Name: tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses
Uploaded: 2019-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da Canadian Institutes of Health Research (CIHR) concede MOP-130465 e PJT-156295 a SMMH. JC è parzialmente supportato da una borsa di studio di laurea Queen Elizabeth II in scienza e tecnologia presso il Ministero della formazione, College e Università dell'Ontario. CEM è stato un destinatario di una borsa di studio laureato Alexander Graham Bell Canada (dottorato) da scienze naturali e ingegneria ricerca del Canada (NSERC).

Gli esperimenti qui descritti seguono i protocolli di uso degli animali approvati da enti istituzionali e aderiscono a linee guida nazionali consolidate.
1. inoculo di topi C57BL/6 topi con cellule tumorali che esprimono T AG
<ol><li>Far crescere la linea di cellule fibrosarcoma SV40-trasformata C57SV (o una linea cellulare T AG+ aderente simile) nel medium dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/l D-glucosio e l-glutammina (1x) e completato con 1 mm di piruvato di sod...

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	<li>Yewdell, J. W., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+in+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+T+lymphocyte+responses.">Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses.</a> Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+in+the+immunodominance+hierarchy+in+secondary+CD8++T+cell+responses+to+influenza+A+virus:+roles+for+cross-presentation+and+lysis-independent+immunodomination.">Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).</li><li>Otahal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+cross-presentation+limits+the+CD8++T+cell+response+to+a+subdominant+tumor+antigen+epitope.">Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope.</a> The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).</li><li>Lauron, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+induces+immunodomination+in+the+presence+of+viral+MHC+class+I+inhibition.">Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).</li><li>Crowe, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+presentation+regulates+the+changing+patterns+of+CD8++T+cell+immunodominance+in+primary+and+secondary+influenza+virus+infections.">Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).</li><li>Probst, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+of+an+antiviral+cytotoxic+T+cell+response+is+shaped+by+the+kinetics+of+viral+protein+expression.">Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression.</a> The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).</li><li>Gileadi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immunodominant+CTL+epitope+is+affected+by+proteasome+subunit+composition+and+stability+of+the+antigenic+protein.">Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein.</a> The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).</li><li>Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+proteasomes+function+to+increase+viral+peptide+diversity+and+broaden+antiviral+CD8++T+cell+responses.">Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses.</a> The Journal of Immunology. 191 (1), 52-59 (2013).</li><li>Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+affinity,+peptide+liberation,+T+cell+repertoire,+and+immunodominance+all+contribute+to+the+paucity+of+MHC+class+I-restricted+peptides+recognized+by+antiviral+CTL.">MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL.</a> The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).</li><li>Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinant+selection+of+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+antigenic+peptides+is+explained+by+class+I-peptide+affinity+and+is+strongly+influenced+by+nondominant+anchor+residues.">Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues.</a> The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).</li><li>Kotturi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+precursor+frequencies+and+MHC+binding+rather+than+the+degree+of+epitope+diversity+shape+CD8++T+cell+immunodominance.">Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance.</a> The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).</li><li>Haeryfar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+deoxynucleotidyl+transferase+establishes+and+broadens+antiviral+CD8++T+cell+immunodominance+hierarchies.">Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies.</a> The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).</li><li>Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+immunodominance+hierarchies+of+influenza+A+virus-specific+H-2(b)-restricted+CD8++T+cells+in+the+absence+of+terminal+deoxynucleotidyl+transferase.">Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase.</a> Immunological Investigations. 37 (7), 714-725 (2008).</li><li>Kedl, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+compete+for+access+to+antigen-bearing+antigen-presenting+cells.">T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).</li><li>Kastenmuller, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-competition+of+CD8++T+cells+shapes+the+immunodominance+hierarchy+during+boost+vaccination.">Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).</li><li>Memarnejadian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Promotes+Epitope+Spreading+in+Anticancer+CD8(+)+T+Cell+Responses+by+Preventing+Fratricidal+Death+of+Subdominant+Clones+To+Relieve+Immunodomination.">PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).</li><li>Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+CD8++T+cell+responses+induced+by+direct+priming+and+cross-priming+and+moderate+immunodominance+disparities.">Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities.</a> The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).</li><li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+immunodominant+antitumor+and+antiviral+CD8++T+cell+responses+by+indoleamine+2,3-dioxygenase.">Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase.</a> PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).</li><li>Maleki Vareki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+simultaneous+antitumor+and+alloreactive+CD8(+)+T-cell+responses+in+the+same+host+by+rapamycin.">Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin.</a> American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).</li><li>Irvine, K., Bennink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+immunodominance+hierarchies+in+TCD8++-mediated+antiviral+responses.">Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).</li><li>Grossmann, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+CD8(+)+T-lymphocyte+responses+to+multiple+epitopes+from+simian+virus+40+(SV40)+large+T+antigen+in+C57BL/6+mice+immunized+with+SV40,+SV40+T-antigen-transformed+cells,+or+vaccinia+virus+recombinants+expressing+full-length+T+antigen+or+epitope+minigenes.">Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).</li><li>Fu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoplasmic+reticulum-targeting+signal+sequence+enhances+the+immunogenicity+of+an+immunorecessive+simian+virus+40+large+T+antigen+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope.">An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+of+CD8++T+cells+by+viral+and+tumor+antigens+is+a+robust+phenomenon.">Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon.</a> European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).</li><li>Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Alloantibody-Mediated+Cytotoxicity+In+Vivo.">Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo.</a> Transplantation. 100 (5), 1041-1051 (2016).</li><li>Aichele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+antigen+treatment+of+naive+and+virus-immune+mice:+antigen-specific+tolerance+versus+immunopathology.">Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology.</a> Immunity. 6 (5), 519-529 (1997).</li><li>Oehen, S., Brduscha-Riem, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+naive+CTL+to+effector+and+memory+CTL:+correlation+of+effector+function+with+phenotype+and+cell+division.">Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division.</a> The Journal of Immunology. 161 (10), 5338-5346 (1998).</li><li>Coles, R. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+superantigens+expand+and+activate,+rather+than+delete+or+incapacitate,+preexisting+antigen-specific+memory+CD8++T+cells.">Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Goldszmid, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+charged+with+apoptotic+tumor+cells+induce+long-lived+protective+CD4++and+CD8++T+cell+immunity+against+B16+melanoma.">Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).</li><li>Oberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+or+mismatch+of+MHC+class+I+is+sufficient+to+trigger+NK+cell-mediated+rejection+of+resting+lymphocytes+in+vivo+-+role+of+KARAP/DAP12-dependent+and+-independent+pathways.">Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways.</a> European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).</li><li>Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+cytotoxicity+by+invariant+NKT+cells+in+vivo+is+CD95/CD178-dependent+and+is+correlated+with+antigenic+potency.">Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency.</a> The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).</li><li>Brinster, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+harboring+SV40+T-antigen+genes+develop+characteristic+brain+tumors.">Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors.</a> Cell. 37 (2), 367-379 (1984).</li><li>Tatum, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+targeting+a+single+immunodominant+epitope+are+sufficient+for+elimination+of+established+SV40+T+antigen-induced+brain+tumors.">CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors.</a> The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).</li><li>Schell, T. D., Tevethia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+advanced+choroid+plexus+tumors+in+SV40+T+antigen+transgenic+mice+following+priming+of+donor+CD8(+)+T+lymphocytes+by+the+endogenous+tumor+antigen.">Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen.</a> The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).</li><li>Greenberg, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+in+a+transgenic+mouse.">Prostate cancer in a transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).</li></ol>

I saggi di citotossicità in vivo basati su CFSE offrono diversi vantaggi rispetto ai saggi tradizionali di uccisione come il cromo radioattivo (51CR) Release e i saggi di rilascio di lattato deidrogenasi colorimetrico (LDH). In primo luogo, consentono il monitoraggio della funzione CTL all'interno di un organo linfoide secondario architettonicamente intatto.
In secondo luogo, l'uccisione specifica di cellule bersaglio in saggi di citotossicità in vivo riflette il numero assoluto d...

Le cellule t CD8+ convenzionali (tCD8) giocano parti importanti nella sorveglianza immunitaria anticancro. Essi funzionano principalmente nella capacità dei linfociti T citolitici (CTLs) che riconoscono i peptidi antigeni specifici del tumore o associati (AGS) visualizzati all'interno della fessura chiusa delle principali molecole di classe I di istocompatibilità (MHC). I CTL completamente armati utilizzano il loro arsenale citotossico per distruggere le cellule maligne. Anticancro TCD8 può essere rilevato in circolazione o anche all'interno di masse primarie e metastatiche di molti pazienti oncologici e animali tumorali. Tuttavia, sono spesso anergici o esausti e non riescono a sradicare il cancro. Pertanto, molte modalità immunoterapeutiche sono progettate per aumentare le frequenze TCD8 anticancro e per ripristinare e potenziare le loro funzioni.
Le proteine tumorali ospitano molti peptidi, alcuni dei quali possono essere immunogenici e potenzialmente immunoprotettivi. Tuttavia, le risposte TCD8 quantificabili sono suscitate con magnitudini variabili contro pochi peptidi solo. Questo crea una "gerarchia di immunodominanza" tra i cloni TCD8 1. Di conseguenza, immunodominante (ID) TCD8 occupano prominenti ranghi gerarchici, che è comunemente giudicato dalla loro abbondanza. Al contrario, le cellule TCD8 il cui recettore delle cellule t (TCR) è specifico per gli epitopi SUBDOMINANTI (SD) si verificano nelle frequenze più basse. Noi e altri abbiamo identificato alcuni dei fattori che dettano o plasmano l'immunodominanza nelle risposte TCD8 . Questi includono, tra gli altri, la modalità di presentazione AG a naïve TCD8 (cioè, presentazione diretta, cross-presentazione, cross-dressing)2,3,4, il tipo di cellule presentanti AG (APCs) partecipando all'attivazione T CD85, l'abbondanza e la stabilità delle proteine AGS6,7 e l'efficienza e la cinetica del loro degrado da parte dei proteasomi7,8, il selettività relativa del trasportatore associato alla lavorazione AG (TAP) per i peptidi9, l'affinità dei peptidi liberati per le molecole MHC I9,10, la presenza, le frequenze dei precursori e la diversità di TCR di imparentata tCD8 in pool di cellule t11,12,13, Cross-Competition tra le cellule t per l'accesso a APCs14,15, e la capacità fratricida di tCD8 cloni16. Inoltre, l'immunodominanza TCD8 è sottoposto a meccanismi immunoregolanti mediati da diversi tipi di cellule soppressori, come le cellule t (nTreg) regolatorie naturali (n)17, la molecola co-inibitoria della superficie cellulare programmata morte-1 (PD-1)16, e alcuni enzimi intracellulari come indoleamine 2, 3-diossigenasi (ido)18 e l'obiettivo dei mammiferi della rapamicina (mTOR)19. È importante notare, tuttavia, che i fattori di cui sopra non sempre completamente conto per l'immunodominanza.
Oltre alla biologia di base dell'immunodominanza TCD8 , l'esame di questo intrigante fenomeno ha importanti implicazioni nell'immunologia e immunoterapia del cancro. In primo luogo, uno stato ID non conferisce necessariamente su un determinato clone TCD8 la capacità di prevenire l'iniziazione tumorale o progressione20. Se e come ID e SD TCD8 contribuiscono all'immunità antitumorale può dipendere dal tipo e l'entità di malignità e il sistema sperimentale impiegato. In secondo luogo, si ritiene che i cloni ID TCD8 possano essere "troppo visibili" al sistema immunitario e, di conseguenza, più inclini ai meccanismi di tolleranza centrale e/o periferica16,21. Terzo, i tumori eterogenei possono contenere cellule neoplastiche che evitano il rilevamento da molti, se non la maggior parte, CTLs visualizzando solo uno spettro ristretto di peptidi: MHC complessi. In queste circostanze, TCD8 risposte di ampiezza insufficiente sono suscettibili di permettersi tali cellule tumorali un vantaggio di sopravvivenza, potenziando così la loro conseguenza22. È per le ragioni di cui sopra che molti vista immunodominanza come un ostacolo per la vaccinazione di successo TCD8-based e terapie contro il cancro.
L'inoculo di topi C57BL/6 topi con il virus simian 40 (SV40)-cellule trasformate che esprimono grande tumore AG (T AG) fornisce un potente sistema preclinico per studiare l'immunodominanza TCD8 . Questo modello offre diversi vantaggi. In primo luogo, gli epitopi peptidici di questa oncoproteina clinicamente rilevante sono ben caratterizzati in questo ceppo di topo23 (tabella 1). In secondo luogo, T AG epitopi, che sono chiamati siti I, II/III, IV, e V, trigger TCD8 risposte che sono sistematicamente disposti nel seguente ordine gerarchico: sito IV > > sito I ≥ sito II/iii > &Gt; sito V. di conseguenza, il sito IV specifico TCD8 montare la risposta più robusta a T AG. Al contrario, i siti I e II/III sono subdominanti e i TCD8 specifici del sito V sono meno abbondanti e di solito rilevabili solo in assenza di reattività ad altri epitopi23,24. In terzo luogo, la linea di cellule tumorali T AG+ utilizzata nel protocollo qui descritto, vale a dire C57SV cellule di fibrosarcoma, e quelle utilizzate nelle nostre indagini precedenti16,17,18,19 ,25,26, sono trasformati con frammenti SV40 subgenomici25. Pertanto, essi non sono in grado di assemblare e rilasciare SV40 virioni che potrebbero potenzialmente infettare host APCs. Inoltre, le cellule C57SV sono prive di molecole classiche costimulatorie come CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) e CD137 ligando (4-1BBL)16. Gli attributi di cui sopra rendono queste linee ideali per l'esame dell'attivazione in vivo TCD8 tramite cross-adescamento. L'adescamento incrociato è una via importante nell'indurre le risposte TCD8 , in particolare quelle lanciate contro le cellule tumorali di origine non ematopoietica che non riescono a prime cellule T naïve direttamente25.
Le frequenze e/o le funzioni antitumor TCD8 possono essere monitorate dalla colorazione del TETRAMERO MHC I, dalla colorazione intracellulare per le citochine effettrici (ad es. interferone [IFN]-γ) o dalle molecole lisiche (ad es. perforina), dai dosaggi di immunospot (ELISPOT) collegati agli enzimi ed ex saggi di citotossicità in vivo. Sin dalla loro nascita negli anni novanta27,28, i saggi di uccisione in vivo di carbossilfluorite succinimidilestere (CFSE) hanno consentito la valutazione delle risposte citotossiche mediate da CTLs antivirali29,30 , 31, antitumorale CTLs16,32, cellule Natural Killer (NK)33, cellule di Natural Killer T (iNKT) invarianti di glycolipid-reattivo34, e pre-esistenti e de novo donatori specifici alloanticorpi26. Pertanto, le loro applicazioni possono essere di interesse per un ampio pubblico, compresi ma non limitati a investigatori che lavorano nelle aree di immunologia e immunoterapia tumorale, immunità anti-patogeni, e la progettazione preventiva e terapeutica del vaccino.
Per valutare la citotossicità cellulare-mediata in scenari tipici, due popolazioni di splenociti ingenui che mostrano una AG irrilevante o una AG (s) cognata sono etichettate con due diverse dosi di CFSE, mescolate in numero uguale e iniettato in naïve (controllo) o killer topi che ospitano cellule. La presenza/assenza di ogni popolazione bersaglio viene quindi esaminata dalla citometria a flusso.
Abbiamo ottimizzato e impiegato i saggi di uccisione in vivo nei nostri studi sull'immunodominanza nelle risposte antivirali e antitumore T CD812,16,17. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la valutazione simultanea di ID e SD TCD8 risposte agli epitopi di t AG, che possono essere prontamente adottati per indagini simili in altri sistemi sperimentali. Forniamo anche risultati rappresentativi che dimostrano che la deplezione delle cellule nTreg e il blocco PD-1 possono migliorare selettivamente l'IDtCD8-e la citotossicità indotta da SD t CD8, rispettivamente. Alla fine, discuteremo i molteplici vantaggi dei saggi di uccisione in vivo e di alcuni dei loro limiti intrinseci.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:872px;" width="871">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">25200-056</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFSE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-150</td>
			<td>Heat-inactivate prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock is 100X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2)</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0116-01</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone HRPN)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0088</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone TNP6A7)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG2a (clone 2A3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0089</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM final concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses

I saggi di citotossicità in vivo (CFSE) a base di carbossimetilfluoruro di succinimidile (CFC) consentono una quantificazione sensibile e accurata delle risposte dei linfociti T (CTL) di CD8 e citolitici provocate contro i peptidi derivati dal tumore e dal patogeno. Offrono diversi vantaggi rispetto ai saggi di uccisione tradizionali. In primo luogo, consentono il monitoraggio della citotossicità CTL-mediata all'interno di organi linfoidi secondari architettonicamente intatti, tipicamente nella milza. In secondo luogo, consentono studi meccanicistici durante le fasi di adescamento, effettore e richiamo delle risposte CTL. In terzo luogo, forniscono piattaforme utili per i test di efficacia dei vaccini/farmaci in un ambiente veramente in vivo. Qui, forniamo un protocollo ottimizzato per l'esame delle risposte CTL concomitanti contro più di un epitopo peptidico di un antigene tumorale modello (AG), vale a dire, Simian virus 40 (SV40)-codificato large T AG (T AG). Come la maggior parte delle altre proteine tumorali clinicamente rilevanti, T AG ospita molti peptidi potenzialmente immunogenici. Tuttavia, solo quattro di questi peptidi inducono risposte CTL rilevabili in topi topi C57BL/6. Queste risposte sono disposte in modo coerente in un ordine gerarchico in base alla loro grandezza, che costituisce la base per TCD8 "immunodominio" in questo potente sistema. Di conseguenza, la maggior parte della risposta tCD8 specifica t AG è focalizzata contro un singolo epitopo immunodominante, mentre gli altri tre epitopi sono riconosciuti e hanno risposto solo debolmente. L'immunodominio compromette l'ampiezza delle risposte antitumorali TCD8 ed è, come tale, considerata da molti come un impedimento alla vaccinazione di successo contro il cancro. Pertanto, è importante comprendere i fattori cellulari e molecolari e i meccanismi che dettano o plasmano l'immunodominanza TCD8 . Il protocollo che descriviamo qui è adattato all'indagine di questo fenomeno nel modello di immunizzazione T AG, ma può essere prontamente modificato ed esteso a studi simili in altri modelli tumorali. Forniamo esempi di come l'impatto degli interventi immunoterapeutici sperimentali possa essere misurato utilizzando saggi di citotossicità in vivo.

L'obiettivo dell'esperimento i cui risultati sono rappresentati nella Figura 1 è stato quello di determinare se la presenza e le funzioni delle cellule nTreg plasmano o alterano la gerarchia di immunodominanza del tCD8specifico di t AG. TOPI C57BL/6 topi sono stati iniettati IP con PBS o con 0,5 mg di un anti-CD25 mAb (clone PC-61.5.3 [PC61]) quattro giorni prima hanno ricevuto 2 x 107 C57SV cellule tumorali IP In esperimenti separati, un controllo isotipo IgG1 ratto ?...

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Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Sartoria in vivo saggi di citotossicità per studiare l'Immunodominanza nelle risposte delle cellule CD8+ T specifiche del tumore

Descriviamo qui un saggio di uccisione a base di citometria in vivo che consente di esaminare l'immunodominanza nelle risposte citotossiche dei linfociti T (CTL) a un antigene tumorale modello. Forniamo esempi di come questo saggio elegante può essere impiegato per gli studi meccanicistici e per i test di efficacia dei farmaci.

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Questo saggio può essere impiegato per quantificare la citotossicità mediata da cellule T contro due distinti epitopi peptidici di antigeni tumorali contemporaneamente. La natura in vivo di questo saggio consente di misurare la funzione citotossica delle cellule T all'interno dell'architettura intatta di un organo linfoide secondario. Inoltre, l'uccisione osservata è un riflesso accurato del numero assoluto di cellule T, e non solo delle loro frequenze, il che può essere fuorviante.Questo test consente l'esame delle risposte citotossiche delle cellule T agli antigeni tumorali immunodominanti e sub-dominanti. Fornisce quindi informazioni preziose quando si progetta un vaccino, così come protocolli immunoterapeutici per il cancro. Il nostro protocollo è stato su misura per studiare le risposte alle cellule CD8 T.Tuttavia, può essere modificato per misurare la citotossicità suscitata da altri tipi di cellule killer, come le cellule NK e i linfociti T innati. Questo test richiede esperienza nella tecnica aseptica, nella manipolazione del tessuto del topo, nella preparazione delle cellule bersaglio e nell'esperienza nelle iniezioni delle vene della coda. Bisogna acquisire questo set di abilità prima di tentare il saggio di uccisione in vivo.Una volta che la linea cellulare tumorale aderente aderente all'antigene T è diventata completamente confluente o leggermente troppo confluente, sciacquare delicatamente il monostrato con PBS sterile e caldo e staccare le cellule tumorali con EDTA allo 0,25% di tripside in un armadietto di biosicurezza. Toccare più volte i lati del pallone di coltura per rilasciare le restanti cellule aderenti e interrompere la reazione dopo circa cinque minuti con l'aggiunta di cinque millilitri di mezzo DMEM. Pipettare la soluzione cellulare alcune volte prima di filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino a celle a pori da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri.Raccogliere le cellule per centrifugazione e rimescolare il pellet in 10 millilitri di PBS sterile e freddo per il primo di tre lavaggi nelle stesse condizioni. Dopo il terzo lavaggio, resospensare le cellule a un quattro per 10 alle sette cellule per millilitro di concentrazione sterile di PBS, e iniettare 500 microlitri della sospensione cellulare tumorale T-antigen-positiva intraperitonealmente in ogni ricevente di topo C57 Black 6 di sei-12 settimane. Per la preparazione degli splenociti bersaglio, posizionare il topo donatore eutanasiato nella posizione prona e spruzzare l'animale con il 70% di etanolo.Usando forcep e forbici sterili, sollevare la pelle e fare una piccola incisione ventrale della linea mediana. Tagliare la pelle in modo trasversale per esporre il peritoneo e utilizzare le forcep per tirare su il peritoneo in modo simile a una tenda, senza catturare nessuno degli organi interni. Tagliare aprire il peritoneo per esporre la cavità peritoneale e trasferire delicatamente la milza in una smerigliatrice di tessuto Dounce da 15 millilitri contenente cinque millilitri di PBS sterile.Utilizzare lo stantuffo per applicare la pressione manuale fino a quando il tessuto splenico si dissipa in una sospensione cellulare omogenea rossa e trasferire l'omogeneato in un tubo da 15 millilitri. Raccogliere la sospensione per centrifugazione e rimorsi il pellet in quattro millilitri di tampone di lisina di cloruro di ammonio di potassio per eliminare gli eriociti. Dopo quattro minuti, interrompere il processo con otto millilitri di mezzo completo e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri.Separare i globuli bianchi dai detriti dei globuli rossi per centrifugazione e rimorsi il pellet in 12 millilitri di mezzo completo. Quindi dividere la sospensione dello splendore in tre aliquote uguali di quattro millilitri. Per la codifica peptidica degli splenociti bersaglio, pulsare un'aliquota di splenocita con un micromolare di peptide irrilevante, un'aliquota con un micromolare di peptide di sito I e un'aliquota con un micromolare di peptide del sito IV per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Alla fine dell'incubazione, rimuovere il peptide in eccesso mediante centrifugazione e lavare gli splenociti pulsati da peptidi due volte in 12 millilitri di PBS sterile e freddo per lavaggio per tubo. Dopo il secondo lavaggio, resuspend le cellule in quattro millilitri di PBS fresco e sterile per tubo. Aggiungere CFSE 025, 0,25 e due micromolari rispettivamente nelle sospensioni irrilevanti, site I e site IV peptide-pulsed splenocyte.Posizionare i tubi a 37 gradi Celsius per 15 minuti con inversione manuale una volta ogni cinque minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere tre millilitri di siero bovino fetale inattivato dal calore a ciascun tubo per interrompere la reazione CFSE e portare il volume finale in ogni tubo fino a 15 millilitri con PBS. Quindi raccogliere le cellule etichettate coloranti per centrifugazione per due lavaggi in 12 millilitri di PBS fresco e sterile per lavaggio.Per confermare un'adeguata etichettatura CFSE degli splenociti bersaglio, rimescolare il pellet in tre millilitri di PBS e mescolare con vortici delicati. Trasferire 10 microlitri da ogni sospensione cellulare etichettata CFSE in un singolo smistamento cellulare a fluorescenza rotonda in polistirolo a cinque millilitri, o tubo FACS, contenente PBS, e caricare il tubo su un citometro a flusso dotato di un laser a 488 nanometri. Nel software del citometro a flusso, creare un cancello di linfocita basato sulle proprietà di dispersione in avanti e dispersione laterale delle cellule prima di acquisire 5.000 eventi che rientrano all'interno del cancello dei linfociti nel canale di Fluorescenza 1.All'interno della popolazione madre positiva al CFSE, disegnare ulteriori porte dell'istogramma per identificare le sottopopolazioni basse, cfse-intermedie e ad alto CFSE. Quindi confermare un numero di evento uguale o quasi uguale all'interno dei tre gate per gli altri due tubi di celle etichettate. Per l'iniezione delle cellule bersaglio, prima vortice delicatamente i tubi sorgente e mettere in comune le tre sospensioni cellulari etichettate CFSE in un nuovo tubo a parità di rapporti.Ricaricare il contenuto del tubo con PBS sterile e raccogliere le cellule per centrifugazione per il conteggio. Quindi regolare il volume a uno per 10 alle sette celle bersaglio miste per 200 microlitri di PBS per concentrazione ricevente e iniettare 200 volumi di microlitri della sospensione cellulare nella vena di coda di ogni mouse C57 Black 6 ricevente. Due o quattro ore dopo l'iniezione, rimuovere ed elaborare la milza di ogni animale ricevente come dimostrato e rimpiorsire i globuli bianchi isolati in tre millilitri di PBS per milza.Trasferire circa una volta 10 alle sette cellule da ogni milza lavorata in un tubo FACS pulito e far funzionare immediatamente le cellule sul citometro di flusso come dimostrato per gateare le popolazioni di cellule bersaglio basse, intermedie e alte del CFSE. Quindi acquisire un totale di 2.000 eventi CFSE-low nel canale Fluorescence 1 e calcolare la lisi specifica di ogni popolazione di cellule bersaglio affini secondo la formula dettagliata nel testo. In questo esperimento rappresentativo, il successo dell'esaurimento delle cellule T regolatorie presenti in natura nei topi iniettati con anticorpo monoclonale anti-CD25 è stato confermato dalla citometria a flusso.Come previsto, picchi quasi uguali corrispondenti al controllo e alle cellule bersaglio affini erano rilevabili nei topi ingenui. Al contrario, le cellule bersaglio che mostravano site-IV erano quasi completamente assenti nei topi innescati con antigene T, indipendentemente dal loro trattamento precedente con anticorpi monoclonali anti-CD25 o PBS. È interessante notare che l'esaurimento naturale delle cellule reg T da parte di anticorpi monoclonali anti-CD25 ha aumentato in vivo la lisi citotossica mediata da Linfociti T delle cellule bersaglio pulsate site-I.In questa seconda indagine rappresentativa, il blocco programmato della morte 1 ha migliorato i siti cellulari T sub-dominanti CD8-positivi una e due-barra-tre-specifiche, suggerendo che interferire con le interazioni programmate morte 1/ligando di morte programmata 1 può indurre la diffusione dell'epitopo nelle risposte delle cellule T cd8-positive anti-cancro. È fondamentale quando si etichettano le cellule donatrici con CFSE, assicurarsi che le concentrazioni siano precise. In caso contrario, ciò potrebbe comportare sovrapposizioni di picchi di istogramma, che rendono difficili, se non impossibili, i calcoli richiesti e l'interpretazione dei dati.Sarà importante ottimizzare i test di citotossicità in vivo per quantificare le funzioni dell'effettore suscitate da diversi tipi di cellule killer che riconoscono antigeni peptidici e non peptidici nello stesso ospite.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitivo saggi Homing allo Studio Gut-tropico Migrazione cellulare T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

L&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Il trapianto di coda della pelle per studiare allogenico di cellule T CD4 risposte in topi

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Un protocollo di aspirazione Blister per studiare T-cellula umana richiamo Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...