliliter konische Röhre.Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter sterilen, kalten PBS für die erste von drei Wärzahlen unter den gleichen Bedingungen. Nach der dritten Wäsche die Zellen viermal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter steriler PBS-Konzentration wieder aussetzen und 500 Mikroliter der T-Antigen-positiven Tumorzellsuspension intraperitoneal in jeden sechs bis 12 Wochen alten C57 Black 6-Mausempfänger injizieren. Für die Ziel-Splenozyten-Präparation die eingeschläferte Spendermaus in die anfällige Position bringen und das Tier mit 70% Ethanol besprühen.Mit sterilen Zangen und Scheren, heben Sie die Haut und machen einen kleinen ventralen Mittellinienschnitt. Schneiden Sie die Haut kreuzweise, um das Peritoneum freizulegen, und verwenden Sie die Zange, um das Peritoneum in einer zeltartigen Art und Weise hochzuziehen, ohne eines der inneren Organe zu fangen. Schneiden Sie das Peritoneum auf, um die Peritonealhöhle freizulegen, und übertragen Sie die Milz vorsichtig auf einen 15-Milliliter-Dounce-Gewebeschleifer, der fünf Milliliter steriles PBS enthält.Verwenden Sie den Kolben, um manuellen Druck auszuüben, bis sich das Milzgewebe in eine rote homogene Zellsuspension zerstreut, und übertragen Sie das Homogenat in ein 15-Milliliter-Rohr. Sammeln Sie die Suspension durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in vier Milliliter Ammoniumchlorid Kaliumlysinpuffer, um die Erythrozyten zu beseitigen. Nach vier Minuten den Prozess mit acht Millilitern komplettem Medium beenden und die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Porenzellsieb in ein neues 50-Milliliter-Rohr filtern.Trennen Sie die weißen Blutkörperchen von den roten Blutkörperchen durch Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in 12 Milliliter des vollständigen Mediums wieder auf. Dann teilen Sie die Splenozytensuspension in drei gleiche Vier-Milliliter-Aliquots. Für die Peptidkodierung der Zielsplenozyten, Puls ein Splenocyte aliquot mit einem Mikromolaren irrelevanten Peptid, ein Aliquot mit einem Mikromolar von Site I Peptid, und ein Aliquot mit einem Mikromolar der Site IV Peptid für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5%Kohlendioxid.Am Ende der Inkubation das überschüssige Peptid durch Zentrifugation entfernen und die Peptid-gepulsten Splenozyten zweimal in 12 Milliliter steriler, kalter PBS pro Waschleitung waschen. Nach der zweiten Wäsche die Zellen in vier Millilitern frischer, steriler PBS pro Tube wieder aussetzen. Fügen Sie 025, 0.25 und zweimikromolare CFSE in die irrelevanten, Site I- und Site IV-Peptid-gepulsten Splenozytensuspensionen hinzu.Legen Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten mit manueller Inversion einmal alle fünf Minuten. Am Ende der Inkubation drei Milliliter wärmeinaktiviertes fetales Rinderserum in jedes Rohr geben, um die CFSE-Reaktion zu stoppen und das Endvolumen in jeder Röhre mit PBS auf 15 Milliliter zu bringen. Dann sammeln Sie die farbstoffmarkierten Zellen durch Zentrifugation für zwei Wäschen in 12 Milliliter frische, sterile PBS pro Wäsche.Um eine adäquate CFSE-Kennzeichnung der Zielsplenozyten zu bestätigen, setzen Sie das Pellet in drei Milliliter PBS wieder auf und mischen Sie es mit sanftem Wirbel. Übertragen Sie 10 Mikroliter aus jeder CFSE-beschrifteten Zellsuspension in eine einzelne fünf Milliliter runde Polystyrolfluoreszenz-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder FACS-Röhre, die PBS enthält, und laden Sie das Rohr auf ein Durchflusszytometer, das mit einem 488-Nanometer-Laser ausgestattet ist. Erstellen Sie in der Durchflusszytometer-Software ein Lymphozytentor basierend auf den vorwärtsstreuenden und seitlichen Streueigenschaften der Zellen, bevor Sie 5.000 Ereignisse erfassen, die innerhalb des Lymphozytentors im Fluoreszenz-1-Kanal liegen.Ziehen Sie innerhalb der übergeordneten CFSE-positiven Population zusätzliche Histogramm-Gates, um die CFSE-niedrigen, CFSE-Zwischen- und CFSE-hohen Subpopulationen zu identifizieren. Bestätigen Sie dann eine gleiche oder eine nahezu gleiche Ereigniszahl innerhalb der drei Tore für die beiden anderen Röhren beschrifteter Zellen. Zur Injektion der Zielzellen zunächst die Quellrohre sanft wirbeln und die drei CFSE-beschrifteten Zellsuspensionen in gleichem Verhältnis in ein neues Rohr bündeln.Den Rohrinhalt mit sterilem PBS aufladen und die Zellen durch Zentrifugation zum Zählen sammeln. Passen Sie dann das Volumen auf ein mal 10 auf die sieben gemischten Zielzellen pro 200 Mikroliter PBS pro Empfängerkonzentration an und injizieren Sie 200 Mikroliter Volumen der Zellsuspension in die Schwanzvene jeder Empfänger-C57 Black 6-Maus. Zwei oder vier Stunden nach der Injektion entfernen und verarbeiten Sie die Milz jedes Empfängertiers wie gezeigt, und setzen Sie die isolierten weißen Blutkörperchen in drei Milliliter PBS pro Milz wieder aus.Übertragen Sie etwa ein mal 10 auf die sieben Zellen von jeder verarbeiteten Milz in ein sauberes FACS-Rohr, und führen Sie die Zellen sofort auf dem Durchflusszytometer aus, wie gezeigt, um die CFSE-niedrigen, mittleren und hohen Zielzellpopulationen zu begehen. Erfassen Sie dann insgesamt 2.000 CFSE-niedrige Ereignisse im Fluoreszenz-1-Kanal und berechnen Sie die spezifische Lyse jeder Cognate-Zielzellpopulation gemäß der im Text beschriebenen Formel. In diesem repräsentativen Experiment wurde der Erfolg der Erschöpfung natürlich vorkommender regulatorischer T-Zellen bei Mäusen, die mit monoklonalen Anti-CD25-Antikörpern injiziert wurden, durch Durchflusszytometrie bestätigt.Wie erwartet, waren nahezu gleiche Spitzen, die den Kontroll- und Kognate-Zielzellen entsprachen, bei naiven Mäusen nachweisbar. Im Gegensatz dazu fehlten Site-IV-Anzeige-Zielzellen bei T-Antigen-primed-Mäusen fast vollständig, unabhängig von ihrer vorherigen Behandlung mit anti-CD25 monoklonalen Antikörpern oder PBS. Interessanterweise, natürlich vorkommende T reg Zellerschöpfung durch Anti-CD25 monoklonalen Antikörper augmented in vivo cytotoxische T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von Site-I-gepulsten Zielzellen.In dieser zweiten repräsentativen Untersuchung verstärkte programmierte Todesblockade 1 die subdominanten CD8-positiven T-Zellenstandorte ein- und zwei-schräg-drei-spezifische Reaktionen, was darauf hindeutet, dass die Störung des programmierten Todes 1/programmierter Todesliganden-1-Wechselwirkungen zu epitopischer Ausbreitung in Anti-Krebs-CD8-positiven T-Zellreaktionen führen kann. Es ist wichtig, wenn Sie Ihre Spenderzellen mit CFSE kennzeichnen, stellen Sie sicher, dass Ihre Konzentrationen präzise sind. Andernfalls kann dies zu überlappenden Histogrammspitzen führen, die Ihre erforderlichen Berechnungen und Dateninterpretationen erschweren, wenn nicht gar unmöglich machen.Es wird wichtig sein, In-vivo-Zytotoxizitätstests zu optimieren, um Effektorfunktionen zu quantifizieren, die von verschiedenen Killerzelltypen ausgelöst werden, die Peptid- und Nicht-Peptid-Antigene im selben Wirt erkennen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten<em&gt; In-vivo-</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...