Name: tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses
Uploaded: 2019-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הקנדיים של מחקר הבריאות (CIHR) מענקים מגב-130465 ו PJT-156295 כדי SMMH. JC נתמך באופן חלקי על ידי המלכה אליזבת השנייה בוגרת מלגה במדע וטכנולוגיה ממשרד ההדרכה של אונטריו, מכללות ואוניברסיטאות. צ'ם היה מקבל מלגה מאוניברסיטת מדעי הטבע וההנדסה של מדינת קנדה (מחקר דוקטורט) של אלכסנדר גרהם בל קנדה.

הניסויים המתוארים כאן משתמשים בפרוטוקולי השימוש בבעלי חיים שאושרו על-ידי גופים מוסדיים ומבוססים על ההנחיות הלאומיות.
1. החיסונים של C57BL/6 עכברים עם T Ag-הבעת הגידול תאים
<ol><li>לגדל את SV40-שינוי התאים של קו פיברוסרקומה C57SV (או התאים הדומים T Ag+ שורה תא) ב בינונית שונה של הנשר ש...

<ol>
	<li>Yewdell, J. W., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+in+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+T+lymphocyte+responses.">Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses.</a> Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+in+the+immunodominance+hierarchy+in+secondary+CD8++T+cell+responses+to+influenza+A+virus:+roles+for+cross-presentation+and+lysis-independent+immunodomination.">Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).</li><li>Otahal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+cross-presentation+limits+the+CD8++T+cell+response+to+a+subdominant+tumor+antigen+epitope.">Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope.</a> The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).</li><li>Lauron, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+induces+immunodomination+in+the+presence+of+viral+MHC+class+I+inhibition.">Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).</li><li>Crowe, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+presentation+regulates+the+changing+patterns+of+CD8++T+cell+immunodominance+in+primary+and+secondary+influenza+virus+infections.">Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).</li><li>Probst, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+of+an+antiviral+cytotoxic+T+cell+response+is+shaped+by+the+kinetics+of+viral+protein+expression.">Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression.</a> The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).</li><li>Gileadi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immunodominant+CTL+epitope+is+affected+by+proteasome+subunit+composition+and+stability+of+the+antigenic+protein.">Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein.</a> The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).</li><li>Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+proteasomes+function+to+increase+viral+peptide+diversity+and+broaden+antiviral+CD8++T+cell+responses.">Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses.</a> The Journal of Immunology. 191 (1), 52-59 (2013).</li><li>Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+affinity,+peptide+liberation,+T+cell+repertoire,+and+immunodominance+all+contribute+to+the+paucity+of+MHC+class+I-restricted+peptides+recognized+by+antiviral+CTL.">MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL.</a> The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).</li><li>Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinant+selection+of+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+antigenic+peptides+is+explained+by+class+I-peptide+affinity+and+is+strongly+influenced+by+nondominant+anchor+residues.">Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues.</a> The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).</li><li>Kotturi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+precursor+frequencies+and+MHC+binding+rather+than+the+degree+of+epitope+diversity+shape+CD8++T+cell+immunodominance.">Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance.</a> The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).</li><li>Haeryfar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+deoxynucleotidyl+transferase+establishes+and+broadens+antiviral+CD8++T+cell+immunodominance+hierarchies.">Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies.</a> The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).</li><li>Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+immunodominance+hierarchies+of+influenza+A+virus-specific+H-2(b)-restricted+CD8++T+cells+in+the+absence+of+terminal+deoxynucleotidyl+transferase.">Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase.</a> Immunological Investigations. 37 (7), 714-725 (2008).</li><li>Kedl, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+compete+for+access+to+antigen-bearing+antigen-presenting+cells.">T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).</li><li>Kastenmuller, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-competition+of+CD8++T+cells+shapes+the+immunodominance+hierarchy+during+boost+vaccination.">Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).</li><li>Memarnejadian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Promotes+Epitope+Spreading+in+Anticancer+CD8(+)+T+Cell+Responses+by+Preventing+Fratricidal+Death+of+Subdominant+Clones+To+Relieve+Immunodomination.">PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).</li><li>Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+CD8++T+cell+responses+induced+by+direct+priming+and+cross-priming+and+moderate+immunodominance+disparities.">Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities.</a> The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).</li><li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+immunodominant+antitumor+and+antiviral+CD8++T+cell+responses+by+indoleamine+2,3-dioxygenase.">Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase.</a> PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).</li><li>Maleki Vareki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+simultaneous+antitumor+and+alloreactive+CD8(+)+T-cell+responses+in+the+same+host+by+rapamycin.">Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin.</a> American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).</li><li>Irvine, K., Bennink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+immunodominance+hierarchies+in+TCD8++-mediated+antiviral+responses.">Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).</li><li>Grossmann, M. E., Davila, T., Celis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+tolerance+against+prostatic+antigens+with+subdominant+peptide+epitopes.">Avoiding tolerance against prostatic antigens with subdominant peptide epitopes.</a> Journal of Immunotherapy. 24 (3), 237-241 (2001).</li><li>Schreiber, H., Wu, T. H., Nachman, J., Kast, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+and+tumor+escape.">Immunodominance and tumor escape.</a> Seminars in Cancer Biology. 12 (1), 25-31 (2002).</li><li>Mylin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+CD8(+)+T-lymphocyte+responses+to+multiple+epitopes+from+simian+virus+40+(SV40)+large+T+antigen+in+C57BL/6+mice+immunized+with+SV40,+SV40+T-antigen-transformed+cells,+or+vaccinia+virus+recombinants+expressing+full-length+T+antigen+or+epitope+minigenes.">Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).</li><li>Fu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoplasmic+reticulum-targeting+signal+sequence+enhances+the+immunogenicity+of+an+immunorecessive+simian+virus+40+large+T+antigen+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope.">An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+of+CD8++T+cells+by+viral+and+tumor+antigens+is+a+robust+phenomenon.">Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon.</a> European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).</li><li>Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Alloantibody-Mediated+Cytotoxicity+In+Vivo.">Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo.</a> Transplantation. 100 (5), 1041-1051 (2016).</li><li>Aichele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+antigen+treatment+of+naive+and+virus-immune+mice:+antigen-specific+tolerance+versus+immunopathology.">Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology.</a> Immunity. 6 (5), 519-529 (1997).</li><li>Oehen, S., Brduscha-Riem, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+naive+CTL+to+effector+and+memory+CTL:+correlation+of+effector+function+with+phenotype+and+cell+division.">Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division.</a> The Journal of Immunology. 161 (10), 5338-5346 (1998).</li><li>Coles, R. M., Mueller, S. N., Heath, W. R., Carbone, F. R., Brooks, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+armed+CTL+from+draining+lymph+node+to+spleen+shortly+after+localized+infection+with+herpes+simplex+virus+1.">Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 834-838 (2002).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> The Journal of Immunology. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Meilleur, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+superantigens+expand+and+activate,+rather+than+delete+or+incapacitate,+preexisting+antigen-specific+memory+CD8++T+cells.">Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Goldszmid, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+charged+with+apoptotic+tumor+cells+induce+long-lived+protective+CD4++and+CD8++T+cell+immunity+against+B16+melanoma.">Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).</li><li>Oberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+or+mismatch+of+MHC+class+I+is+sufficient+to+trigger+NK+cell-mediated+rejection+of+resting+lymphocytes+in+vivo+-+role+of+KARAP/DAP12-dependent+and+-independent+pathways.">Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways.</a> European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).</li><li>Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+cytotoxicity+by+invariant+NKT+cells+in+vivo+is+CD95/CD178-dependent+and+is+correlated+with+antigenic+potency.">Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency.</a> The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).</li><li>Brinster, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+harboring+SV40+T-antigen+genes+develop+characteristic+brain+tumors.">Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors.</a> Cell. 37 (2), 367-379 (1984).</li><li>Tatum, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+targeting+a+single+immunodominant+epitope+are+sufficient+for+elimination+of+established+SV40+T+antigen-induced+brain+tumors.">CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors.</a> The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).</li><li>Schell, T. D., Tevethia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+advanced+choroid+plexus+tumors+in+SV40+T+antigen+transgenic+mice+following+priming+of+donor+CD8(+)+T+lymphocytes+by+the+endogenous+tumor+antigen.">Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen.</a> The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).</li><li>Greenberg, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+in+a+transgenic+mouse.">Prostate cancer in a transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).</li></ol>

Cfse מבוססי vivo ציטורעילות בחני מציעים מספר יתרונות על הרצח המסורתי בחני כגון כרום רדיואקטיבי (51Cr) שחרור וצביעת מטרי לקטט דהידרוגנאז (ldh) שחרור בחני. ראשית, הם מתירים את הניטור של הפונקציה CTL בתוך איבר הלימפה המשני שלמים מבחינה אדריכלית.
שנית, את ההרג הספציפי של תאי היעד ב vi...

קונבנציונאלי CD8+ T תאים (TCD8) לשחק חלקים חשובים מעקב החיסונית תרופות נגד סרטן. הם בעיקר לתפקד בקיבולת של לימפוציטים T cytolytic (CTLs) המכירים אנטיגנים פפטיד או הקשורים הגידול (Ags) מוצג בתוך החריץ הסגור של מורכבת היסטוליסטית מורכבים (MHC) class אני מולקולות. באופן מלא CTLs לנצל ארסנל ציטוטוקסיים שלהם כדי להרוס תאים ממאירים. Anticancer TCD8 ניתן להבחין במחזור הדם או אפילו בתוך המוני המוני וגרורתית של חולי סרטן רבים וחיות נושאת הגידול. עם זאת, לעתים קרובות הם מותשים או מעייפים ואינם מצליחים לבער את הסרטן. לכן, שיטות חיסוני רבות נועדו להגדיל את תדריCD8 T של סרטן ולשחזר ולהגביר את התפקודים שלהם.
הגידול חלבונים הנמל פפטידים רבים, שחלקם יכולים להיות מסוג חיסוני והחיסונית פוטנציאלי. עם זאת, תגובות לכימות TCD8 מעורר עם גניטודות שונות נגד פפטידים מעטים בלבד. זה יוצר "היררכיה חיסונית" בין TCD8 המשובטים1. לפיכך, החיסונית (ID) TCD8 לכבוש את השורות ההירארכית בולטות, אשר נשפט בדרך כלל על ידי השפע שלהם. לעומת זאת, TCD8 תאים שקולטן התא t (tcr) ספציפי עבור אפידומיננטה (SD) מתרחשים בתדרים נמוכים יותר. אנו ואחרים זיהינו חלק מהגורמים המכתיבים או מרכיבים את הצורה החיסונית ב-TCD8 תגובות. אלה כוללים, בין היתר, את המצב של מצגת Ag ל-TCD8 נאיבי (כלומר, מצגת ישירה, מצגת צולבת, קרוס-חבישה)2,3,4, סוג של תאים המציגים Ag (apcs) השתתפות TCD8 הפעלה5, שפע ויציבות של החלבון Ags6,7 ואת היעילות והקינטיקה של השפלה שלהם על ידי פרוטאספמס7,8, ה סלקטיביות יחסית של טרנספורטר הקשורים לעיבוד Ag (ברז) עבור פפטידים9, האהדה של פפטידים משוחרר עבור מולקולות mhc I9,10, הנוכחות, תדרים קודמי ומגוון tcr של קנצוני TCD8 בבריכות תא t11,12,13, החוצה תחרות בין תאים t עבור גישה ל-apcs14,15, ואת הקיבולת הפרימלרצח של TCD8 שיבוטים16. בנוסף, TCD8 אימונוod הוא נתון מנגנונים אימונוגוקקים בתיווך על ידי מספר סוגי תא משתיק קול כגון הרגולציה טבעי T (nTreg) תאים17, משטח התא מעכבות שיתוף מולקולה מתוכנתים מוות -1 (PD-1)16, ו אנזימים תאיים מסוימים כגון אינפאמין 2, 3-DIחמצון (עידו)18 ואת היעד היונקים של Rapamycin (mtor)19. עם זאת, חשוב לציין, כי הגורמים שלעיל אינם תמיד מהווים משמעות מלאה לחיסוליות.
מלבד הביולוגיה הבסיסית של TCD8 אימונומימינינס, הבדיקה של תופעה זו מרתקת יש השלכות חשובות באימונולוגיה סרטן וטיפול חיסוני. ראשית, מצב מזהה אינו מעניק בהכרח על שיבוטCD8 T נתון את היכולת למנוע חניכה הגידול או התקדמות20. אם וכיצד מזהה ו-SD TCD8 לתרום חסינות antitumor עשוי להיות תלוי בסוג ואת היקף ממאירות ואת המערכת ניסיוני מועסקים. שנית, הוא חשב כי ID TCD8 שיבוטים יכול להיות ' גלוי מדי ' למערכת החיסונית וכתוצאה מכך נוטה יותר למרכז ו/או היקפי מנגנוני סיבולת16,21. שלישית, גידולים הטרובנאיים עשויים להכיל תאים נאופלסטיים הנמנעים מזיהוי ידי רבים, אם לא רוב, CTLs על ידי הצגת רק ספקטרום צר של פפטיד: MHC מתחמי. בנסיבות אלה, TCD8 התגובות של היקף מספיק צפויים להרשות לעצמם תאים סרטניים כגון יתרון הישרדות, ובכך הפוטנציאל שלהם הצמיחה22. זה בגלל הסיבות הנ ל כי הרבה לראות אימונומימינינים כמשוכה מוצלחת TCD8מבוסס חיסון וטיפולים נגד סרטן.
חיסונים של C57BL/6 עכברים עם וירוס קופיים 40 (SV40)-תאים שעברו שינוי כי לבטא גידול גדול Ag (T Ag) מספק מערכת מקדם קלינית רבת עוצמה כדי ללמוד TCD8 אימונוod ance. מודל זה מציע מספר יתרונות. ראשון, את האפיאוסקופים פפטיד של האינטרקופרוטאין זה רלוונטי קלינית מאופיינים היטב זה זן העכבר23 (שולחן 1). שנית, אפיסקופים T Ag, אשר נקראים אתרים I, II/III, IV, ו-V, ההדק תגובות TCD8 כי הם מסודרים בעקביות בסדר ההיררכי הבא: באתר IV > האתר > I ≥ באתר II/III > אתר > V. בהתאם, אתר הרביעי ספציפי TCD8 טעינת התגובה החזקה ביותר ל-T Ag. לעומת זאת, אתרים I ו-II/III הם subdominant, וCD8 האתר הספציפי T הם לפחות שופע ובדרך כלל רק לזיהוי בהעדר התגובה לאפיכסקופים אחרים23,24. שלישית, כבל T Ag+ הגידול מנוצל בפרוטוקול המתואר לעיל, כלומר תאים C57SV פיברוסרקומה, ואת אלה המשמשים בחקירות הקודמות שלנו16,17,18,19 ,25,26, משתנים עם תת גנומית SV40 שברי25. לכן, הם אינם יכולים להרכיב ולשחרר SV40 הריטונים שעלולים להדביק APCs מארח. בנוסף, תאים C57SV הם נטולי מולקולות מגירוי הקלאסי כגון CD80 (b7-1), CD86 (B7-2), CD137 ליגנד (4-1bbl)16. התכונות הנ ל להפוך את הקווים האלה אידיאלי לבדיקה של vivo TCD8 הפעלה באמצעות הטרמה. הטרמה היא מסלול מרכזי בגרימת תגובות TCD8 , במיוחד אלה השיקה נגד תאים סרטניים של מוצא לא המטבית כי לא להיכשל ישירות בתאי T מראש תמים25.
Antitumor TCD8 תדרים ו/או פונקציות ניתן לפקח על ידי mhc I כתמים הטטרמר, כתמים תאיים על ציטוקינים אפקטור (g., אינטרפרון [ifn]-γ) או מולקולות lytic (למשל, בתוספת), חיסוני מקושר אנזים (elispot) בחני ולשעבר . vivo ציטורעילות לרעלים מאז הקמתה שלהם בשנות ה-9027,28, carboxyfluorascinimidyl אסתר (cfse)-מבוסס על הvivo הריגה מאפשר הערכה של תגובות ציטוטוקסיים מתווכת על ידי ויראלית ctls29,30 , 31, antitumor הגידול16,32, טבעי הרוצח (NK) תאים33, גליקולפיד-קבוע מגיב טבעי הרוצח T (inkt) תאים34, ואת התאריך הקיימים ואת דה נובו לתורם ספציפי מיכל ה,26 לכן, היישומים שלהם יכולים להיות מעניינים לקריאה רחבה, כולל אך לא מוגבל לחוקרים העובדים בתחומים של אימונולוגיה הגידול וטיפול חיסוני, חסינות אנטי פתוגן, ועיצוב חיסון מונע וטיפולי.
כדי להעריך את הרעלת התאים בתרחישים טיפוסיים, שתי אוכלוסיות של טחול נאיבי המציגות או לא רלוונטי ag או קנצוני ag (s) מסומנים עם שתי מינונים שונים של cfse, מעורב במספרים שווים מוזרק נאיבי (שליטה) או רוצח עכברים מחסה לתאים הנוכחות/העדר של כל אוכלוסיית היעד נבדק לאחר מכן על-ידי cy, הזרימה.
יש לנו אופטימיזציה ומועסקים vivo הריגת בחני במחקרים שלנו על אימונוod, הן אנטי ויראליותCD8 התגובות לא הגידול12,16,17. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הערכה סימולטני של ID ו-SDCD8 תגובות t Ag אפיסקופים, אשר ניתן לאמץ בקלות עבור חקירות דומות במערכות ניסוי אחרות. כמו כן, אנו מספקים תוצאות מייצגות הממחיש כי המחסור תא nTreg ו-PD-1 המצור יכול באופן סלקטיבי לשפר את מזהה TCD8-ו-SD tCD8-המושרה ציטורעילות, בהתאמה. בסופו של דבר, נדון ביתרונות מרובים של vivo הריגת בחני כמו גם חלק מהמגבלות הטמונות שלהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:872px;" width="871">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">25200-056</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFSE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-150</td>
			<td>Heat-inactivate prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock is 100X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2)</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0116-01</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone HRPN)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0088</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone TNP6A7)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG2a (clone 2A3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0089</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM final concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses

Carboxyfluorascinimidyl אסתר (CFSE)-מבוסס vivo ציטורעילות לאפשר כימות רגיש ומדויק של CD8+ cytolytic T התגובות לימפוציטים (CTL) התגובה הנובעת מהגידול-ואת הפתוגן נגזר הפפטידים. הם מציעים מספר יתרונות. על רצח מסורתי ראשית, הם מתירים את הניטור של הרעלים בתיווך CTL בתוך איברי הלימפה שלמים מבחינה ארכיטקטונית, בדרך כלל בטחול. שנית, הם מאפשרים לימודי מכניסטיים במהלך הטרמה, התיקטור ושלבי האחזור של תגובות CTL. שלישית, הם מספקים פלטפורמות שימושיות עבור בדיקות החיסון/יעילות התרופה בהגדרה באמת vivo. כאן, אנו מספקים פרוטוקול ממוטב לבדיקה של תגובות CTL במקביל נגד יותר מאשר אפירופה פפטיד אחד של מודל הגידול אנטיגן (Ag), כלומר, וירוס קופיים 40 (SV40)-מקודד גדול T ag (t ag). כמו רוב חלבונים אחרים הגידולים קלינית הגידול, ג ' Ag הנמלים רבים פפטידים חיסוני פוטנציאלי. עם זאת, רק ארבעה פפטידים כאלה לגרום לתגובות CTL לגילוי ב C57BL/6 עכברים. תגובות אלה מסודרות בעקביות בסדר הירארכי המבוסס על גודל שלהם, אשר יוצר את הבסיס ל-TCD8 "אימונוod, במערכת רבת עוצמה זו. בהתאם לכך, רוב תגובת ה-TCD8 הספציפית לג מתמקדת נגד אפירופה בודד של החיסונית בעוד ששלושת האפיסקופים האחרים מזוהים ומגיבים רק בחולשה. אימונובודמינינס להתפשר על היקף התגובות TCD8 הגידול והוא, ככזה, נחשב על ידי רבים כמניעת חיסון מוצלח נגד סרטן. לכן, חשוב להבין את הגורמים הסלולאריים והמולקולריים והמנגנונים המכתיבים אומCD8 את הצורה T. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן מותאם לחקירת תופעה זו במודל החיסון T Ag, אבל יכול להיות שונה בקלות המורחבת למחקרים דומים במודלים סרטניים אחרים. אנו מספקים דוגמאות של איך ההשפעה של התערבויות חיסוני ניסיוני ניתן למדוד באמצעות vivo ציטורעילות assays הספר.

מטרת הניסוי שתוצאותיה מתוארות באיור 1 היה לקבוע אם הנוכחות והפונקציות של התאים nTreg הצורה או לשנות את ההיררכיה האימונומימיניוליות של t Ag ספציפי tCD8. C57BL/6 עכברים הוזרקו את הכתובת עם PBS או עם 0.5 מ"ג של anti-CD25 mAb (שיבוט PC-61.5.3 [PC61]) ארבעה ימים לפני שהם קיבלו 2 x 107 C57SV הגידול תא?...

Watch this Scientific Journal Video about Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses at JoVE.com

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

תפירה Vivo ציטורעילות Assays ללמוד אימונומימינינס ב-CD8 התגובות הספציפיות לגידול של תאים

אנו מתארים כאן הזרימה cyvivo try מבוסס בתוך שיטת ההרג המאפשרת לבדוק את החיסונית של האימונוטוקסיט T לימפוציטים (CTL) התגובות של הגידול מודל אנטיגן. אנו מספקים דוגמאות לאופן השימוש בבחינה אלגנטית זו למחקרים מכניסטיים ולבדיקת יעילות בסמים.

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

ניתן להשתמש בה כדי לכמת ציטוטוקסיות בתווית תאי T כנגד שתי אפיטופים פפטיד נפרדים של אנטיגנים סרטניים בו זמנית. הטבע in vivo של ההתמדה הזאת מאפשר פונקציה cytotoxic של תאי T להימדד בתוך הארכיטקטורה שלם של איבר לימפואיד משני. בנוסף, ההרג שנצפה הוא השתקפות מדויקת של המספר המוחלט של תאי T, ולא רק את התדרים שלהם, אשר יכול להיות מטעה.בדיקה זו מאפשרת בדיקה של תגובות תאי T ציטוטוקסיים לאנטיגנים אימונודומיננטיים ותת דומיננטיים של גידולים. לכן הוא מספק מידע בעל ערך בעת תכנון חיסון, כמו גם פרוטוקולים אימונותרפיים לסרטן. הפרוטוקול שלנו הותאם לחקר תגובות לתאי CD8 T.עם זאת, זה יכול להיות שונה כדי למדוד cytotoxicity עורר על ידי סוגים אחרים של תאים רוצח, כגון תאי NK ולימפוציטים T דמויי innate. מבחן זה דורש ניסיון בטכניקה אספטית, טיפול ברקמת עכבר, הכנת תאי יעד, כמו גם מומחיות בזריקות ורידים בזנב. אחד צריך לרכוש סט כישורים זה לפני שתנסה את ההריגה in vivo.לאחר קו תא הגידול חסידי T-אנטיגן חיובי הפך קונפלנטי לחלוטין או מעט יותר מדי confluent, בעדינות לשטוף את monolayer עם סטרילי, PBS חם, ולנתק את התאים הגידול עם 0.25% טריפסין EDTA ב ארון biosafety. הקש על הצדדים של בקבוק התרבות מספר פעמים כדי לשחרר את התאים חסידים הנותרים, ולעצור את התגובה לאחר כחמש דקות עם תוספת של חמישה מיליליטר של מדיום DMEM. פיפטה פתרון התא כמה פעמים לפני סינון ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר נקבוביות לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ולתלות את גלולה ב 10 מיליליטר של סטרילי, PBS קר עבור הראשון של שלוש שטיפות באותם תנאים. לאחר הכביסה השלישית, להשתמש מחדש את התאים בארבע פעמים 10 לשבעה תאים למיליליטר של ריכוז PBS סטרילי, ולהזריק 500 microliters של T-אנטיגן חיובי תא הגידול השעיה תוך-פרטית לתוך כל שישה עד 12 שבועות בן C57 שחור 6 עכבר נמען. להכנת טחול היעד, מניחים את העכבר התורם המתת דם בתוואי נוטה, לרסס את החיה עם 70% אתנול.באמצעות מדפים סטריליים ומספריים, להרים את העור ולעשות חתך גחוני קטן באמצע הקו. חותכים את העור בצורה צולבת כדי לחשוף את הצפי, ולהשתמש במקלות כדי למשוך את הצמיטונום בצורה דמוית אוהל, מבלי לתפוס את כל האיברים הפנימיים. חותכים לפתוח את צפי כדי לחשוף את חלל צפי, בעדינות להעביר את הטחול מטחנת רקמות Dounce 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של PBS סטרילי.השתמש הבוכנה כדי להפעיל לחץ ידני עד הרקמה הטחול מתפוגג לתוך השעיית תא הומוגני אדום, ולהעביר את homogenate לתוך צינור 15 מיליליטר. לאסוף את ההשעיה על ידי צנטריפוגה, ולתלות את גלולה בארבעה מיליליטר של מאגר אשלגן אשלגן אמוניום כלורי כדי לחסל את אריתרוציטים. לאחר ארבע דקות, לעצור את התהליך עם שמונה מיליליטר של מדיום מלא, ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר נקבובית לתוך צינור חדש 50 מיליליטר.להפריד את תאי הדם הלבנים מפסולת תאי הדם האדומים על ידי צנטריפוגה, ולתלות מחדש את גלולה ב 12 מיליליטר של מדיום שלם. ואז לפצל את ההשעיה הטחול לשלושה aliquots ארבעה מיליליטר שווה. עבור קידוד פפטיד של הטשטוש היעד, דופק אחד splenocyte aliquot עם micromolar אחד של פפטיד לא רלוונטי, aliquot אחד עם micromolar אחד של אתר אני פפטיד, ועליקוט אחד עם micromolar אחד של פפטיד אתר IV במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.בסוף הדגירה, להסיר את עודף פפטיד על ידי צנטריפוגה ולשטוף את טשטוש פפטיד פעימות פעמיים ב 12 מיליליטר של סטרילי, קר PBS לכל לשטוף לצינור. לאחר הכביסה השנייה, יש למצות את התאים בארבעה מיליליטר של PBS טרי וסטרילי לצינור. הוסף 025, 0.25, ו- CFSE שני מיקרומולרים לתוך לא רלוונטי, אתר I, ואתר IV פפטיד פעמו השעיות טחול בהתאמה.מניחים את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם היפוך ידני פעם בחמש דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים שלושה מיליליטר של סרום בקר עוברי ללא חום לכל צינור כדי לעצור את תגובת CFSE ולהביא את הנפח הסופי בכל צינור עד 15 מיליליטר עם PBS. לאחר מכן לאסוף את התאים המסומנים בצבע על ידי צנטריפוגה עבור שתי שטיפות ב 12 מיליליטר של PBS טרי, סטרילי לכל לשטוף.כדי לאשר תיוג CFSE נאותה של הטשטוש היעד, להשתמש מחדש את גלולה בשלושה מיליליטר של PBS ומערבבים עם מערבולת עדינה. העבר 10 מיקרוליטרים מכל מתלי תאים המסומנים ב- CFSE לתוך מיון תאים בודדים של חמישה מיליליטר עגולים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, או צינור FACS, המכיל PBS, וטען את הצינור על ציטומטר זרימה המצויד בלייזר 488 ננומטר. בתוכנת ציטומטר זרימה, ליצור שער לימפוציטים המבוסס על פיזור קדימה תכונות פיזור בצד של התאים לפני רכישת 5, 000 אירועים נופלים בתוך שער לימפוציטים בערוץ Fluorescence 1.בתוך האוכלוסיה האב CFSE חיובי, לצייר שערי היסטוגרמה נוספים כדי לזהות את CFSE נמוך, CFSE-ביניים, ו CFSE גבוה subpopulations. לאחר מכן אשר מספר אירוע שווה או כמעט שווה בתוך שלושת השערים עבור שני הצינורות האחרים של תאים מסומנים. להזרקה של תאי היעד, תחילה בעדינות מערבולת צינורות המקור בריכה שלושת מתלי התא המסומן CFSE לתוך צינור חדש ביחסים שווים.למעלה את תכולת הצינור עם PBS סטרילי, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה לספירה. לאחר מכן כוונן את עוצמת הקול ל- 10 פעמים לשבעת תאי היעד המעורבים לכל 200 מיקרוליטרים של PBS לכל ריכוז נמען, והזריק 200 כרכים מיקרוליטריים של מתלי התא לווריד הזנב של כל עכבר C57 Black 6 נמען. שעתיים או ארבע לאחר ההזרקה, להסיר ולעבד את הטחול של כל חיה הנמען כפי שהוכח, ו resuspend תאי הדם הלבנים מבודדים בשלושה מיליליטר של PBS לכל טחול.העבר בערך פעם אחת 10 לשבעת התאים מכל טחול מעובד לתוך צינור FACS נקי, ומיד להפעיל את התאים על ציטומטר הזרימה כפי שהוכח לשער CFSE נמוך, ביניים, ואוכלוסיות תא יעד גבוה. לאחר מכן לרכוש סך של 2, 000 CFSE-נמוך אירועים בערוץ Fluorescence 1, ולחשב את התזה הספציפית של כל אוכלוסיית תא היעד קוגניציה על פי הנוסחה המפורטת בטקסט. בניסוי מייצג זה, ההצלחה של דלדול תאי T רגולטוריים המתרחשים באופן טבעי בעכברים מוזרק עם נוגדן חד שבטי נגד CD25 אושרה על ידי ציטומטריית זרימה.כצפוי, פסגות כמעט שוות המתאימות לתאי היעד של הבקרה וההתזהה היו ניתנות לגילוי בעכברים נאיביים. לעומת זאת, תאי יעד המציגים Site-IV נעדרו כמעט לחלוטין בעכברים בעלי פריים אנטיגן T, ללא קשר לטיפולם הקודם בנוגדנים חד שבטיים נגד CD25 או PBS. מעניין, באופן טבעי T reg התא דלדול על ידי נוגדן חד שבטי נגד CD25 מוגברת vivo cytotoxic T-לימפוציטים מתווך תזה של תאי היעד Site-I-פעימות.בחקירה ייצוגית שנייה זו, מוות מתוכנת 1 המצור משופרת תת דומיננטי CD8 חיובי T תאים אתרים אחת ושתיים לוכסן-שלוש ספציפיות תגובות, מה שמרמז כי הפרעה למוות מתוכנת 1/מתוכנת מוות ליגנד 1 אינטראקציות עלול לגרום אפיטופ מתפשט בתגובות נגד סרטן CD8 חיובי תא T. זה קריטי בעת תיוג התאים התורמים שלך עם CFSE, ודא שהריכוזים שלך מדויקים. אחרת זה עלול לגרום פסגות היסטוגרמה חופפות, מה שהופך את החישובים הנדרשים שלך פרשנות נתונים קשה, אם לא בלתי אפשרי.זה יהיה חשוב לייעל במבחני vivo cytotoxicity לכמת פונקציות אפקטים עורר על ידי סוגי תאים רוצח שונים המזהים אנטיגנים פפטיד ולא פפטיד באותו מארח.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...