Name: tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses
Uploaded: 2019-05-06T15:00:00
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この作業は、カナダ医療研究機関 (CIHR) 助成金130465と PJT-156295 によってサポートされました SMMH。JC さんは、オンタリオ州の研修、大学、大学から科学技術分野の研究者であるクイーン・エリザベス二世によって部分的に支持されています。CEM は、カナダの自然科学および工学研究評議会 (NSERC) からアレクサンダー・グラハム・ベル・カナダ奨学生 (博士) の受賞者でした。

ここに記載された実験は、機関団体が承認し、確立された国家ガイドラインに従う動物使用プロトコルに従っています。
1. T Ag 発現腫瘍細胞を用いた C57BL/6 マウスの接種
<ol><li>4.5 g/L D-グルコースおよび L-グルタミン (1x) でダルベッコ改変の修飾イーグル培地 (DMEM) で SV40 形質転換線維肉腫細胞株 C57SV (または類似の T Ag+接着細胞株) を増殖させ、1 mM のピルビン?...

<ol>
	<li>Yewdell, J. W., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+in+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+T+lymphocyte+responses.">Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses.</a> Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+in+the+immunodominance+hierarchy+in+secondary+CD8++T+cell+responses+to+influenza+A+virus:+roles+for+cross-presentation+and+lysis-independent+immunodomination.">Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).</li><li>Otahal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+cross-presentation+limits+the+CD8++T+cell+response+to+a+subdominant+tumor+antigen+epitope.">Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope.</a> The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).</li><li>Lauron, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+induces+immunodomination+in+the+presence+of+viral+MHC+class+I+inhibition.">Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).</li><li>Crowe, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+presentation+regulates+the+changing+patterns+of+CD8++T+cell+immunodominance+in+primary+and+secondary+influenza+virus+infections.">Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).</li><li>Probst, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+of+an+antiviral+cytotoxic+T+cell+response+is+shaped+by+the+kinetics+of+viral+protein+expression.">Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression.</a> The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).</li><li>Gileadi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immunodominant+CTL+epitope+is+affected+by+proteasome+subunit+composition+and+stability+of+the+antigenic+protein.">Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein.</a> The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).</li><li>Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+proteasomes+function+to+increase+viral+peptide+diversity+and+broaden+antiviral+CD8++T+cell+responses.">Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses.</a> The Journal of Immunology. 191 (1), 52-59 (2013).</li><li>Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+affinity,+peptide+liberation,+T+cell+repertoire,+and+immunodominance+all+contribute+to+the+paucity+of+MHC+class+I-restricted+peptides+recognized+by+antiviral+CTL.">MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL.</a> The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).</li><li>Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinant+selection+of+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+antigenic+peptides+is+explained+by+class+I-peptide+affinity+and+is+strongly+influenced+by+nondominant+anchor+residues.">Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues.</a> The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).</li><li>Kotturi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+precursor+frequencies+and+MHC+binding+rather+than+the+degree+of+epitope+diversity+shape+CD8++T+cell+immunodominance.">Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance.</a> The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).</li><li>Haeryfar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+deoxynucleotidyl+transferase+establishes+and+broadens+antiviral+CD8++T+cell+immunodominance+hierarchies.">Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies.</a> The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).</li><li>Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+immunodominance+hierarchies+of+influenza+A+virus-specific+H-2(b)-restricted+CD8++T+cells+in+the+absence+of+terminal+deoxynucleotidyl+transferase.">Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase.</a> Immunological Investigations. 37 (7), 714-725 (2008).</li><li>Kedl, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+compete+for+access+to+antigen-bearing+antigen-presenting+cells.">T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).</li><li>Kastenmuller, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-competition+of+CD8++T+cells+shapes+the+immunodominance+hierarchy+during+boost+vaccination.">Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).</li><li>Memarnejadian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Promotes+Epitope+Spreading+in+Anticancer+CD8(+)+T+Cell+Responses+by+Preventing+Fratricidal+Death+of+Subdominant+Clones+To+Relieve+Immunodomination.">PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).</li><li>Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+CD8++T+cell+responses+induced+by+direct+priming+and+cross-priming+and+moderate+immunodominance+disparities.">Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities.</a> The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).</li><li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+immunodominant+antitumor+and+antiviral+CD8++T+cell+responses+by+indoleamine+2,3-dioxygenase.">Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase.</a> PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).</li><li>Maleki Vareki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+simultaneous+antitumor+and+alloreactive+CD8(+)+T-cell+responses+in+the+same+host+by+rapamycin.">Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin.</a> American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).</li><li>Irvine, K., Bennink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+immunodominance+hierarchies+in+TCD8++-mediated+antiviral+responses.">Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).</li><li>Grossmann, M. E., Davila, T., Celis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+tolerance+against+prostatic+antigens+with+subdominant+peptide+epitopes.">Avoiding tolerance against prostatic antigens with subdominant peptide epitopes.</a> Journal of Immunotherapy. 24 (3), 237-241 (2001).</li><li>Schreiber, H., Wu, T. H., Nachman, J., Kast, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+and+tumor+escape.">Immunodominance and tumor escape.</a> Seminars in Cancer Biology. 12 (1), 25-31 (2002).</li><li>Mylin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+CD8(+)+T-lymphocyte+responses+to+multiple+epitopes+from+simian+virus+40+(SV40)+large+T+antigen+in+C57BL/6+mice+immunized+with+SV40,+SV40+T-antigen-transformed+cells,+or+vaccinia+virus+recombinants+expressing+full-length+T+antigen+or+epitope+minigenes.">Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).</li><li>Fu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoplasmic+reticulum-targeting+signal+sequence+enhances+the+immunogenicity+of+an+immunorecessive+simian+virus+40+large+T+antigen+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope.">An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+of+CD8++T+cells+by+viral+and+tumor+antigens+is+a+robust+phenomenon.">Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon.</a> European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).</li><li>Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Alloantibody-Mediated+Cytotoxicity+In+Vivo.">Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo.</a> Transplantation. 100 (5), 1041-1051 (2016).</li><li>Aichele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+antigen+treatment+of+naive+and+virus-immune+mice:+antigen-specific+tolerance+versus+immunopathology.">Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology.</a> Immunity. 6 (5), 519-529 (1997).</li><li>Oehen, S., Brduscha-Riem, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+naive+CTL+to+effector+and+memory+CTL:+correlation+of+effector+function+with+phenotype+and+cell+division.">Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division.</a> The Journal of Immunology. 161 (10), 5338-5346 (1998).</li><li>Coles, R. M., Mueller, S. N., Heath, W. R., Carbone, F. R., Brooks, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+armed+CTL+from+draining+lymph+node+to+spleen+shortly+after+localized+infection+with+herpes+simplex+virus+1.">Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 834-838 (2002).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> The Journal of Immunology. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Meilleur, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+superantigens+expand+and+activate,+rather+than+delete+or+incapacitate,+preexisting+antigen-specific+memory+CD8++T+cells.">Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Goldszmid, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+charged+with+apoptotic+tumor+cells+induce+long-lived+protective+CD4++and+CD8++T+cell+immunity+against+B16+melanoma.">Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).</li><li>Oberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+or+mismatch+of+MHC+class+I+is+sufficient+to+trigger+NK+cell-mediated+rejection+of+resting+lymphocytes+in+vivo+-+role+of+KARAP/DAP12-dependent+and+-independent+pathways.">Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways.</a> European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).</li><li>Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+cytotoxicity+by+invariant+NKT+cells+in+vivo+is+CD95/CD178-dependent+and+is+correlated+with+antigenic+potency.">Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency.</a> The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).</li><li>Brinster, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+harboring+SV40+T-antigen+genes+develop+characteristic+brain+tumors.">Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors.</a> Cell. 37 (2), 367-379 (1984).</li><li>Tatum, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+targeting+a+single+immunodominant+epitope+are+sufficient+for+elimination+of+established+SV40+T+antigen-induced+brain+tumors.">CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors.</a> The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).</li><li>Schell, T. D., Tevethia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+advanced+choroid+plexus+tumors+in+SV40+T+antigen+transgenic+mice+following+priming+of+donor+CD8(+)+T+lymphocytes+by+the+endogenous+tumor+antigen.">Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen.</a> The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).</li><li>Greenberg, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+in+a+transgenic+mouse.">Prostate cancer in a transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).</li></ol>

CFSE ベースの細胞傷害アッセイは、放射性クロム (51Cr) 放出および比色乳酸脱水素酵素 (LDH) 放出アッセイなどの従来の殺滅アッセイに比べていくつかの利点を提供する。第1に、構造的に無傷な二次リンパ器官内での CTL 機能のモニタリングを可能にする。
第2に、インビボ細胞傷害性アッセイにおける標的細胞の特異的殺傷は、Ag 特異的 Tcd8の絶対数を反?...

従来の CD8+ T 細胞 (TCD8) は抗癌免疫監視において重要な部分を再生する。それらは主として、主要な組織適合性複合体 (MHC) クラス I 分子の閉鎖間隙内に表示される腫瘍特異的または関連するペプチド抗原 (Ags) を認識する細胞溶解 T リンパ球 (CTLs) の能力において機能する。完全に武装した CTLs は、細胞傷害性兵器庫を利用して悪性セルを破壊する。抗癌性 TCD8は、循環中に、あるいは多くの癌患者および腫瘍担持する動物の原発性および転移性の塊の中で検出することができる。しかし、彼らはしばしば anergic または枯渇し、癌の根絶に失敗します。したがって、多くの免疫療法モダリティは、抗癌 TCD8周波数を増加させ、それらの機能を回復し、後押しするように設計されています。
腫瘍タンパク質は多くのペプチドを immunoprotective し、そのうちのいくつかは免疫原性および潜在的に可能性がある。しかし、定量化可能な TCD8応答は、少数のペプチドに対してのみ様々な大きさで惹起される。これは、TCD8クローン1の間で「immunodominance 階層」を作成する。したがって、immunodominant (ID) TCD8は、顕著な階層ランクを占め、これは一般的にその豊かさによって判断される。対照的に、t 細胞受容体 (TCR) が音 (SD) エピトープに特異的である TCD8細胞は、より低い周波数で起こる。我々および他の人々は、TCD8応答において immunodominance を指示または形成するいくつかの因子を同定した。これらには、とりわけ、ナイーブ TCD8に対する Ag 提示のモード (すなわち、直接提示、クロスプレゼンテーション、クロスドレッシング)2、3、4、ag 提示細胞の種類 (apc)TCD8活性化5に参加して、タンパク質 Ags6,7の豊かさと安定性と、プロテアソーム7,8によるそれらの分解の効率および動態とを、ペプチド9の Ag 処理 (TAP) に関連するトランスポーターの相対選択性は、MHC I 分子9、10に対する遊離ペプチドの親和性、存在、前駆体頻度および TCR 多様性のt 細胞プール11、12、13における同族 tcd8 、apc14、15、および tCD8の fratricidal 能力にアクセスするための t 細胞間の交差競合クローン16加えて、TCD8 immunodominance は、天然に存在する調節性 t (nTreg) 細胞17などのいくつかのサプレッサー細胞型によって媒介される免疫調節機構を受け、細胞表面共阻害分子プログラム死− 1 (PD − 1)16、及び indoleamine 2、3−ジオキシゲナーゼ (イド)18及び哺乳動物用ラパマイシンの哺乳類標的 (mTOR) などの特定の細胞内酵素が19である。ただし、上記の要因が常に immunodominance を考慮しているわけではないことに注意することが重要です。
TCD8 immunodominance の基礎生物学とは別に、この興味深い現象の検査は、がん免疫学と免疫療法において重要な意味を持っています。第1に、ID ステータスは、必ずしも所与の TCD8クローンが腫瘍開始または進行20を予防する能力を与えるとは限らない。どのように、どのように ID と SD TCD8が抗腫瘍免疫に寄与するかは、悪性腫瘍の種類と程度、および使用される実験系に依存する可能性があります。第2に、ID TCD8クローンが免疫系に対して「あまりにも見えない」可能性があり、結果的に中枢および/または末梢寛容機構16,21になりやすいと考えられる。第3に、heterogeneic 腫瘍は、多くの場合には検出を回避する新生細胞を含んでいてもよく、ほとんどではないにしても、CTLs はペプチドの狭いスペクトルのみを表示することによって、MHC 複合体。これらの状況下では、不十分な幅の TCD8応答は、このような腫瘍細胞を生存の利点とする余裕があり、従ってそれらの伸長22を増強する。それは、多くの見方が、TCD8ベースのワクチン接種と癌に対する治療を成功させるためのハードルとして immunodominance ことである。
C57BL/6 マウスをサルウイルス 40 (SV40) で接種すると、大規模な腫瘍 Ag (T Ag) を発現する形質転換細胞は、TCD8 immunodominance を研究する強力な前臨床システムを提供する。このモデルは、いくつかの利点を提供します。第1に、この臨床的に関連するあるのペプチドエピトープは、このマウス株23においてよく特徴付けられる (表 1)。第二に、サイト I、II/III、IV、および V と呼ばれる T Ag エピトープは、以下の階層順序で一貫して配列されている TCD8応答をトリガします: サイト iv > > サイト I ≥サイト II/III > &Gt; サイト V。したがって、サイト Iv 特異的 TCD8T Ag に最も堅牢な応答をマウントします。対照的に、部位 I および II/III は音であり、そして部位 V 特異的な TCD8は、少なくとも豊富であり、通常、他のエピトープ23、24に対する応答性がない場合にのみ検出可能である。第3に、本明細書に記載のプロトコールにおいて利用される T Ag+腫瘍細胞株、すなわち C57SV 線維肉腫細胞、およびこれまでの調査で用いられたものは16、17、18、19 、25、26、サブゲノミック SV40 フラグメント25で形質転換される。したがって、それらは、宿主 Apc に感染する可能性のある SV40 ビリオンをアセンブルおよび放出することができない。さらに、C57SV 細胞は、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、および CD137 リガンド (4-1BBL)16などの古典的な増強分子を欠いている。上記の属性は、これらの線を交差プライミングによるインビボ TCD8活性化の検査に理想的にする。交差プライミングは、TCD8応答を誘導することにおける主要な経路であり、特に、直接素数 t 細胞25に失敗する非造血起源の腫瘍細胞に対して発射されるものである。
抗腫瘍性 TCD8の頻度および/または機能は、MHC I 四量体染色によってモニタリングすることができ、エフェクターサイトカインに対する細胞内染色 (例えば、インターフェロン [IFN]-γ) または溶菌分子 (例えば、パーフォリン)、酵素結合 Immunospot (ELISpot) アッセイおよび exインビボ細胞傷害性アッセイ。1990年代に開始されて以来、27,28, carboxyfluorescein succinimidyl エステル (CFSE)-インビボで殺害アッセイは、抗ウイルスによって媒介される細胞傷害性応答の評価を可能にした CTLs29,30,31、抗腫瘍性 CTLs16、32、ナチュラルキラー (NK) 細胞33、糖脂質反応性不変のナチュラルキラー T (iNKT) 細胞34、および、既存および de novo ドナー特異的同種抗体26。したがって、それらのアプリケーションは、腫瘍免疫学および免疫療法、抗病原体免疫、および予防および治療ワクチン設計の分野で働く研究者を含むが、これらに限定されない幅広い読者にとって興味深いものとなり得る。
典型的なシナリオにおける細胞媒介性細胞毒性を評価するために、無関係な Ag または同族 Ag のいずれかを表示するナイーブ脾細胞の2つの集団は、CFSE の2つの異なる用量で標識され、等しい数で混合し、ナイーブ (コントロール) またはキラーに注入する細胞を宿すマウス。次に、各ターゲット母集団の有無がフローサイトメトリーによって検査されます。
我々は、抗ウイルスおよび抗腫瘍性 TCD8応答の両方における immunodominance に関する研究において、最適化されており、インビボ殺害アッセイを行った12、16、17。ここでは、ID および SD TCD8応答の同時評価のための詳細なプロトコールを、他の実験系における同様の調査のために容易に採用することができる t Ag エピトープに提供する。我々はまた、nTreg 細胞枯渇および PD-1 遮断が、それぞれ ID Tcd8-および SD Tcd8誘発性細胞毒性を選択的に増強できることを示す代表的な結果を提供する。最後に、in vivo での殺滅アッセイとその固有の制限について、複数の利点について説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:872px;" width="871">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">25200-056</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFSE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-150</td>
			<td>Heat-inactivate prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock is 100X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2)</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0116-01</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone HRPN)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0088</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone TNP6A7)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG2a (clone 2A3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0089</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM final concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses

Carboxyfluorescein succinimidyl エステル (CFSE)-インビボ細胞傷害性アッセイは、腫瘍および病原体由来ペプチドに対して惹起される CD8+細胞溶解 T リンパ球 (CTL) 応答の高感度かつ正確な定量を可能にする。従来の殺滅アッセイよりもいくつかの利点があります。第1に、それらは、構造的に無傷の二次的なリンパ系器官内の CTL 媒介性細胞毒性のモニタリングを可能にし、典型的には脾臓にある。第2に、それらは CTL 応答のプライミング、エフェクターおよびリコール段階における機械的な研究を可能にする。第三に、彼らは真の in vivo の設定でワクチン/薬効試験のための有用なプラットフォームを提供します。ここで、我々は、モデル腫瘍抗原 (Ag) の複数のペプチドエピトープに対する付随する CTL 応答の検査のために最適化されたプロトコルを提供し、即ち、シミアンウイルス 40 (SV40) −大 T Ag (T Ag) をコードした。他のほとんどの臨床的に関連した腫瘍蛋白質のように、T Ag は多くの潜在的に免疫原性ペプチドを港湾する。しかし、このようなペプチドは、C57BL/6 マウスにおいて検出できる CTL 応答を誘導するものは4つだけである。これらの応答は、その大きさに基づいて一貫して階層的に配列されており、この強力なシステムにおいて TCD8 「immunodominance」の基礎をなす。したがって、T Ag 特異的 TCD8応答の大部分は、単一の immunodominant エピトープに対して集束され、他方の3つのエピトープは認識され、弱くしか応答しない。Immunodominance は、抗腫瘍性 TCD8応答の幅を妥協し、癌に対する予防接種を成功させるための障害として多くの人に考えられています。したがって、TCD8 immunodominance を規定または形状する細胞および分子因子および機構を理解することが重要である。ここで述べるプロトコールは、T Ag 免疫モデルにおけるこの現象の調査に合わせたものであるが、他の腫瘍モデルにおいても同様の研究に容易に改変および拡張することができる。我々は、実験的免疫療法介入の影響が in vivo の細胞傷害性アッセイを使用して測定できる方法の例を提供する。

その結果が図 1に示された実験の目的は、nTreg 細胞の存在および機能が t Ag 特異的 tCD8の immunodominance 階層を形成または変化させるかどうかを決定することであった。C57BL/6 マウスを PBS または 0.5 mg の抗 CD25 mAb (クローン PC-61.5.3 [PC61]) で4日目に 2 x 106 C57SV 腫瘍細胞を受信した。別々の実験において、ラット IgG1 アイソタイプコントロールが PBS の代わりに...

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Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

ここでは、モデル腫瘍抗原に対する細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) 応答における immunodominance の検査を可能にする、フローサイトメトリーベースのインビボ殺傷アッセイについて述べる。このエレガントなアッセイが、機械的な研究や薬効試験にどのように使用されるかの例を示します。

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

このアッセイは、腫瘍抗原の2つの異なるペプチドエピトープに対するT細胞介在細胞傷害性を同時に定量するために使用することができる。このアッセイのin vivoの性質により、T細胞の細胞傷害機能を二次リンパ器官の無傷のアーキテクチャ内で測定することができます。さらに、観察された殺死は、その頻度だけでなく、T細胞の絶対数を正確に反映しており、誤解を招く可能性があります。このアッセイは、免疫支配性およびサブドミナント腫瘍抗原に対する細胞傷害性T細胞応答の検査を可能にする。したがって、ワクチンを設計する際に貴重な情報を提供し、がんの免疫療法プロトコルを提供します。私達のプロトコルはCD8 T細胞応答を研究するために合わせられた。しかし、NK細胞や先天性Tリンパ球などの他のキラー細胞タイプによって引き起こされる細胞毒性を測定するように改変することができる。このアッセイは、無菌技術、マウス組織処理、標的細胞準備、ならびに尾静脈注射の専門知識の経験を必要とする。インビボ殺しアッセイを試みる前に、このスキルセットを取得する必要があります。T抗原陽性付着性腫瘍細胞株が完全にコンフルまたはわずかに過剰にコンフルエントになったら、滅菌、温かいPBSで単層を穏やかにすすい、バイオセーフティキャビネット内の0.25%トリプシンEDTAで腫瘍細胞を取り外します。培養フラスコの側面を数回タップして残存細胞を放出し、5ミリリットルのDMEM培地を添加して約5分後に反応を停止させた。70マイクロメートルの孔細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐チューブに細胞懸濁液を濾過する前に、細胞溶液を数回ピペット。遠心分離によって細胞を収集し、同じ条件下で3回の最初の滅菌、冷たいPBSの10ミリリットルでペレットを再懸濁する。3回目の洗浄後、細胞を無菌PBS濃度のミリリットル当たり7個の細胞に4倍10回再懸濁し、6~12週齢のC57ブラック6マウスレシピエントのそれぞれに腹腔内に500マイクロリットルのT抗原陽性腫瘍細胞懸濁液を注入する。標的脾細胞製剤の場合は、安楽死させたドナーマウスを起こしやすい位置に置き、動物に70%エタノールを噴霧する。無菌鉗子とはさみを使用して、皮膚を持ち上げ、小さな腹側正線切開を行います。腹骨を露出させるために十字架のような方法で皮膚をカットし、内臓のいずれかをキャッチすることなく、テントのような方法で腹部を引き上げるために鉗子を使用しています。腹膜を切り開いて腹腔を露出させ、5ミリリットルの無菌PBSを含む15ミリリットルのダウンス組織粉砕機に脾臓を穏やかに移す。プランジャーを使用して、脾臓組織が赤い均質な細胞懸濁液に消散するまで手動圧力をかけ、ホモゲン酸を15ミリリットルのチューブに移します。遠心分離によって懸濁液を回収し、赤血球を排除するために塩化アンモニウムリシンバッファーの4ミリリットルでペレットを再懸濁します。4分後、8ミリリットルの完全な培地でプロセスを停止し、70マイクロメートル孔細胞ストレーナーを介して新しい50ミリリットルチューブに細胞懸濁液を濾過します。遠心分離によって赤血球の破片から白血球を分離し、完全な培地の12ミリリットルでペレットを再懸濁する。その後、脾細胞懸濁液を3つの等しい4ミリリットルのアリコートに分割する。標的脾細胞のペプチドコードの場合、無関係なペプチドの1つのマイクロモル、サイトIペプチドの1つのマイクロモルを持つ1つのアリコート、および37°Cと5%の二酸化炭素で1時間のサイトIVペプチドの1つのマイクロモルを持つ1つのアリコートを1つの脾細胞アリコートをパルスする。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって余分なペプチドを除去し、ペプチドパルス脾細胞を12ミリリットルの滅菌で2回洗浄し、1回の洗浄1回の冷たいPBSを洗浄する。2回目の洗浄後、チューブ当たりの新鮮な無菌PBSの4ミリリットルで細胞を再懸濁する。025、0.25、および2マイクロモルCFSEを無関係な部位Iおよび部位IVペプチドパルス脾細胞懸濁液にそれぞれ加える。5分に1回手動反転で15分間、37°Cでチューブを置きます。インキュベーションの終わりに、各チューブに熱不活化胎児ウシ血清3ミリリットルを加えてCFSE反応を停止し、各チューブの最終体積をPBSで最大15ミリリットルにします。次に、1回の洗浄ごとに12ミリリットルの新鮮な無菌PBSで2回の洗浄に対して遠心分離によって色素標識細胞を収集します。標的脾細胞の適切なCFSE標識を確認するために、PBSの3ミリリットルでペレットを再懸濁し、穏やかな渦と混合する。各CFSE標識された細胞懸濁液から10マイクロリットルを、PBSを含む個々の5ミリリットルの丸いポリステイン・ポリステレン・アクティベート・セル・ソーティング、またはFACSチューブに移し、488ナノメートルのレーザーを搭載したフローサイトメーターにチューブをロードします。フローサイトメーターソフトウェアでは、蛍光1チャネルのリンパ球ゲート内に5,000個の事象を獲得する前に、細胞の前方散乱および側面散乱特性に基づいてリンパ球ゲートを作成します。親 CFSE 陽性母集団内で、追加のヒストグラム・ゲートを描画して、CFSE 低、CFSE 中間、および CFSE 高のサブ人口を識別します。次に、ラベル付きセルの他の 2 つのチューブについて、3 つのゲート内で等しいイベント番号またはほぼ等しいイベント番号を確認します。ターゲット細胞の注入の場合、まずソースチューブを穏やかに渦を流し、3つのCFSE標識細胞懸濁液を等しい比率で新しいチューブにプールします。チューブの内容物を無菌PBSで上げ、カウント用遠心分離によって細胞を収集します。次に、レシピエント濃度あたり200マイクロリットル当たり7個の混合標的細胞に10倍の体積を調整し、各レシピエントC57 Black6マウスの尾静脈に細胞懸濁液の200マイクロリットル量を注入する。注射の2〜4時間後、各レシピエント動物の脾臓を除去して処理し、脾臓当たり3ミリリットルのPBSで単離した白血球を再中断する。各処理された脾臓から7つの細胞に約10回を清浄なFACSチューブに移し、CFSE低、中間、および高ターゲット細胞集団をゲートするように示すように、フローサイトメーター上の細胞をすぐに実行します。次に、蛍光1チャネルで合計2,000 CFSE低イベントを取得し、テキストに詳述された式に従って各同種標的細胞集団の特異的なリシスを計算する。本代表的実験では、抗CD25モノクローナル抗体を注射したマウスにおける天然の調節性T細胞の枯渇の成功がフローサイトメトリーによって確認された。予想通り、対照および同結合標的細胞に対応するほぼ等しいピークは、ナイーブマウスで検出可能であった。対照的に、サイト-IVディスプレイ標的細胞は、抗CD25モノクローナル抗体またはPBSによる前処理に関係なく、T-抗原プライミングマウスにほぼ完全に存在しなかった。興味深いことに、インビボ細胞傷害性Tリンパ球媒介性標的細胞の抗CD25モノクローナル抗体による天然のT reg細胞枯渇。この2番目の代表的な調査では、プログラムされた死1遮断は、サブ支配的なCD8陽性T細胞部位1および2スラッシュ3特異的応答を強化し、プログラムされた死1/プログラム死リガンド1相互作用を妨害すると、抗癌CD8陽性T細胞応答におけるエピトープ拡散を誘発する可能性があることを示唆している。ドナー細胞にCFSEでラベリングをする際には、濃度が正確であることを確認することが重要です。そうしないと、ヒストグラムのピークが重なり合う可能性があり、必要な計算やデータ解釈が困難になる可能性があります。同じ宿主内のペプチドおよび非ペプチド抗原を認識する異なるキラー細胞型によって引き出されるエフェクター機能を定量化するために、生体内細胞毒性アッセイを最適化することが重要です。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

腸管指向性T細胞の移動を研究するために競争力のあるホーミングアッセイ

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...