Name: tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses
Uploaded: 2019-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (CIHR) concede MOP-130465 e PJT-156295 para SMMH. JC é parcialmente apoiado por uma rainha Elizabeth II bolsa de pós-graduação em ciência e tecnologia do Ministério de formação, faculdades e universidades de Ontário. CEM foi um receptor de uma bolsa de pós-graduação Alexander Graham Bell Canada (doutorado) do Conselho de ciências naturais e engenharia de pesquisa do Canadá (NSERC).

Os experimentos aqui descritos seguem protocolos de uso animal aprovados por entidades institucionais e aderentes às diretrizes nacionais estabelecidas.
1. inoculação de C57BL/6 camundongos com T AG-expressando células tumorais
<ol><li>Cresça a linha celular SV40 do fibrosarcoma C57SV (ou uma linha celular similar de T AG+ aderente) no meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/l D-glucose e l-Glutamine (1x) e suplementado com 1 milímetro piruvato de sódio e 10%...

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	<li>Yewdell, J. W., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+in+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+T+lymphocyte+responses.">Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses.</a> Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+in+the+immunodominance+hierarchy+in+secondary+CD8++T+cell+responses+to+influenza+A+virus:+roles+for+cross-presentation+and+lysis-independent+immunodomination.">Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).</li><li>Otahal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+cross-presentation+limits+the+CD8++T+cell+response+to+a+subdominant+tumor+antigen+epitope.">Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope.</a> The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).</li><li>Lauron, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+induces+immunodomination+in+the+presence+of+viral+MHC+class+I+inhibition.">Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).</li><li>Crowe, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+presentation+regulates+the+changing+patterns+of+CD8++T+cell+immunodominance+in+primary+and+secondary+influenza+virus+infections.">Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).</li><li>Probst, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+of+an+antiviral+cytotoxic+T+cell+response+is+shaped+by+the+kinetics+of+viral+protein+expression.">Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression.</a> The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).</li><li>Gileadi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immunodominant+CTL+epitope+is+affected+by+proteasome+subunit+composition+and+stability+of+the+antigenic+protein.">Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein.</a> The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).</li><li>Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+affinity,+peptide+liberation,+T+cell+repertoire,+and+immunodominance+all+contribute+to+the+paucity+of+MHC+class+I-restricted+peptides+recognized+by+antiviral+CTL.">MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL.</a> The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).</li><li>Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinant+selection+of+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+antigenic+peptides+is+explained+by+class+I-peptide+affinity+and+is+strongly+influenced+by+nondominant+anchor+residues.">Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues.</a> The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).</li><li>Kotturi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+precursor+frequencies+and+MHC+binding+rather+than+the+degree+of+epitope+diversity+shape+CD8++T+cell+immunodominance.">Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance.</a> The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).</li><li>Haeryfar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+deoxynucleotidyl+transferase+establishes+and+broadens+antiviral+CD8++T+cell+immunodominance+hierarchies.">Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies.</a> The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).</li><li>Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+CD8++T+cell+responses+induced+by+direct+priming+and+cross-priming+and+moderate+immunodominance+disparities.">Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities.</a> The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).</li><li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+immunodominant+antitumor+and+antiviral+CD8++T+cell+responses+by+indoleamine+2,3-dioxygenase.">Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase.</a> PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).</li><li>Maleki Vareki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+simultaneous+antitumor+and+alloreactive+CD8(+)+T-cell+responses+in+the+same+host+by+rapamycin.">Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin.</a> American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).</li><li>Irvine, K., Bennink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+immunodominance+hierarchies+in+TCD8++-mediated+antiviral+responses.">Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).</li><li>Grossmann, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+CD8(+)+T-lymphocyte+responses+to+multiple+epitopes+from+simian+virus+40+(SV40)+large+T+antigen+in+C57BL/6+mice+immunized+with+SV40,+SV40+T-antigen-transformed+cells,+or+vaccinia+virus+recombinants+expressing+full-length+T+antigen+or+epitope+minigenes.">Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).</li><li>Fu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoplasmic+reticulum-targeting+signal+sequence+enhances+the+immunogenicity+of+an+immunorecessive+simian+virus+40+large+T+antigen+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope.">An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+of+CD8++T+cells+by+viral+and+tumor+antigens+is+a+robust+phenomenon.">Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon.</a> European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).</li><li>Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+superantigens+expand+and+activate,+rather+than+delete+or+incapacitate,+preexisting+antigen-specific+memory+CD8++T+cells.">Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Goldszmid, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+charged+with+apoptotic+tumor+cells+induce+long-lived+protective+CD4++and+CD8++T+cell+immunity+against+B16+melanoma.">Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).</li><li>Oberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+or+mismatch+of+MHC+class+I+is+sufficient+to+trigger+NK+cell-mediated+rejection+of+resting+lymphocytes+in+vivo+-+role+of+KARAP/DAP12-dependent+and+-independent+pathways.">Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways.</a> European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).</li><li>Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+cytotoxicity+by+invariant+NKT+cells+in+vivo+is+CD95/CD178-dependent+and+is+correlated+with+antigenic+potency.">Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency.</a> The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).</li><li>Brinster, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+harboring+SV40+T-antigen+genes+develop+characteristic+brain+tumors.">Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors.</a> Cell. 37 (2), 367-379 (1984).</li><li>Tatum, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+targeting+a+single+immunodominant+epitope+are+sufficient+for+elimination+of+established+SV40+T+antigen-induced+brain+tumors.">CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors.</a> The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).</li><li>Schell, T. D., Tevethia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+advanced+choroid+plexus+tumors+in+SV40+T+antigen+transgenic+mice+following+priming+of+donor+CD8(+)+T+lymphocytes+by+the+endogenous+tumor+antigen.">Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen.</a> The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).</li><li>Greenberg, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+in+a+transgenic+mouse.">Prostate cancer in a transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).</li></ol>

Os ensaios de citotoxicidade in vivo baseados em CFSE oferecem várias vantagens em relação aos ensaios de matança tradicionais, como o cromo radioativo (51CR) e os ensaios de liberação de lactato desidrogenase colorimétrica (LDH). Primeiramente, permitem a monitoração da função de CTL dentro de um órgão lymphoid secundário arquitetonicamente intacto.
Em segundo lugar, o assassinato específico de células-alvo em ensaios de citotoxicidade in vivo reflete o número abso...

Células t CD8+ convencionais (tCD8) desempenham partes importantes na vigilância imune anticâncer. Eles funcionam principalmente na capacidade de linfócitos T citolíticos (CTLs) que reconhecem antígenos de peptídeos específicos do tumor ou associados (AGS) exibidos dentro da fenda fechada das moléculas de classe I do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). CTLs totalmente armados utilizam seu arsenal citotóxico para destruir células malignas. O anticâncer TCD8 pode ser detectado na circulação ou mesmo dentro de massas primárias e metastáticas de muitos pacientes com câncer e animais portadores de tumor. No entanto, muitas vezes são anérgicos ou esgotados e não conseguem erradicar o cancro. Portanto, muitas modalidades imunoterapêuticas são projetadas para aumentar as frequências TCD8 anticâncer e para restaurar e impulsionar suas funções.
As proteínas tumorais abrigam muitos peptídeos, alguns dos quais podem ser imunogênicos e potencialmente imunoprotetores. Entretanto, as respostas TCD8 quantificáveis são eliciadas com magnitudes variáveis contra poucos peptídeos. Isso cria uma "hierarquia de imunodominância" entre os clones TCD8 1. Consequentemente, o imunodominante (ID) TCD8 ocupa fileiras hierárquicas proeminentes, que é julgada geralmente por sua abundância. Em contraste, células TCD8 cujo receptor de célula t (TCR) é específico para epítopos SUBDOMINANTES (DP) ocorrem em freqüências mais baixas. Nós e outros identificamos alguns dos fatores que ditam ou formam a imunodominância em respostas TCD8 . Estes incluem, entre outros, a modalidade da apresentação do AG ao TCD8 ingênuo (isto é, apresentação direta, Cruz-apresentação, cross-dressing)2,3,4, o tipo de pilhas AG-apresentando (APCs) participando da ativação TCD8 5, a abundância e estabilidade de proteínas AGS 6,7 e a eficiência e cinética de sua degradação por proteasomas7,8, o seletividade relativa do transportador associada ao processamento de AG (TAP) parapeptídeos9, a afinidade de peptídeos liberados para moléculas de MHC I9,10, a presença, as frequências precursoras e a diversidade de TCR de cognato tCD8 em pools de células t11,12,13, Cross-Competition entre as células t para acesso a APCs14,15, e a capacidade fratricida de TCD8 dos clones16. Além disso, a imunodominância TCD8 é submetida a mecanismos imunoregulatórios mediados por vários tipos de células supressoras, tais como células t regulatórias de ocorrência natural (ntreg)17, a molécula de superfície celular co-inibitória programada óbito-1 (PD-1)16, e certas enzimas intracelulares como a indolamina 2,3-dioxigenase (ido)18 e o alvo de mamíferos de rapamicina (mTOR)19. É importante notar, no entanto, que os fatores acima nem sempre respondem totalmente à imunodominância.
Aparte da biologia básica do immunodominance de TCD8 , a examinação deste fenômeno intrigante tem implicações importantes na imunologia e na imunoterapia do cancro. Primeiramente, um status da identificação não confere necessariamente em cima de um clone dado de TCD8 a habilidade de impedir a iniciação ou a progressão do tumor20. Se e como a identificação e o SD TCD8 contribuem à imunidade antitumoral podem depender do tipo e da extensão da malignidade e do sistema experimental empregado. Em segundo lugar, acredita-se que os clones de ID TCD8 podem ser "muito visíveis" para o sistema imunológico e, consequentemente,mais propensos a mecanismos de tolerância central e/ou periférica,16,21. Em terceiro lugar, os tumores heterogênicos podem conter as pilhas neoplásticas que evitam a deteção por muitos, se não a maioria, CTLs indicando somente um espectro estreito dos complexos do peptide: MHC. estas circunstâncias, as respostas de TCD8 da amplitude insuficiente são prováveis ter recursos para tais pilhas do tumor uma vantagem da sobrevivência, assim potenciando seu conseqüência22. É pelas razões acima que muitos a imunodominância da vista como um obstáculo ao sucesso TCD8-baseou a vacinação e as terapias de encontro ao cancro.
A inoculação de camundongos C57BL/6 com vírus Simian 40 (SV40)-células transformadas que expressam grande tumor AG (T AG) fornece um poderoso sistema pré-clínico para estudar imunodominância TCD8 . Este modelo oferece vários benefícios. Primeiramente, os epítopos peptídicos desta oncoproteína clinicamente relevante são bem caracterizados nesta cepa do camundongo23 (tabela 1). Segundo, os epítopos de T AG, que são chamados de sites I, II/III, IV e V, ativam as respostas TCD8 que são consistentemente organizadas na seguinte ordem hierárquica: site iv > > site i ≥ site II/iii > &Gt; site V. consequentemente, o local IV específico tCD8 montar a resposta mais robusta para T AG. Em contrapartida, os sítios I e II/III são subdominantes, e o TCD8 específico do sítio V é menos abundante e geralmente apenas detectável na ausência de responsividade a outros epítopos23,24. Em terceiro lugar, a linha celular T AG+ tumoral utilizada no protocolo aqui descrito, ou seja, células fibrosarcoma C57SV, e aquelas utilizadas em nossas investigações prévias16, 17,18,19 ,25,26, são transformados com fragmentos de SV40 subgenômica25. Conseqüentemente, são incapazes de montar e liberar os virions SV40 que poderiam potencialmente infectar APCs do anfitrião. Além disso, as células C57SV são desprovidas de moléculas coestimulatórias clássicas como CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) e CD137 ligantes (4-1BBL)16. Os atributos acima tornam estas linhas ideais para o exame de in vivo TCD8 ativação via Cross-priming. O priming cruzado é um caminho importante na indução de respostas TCD8 , especialmente aquelas lançadas contra células tumorais de origem não hematopoiética que falham diretamente em Prime as células t ingênuas25.
As frequências e/ou funções antitumorais TCD8 podem ser monitoradas pela coloração de tetrâmero de MHC I, coloração intracelular para citocinas efetoras (por exemplo, interferão [IFN]-γ) ou moléculas líticas (por exemplo, perforina), ensaios imunoenzimáticos (ELISPOT) e ex ensaios de citotoxicidade vivo. Desde a sua criação nos anos 199027,28, carboxyfluoresceína éster succinimidil (CFSE)-com base em ensaios de matança in vivo permitiram a avaliação de respostas citotóxicas mediadas por CTLs antiviral29,30 , 31, CTLs antitumoral16,32, pilhas naturais do assassino (NK)33, pilhas naturais invariantes de glycolipid-reactivas do assassino T (iNKT)34, e preexistente e de novo doador-específico dos aloanticorpos26. Conseqüentemente, suas aplicações podem ser do interesse a um Readership largo, incluindo mas não limitado aos investigadores que trabalham nas áreas da imunologia do tumor e da imunoterapia, da imunidade do antipatógeno, e do projeto preventivo e terapêutico da vacina.
Para avaliar a citotoxicidade mediada por células em cenários típicos, duas populações de esplenócitos ingênuos que exibem um AG irrelevante ou um cognato AG (s) são rotulados com duas doses diferentes de CFSE, misturadas em números iguais e injetadas em ingênuo (controle) ou assassino ratos abrigando células. A presença/ausência de cada população-alvo é então examinada por citometria de fluxo.
Temos otimizado e empregado in vivo ensaios de matança em nossos estudos sobre imunodominância em ambas as respostas antiviral e antitumoral TCD8 12,16,17. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a avaliação simultânea de respostas do ID e do SD TCD8 aos Epitopes de t AG, que podem prontamente ser adotados para investigações similares em outros sistemas experimentais. Nós igualmente fornecemos os resultados representativos que demonstram que o esgotamento da pilha de nTreg e o bloqueio PD-1 podem seletivamente realçar a citotoxicidadeCD8-induzida da identificação tCD8-e do SD t, respectivamente. No final, discutiremos várias vantagens de ensaios de matança in vivo, bem como algumas de suas limitações inerentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:872px;" width="871">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">25200-056</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFSE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-150</td>
			<td>Heat-inactivate prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock is 100X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2)</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0116-01</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone HRPN)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0088</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone TNP6A7)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG2a (clone 2A3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0089</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM final concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses

Carboxyfluoresceína éster succinimidílico (CFSE)-com base in vivo ensaios de citotoxicidade permitem a quantificação sensível e precisa de CD8+ citolítico T linfócitos (CTL) respostas eliciadas contra tumor e peptídeos derivados de patógenos. Oferecem diversas vantagens sobre ensaios tradicionais da matança. Primeiramente, permitem a monitoração do citotoxicidade CTL-negociado dentro dos órgãos lymphoid secundários arquitetonicamente intactos, tipicamente no spleen. Segundo, eles permitem estudos mecanísticos durante as fases de priming, efetor e recall de respostas CTL. Em terceiro lugar, eles fornecem plataformas úteis para testes de eficácia de vacina/drogas em um ambiente verdadeiramente in vivo. Aqui, nós fornecemos um protocolo aperfeiçoado para a examinação de respostas concomitantes do CTL de encontro a mais de um epítopo do peptide de um antígeno modelo do tumor (AG), a saber, o vírus do Simian 40 (SV40)-codificado grande T AG (T AG). Como a maioria das outras proteínas tumorais clinicamente relevantes, o T AG abriga muitos peptídeos potencialmente imunogênicos. Entretanto, somente quatro tais peptídeos induzem respostas detectáveis de CTL em camundongos C57BL/6. Estas respostas são organizadas consistentemente em uma ordem hierárquica baseada em sua magnitude, que forma a base para o "immunodominance TCD8 " neste sistema poderoso. Conformemente, a maioria da resposta t AG-específicaCD8 de t é focalizada de encontro a um único epítopo mapeado immunodominante quando os outros três epítopos forem reconhecidos e respondidos a somente fraca. A imunodominância compromete a amplitude das respostas antitumorais TCD8 e é, como tal, considerada por muitos como um impedimento para a vacinação bem-sucedida contra o cancro. Portanto, é importante compreender os fatores e mecanismos celulares e moleculares que ditam ou formam a imunodominância TCD8 . O protocolo que nós descrevemos aqui é costurado à investigação deste fenômeno no modelo da imunização de T AG, mas pode prontamente ser modificado e estendido aos estudos similares em outros modelos do tumor. Fornecemos exemplos de como o impacto das intervenções imunoterapêuticas experimentais pode ser medido usando ensaios de citotoxicidade in vivo.

O objetivo do experimento cujos resultados estão representados na Figura 1 foi determinar se a presença e as funções das células nTreg formam ou alteram a hierarquia de imunodominância de tCD8específico t AG. C57BL/6 camundongos foram injetados i.p. com PBS ou com 0,5 mgs de um CD25 mAb (clone PC-61.5.3 [PC61]) quatro dias antes de receberem 2 x 107 C57SV células tumorais i.p. Em experimentos separados, um controle de isotipo de rato IgG1 foi usado em vez de PBS...

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Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Nós descrevemos aqui um ensaio in vivo cytometry-baseado do fluxo da matança que permita a examinação do immunodominance em respostas citotóxicas do linfócito de T (CTL) a um antígeno modelo do tumor. Nós fornecemos exemplos de como este ensaio elegante pode ser empregado para estudos mecanistic e para o teste da eficácia da droga.

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Este ensaio pode ser empregado para quantificar citotoxicidade mediada por células T contra dois epítopos de peptídeos distintos de antígenos tumorais simultaneamente. A natureza in vivo deste ensaio permite que a função citotóxica das células T seja medida dentro da arquitetura intacta de um órgão linfoide secundário. Além disso, o assassinato observado é um reflexo preciso do número absoluto de células T, e não apenas de suas frequências, o que pode ser enganoso.Este ensaio permite o exame das respostas citotóxicas das células T aos antígenos tumorais imunodominantes e sub-dominantes. Portanto, fornece informações valiosas quando você está projetando uma vacina, bem como protocolos imunoterapêuticos para câncer. Nosso protocolo foi adaptado para estudar respostas de células CD8 T.No entanto, pode ser modificado para medir a citotoxicidade provocada por outros tipos de células assassinas, como células NK e linfócitos T inatas. Este ensaio requer experiência em técnica asséptica, manuseio de tecido de camundongos, preparação de células-alvo, bem como experiência em injeções de veias traseiras. É preciso adquirir esse conjunto de habilidades antes de tentar o ensaio de assassinato in vivo.Uma vez que a linha de células tumorais aderentes T-antígeno-positivo tenha se tornado totalmente confluente ou ligeiramente confluente, enxágue suavemente a monocamada com PBS estéril e quente e desprende as células tumorais com 0,25% de trippsina EDTA em um armário de biossegurança. Toque nas laterais do frasco de cultura várias vezes para liberar as células aderentes restantes, e pare a reação após cerca de cinco minutos com a adição de cinco mililitros de meio DMEM. Pipetar a solução celular algumas vezes antes de filtrar a suspensão celular através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros.Colete as células por centrifugação, e resuspenque a pelota em 10 mililitros de PBS estéril e frio para a primeira de três lavagens sob as mesmas condições. Após a terceira lavagem, resuspenque as células em quatro vezes 10 a sete células por mililitro de concentração de PBS estéril, e injete 500 microliters da suspensão celular tumoral T-antígeno positivo intraperitonealmente em cada rato C57 Black 6 de seis a 12 semanas de idade. Para a preparação do esplenócito alvo, coloque o rato doador eutanizado na posição propensa e pulverize o animal com 70% de etanol.Usando fórceps estéreis e tesouras, levante a pele e faça uma pequena incisão de linha média ventral. Corte a pele de forma transversal para expor o peritônio, e use os fórceps para puxar o peritônio de forma semelhante a uma tenda, sem pegar nenhum dos órgãos internos. Corte o peritônio para expor a cavidade peritêneo, e transfira suavemente o baço para um moedor de tecido Dounce de 15 mililitros contendo cinco mililitros de PBS estéreis.Use o êmbolo para aplicar pressão manual até que o tecido esplênico se dissipe em uma suspensão celular homogênea vermelha e transfira o homogeneado para um tubo de 15 mililitros. Colete a suspensão por centrífugação e resuspense a pelota em quatro mililitros de tampão de potássio de cloreto de amônio para eliminar os eritrócitos. Após quatro minutos, pare o processo com oito mililitros de meio completo e filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 70 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros.Separe os glóbulos brancos dos detritos dos glóbulos vermelhos por centrifugação, e resuspenque a pelota em 12 mililitros de meio completo. Em seguida, divida a suspensão do esplenócito em três alíquotas iguais de quatro mililitros. Para codificação de peptídeos dos esplenócitos alvo, pulso um aliquot de esplenócito com um micromolar de peptídeo irrelevante, um aliquot com um micromolar de peptídeo local I, e um aliquot com um micromolar de peptídeo local IV por uma hora a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono.No final da incubação, remova o excesso de peptídeo por centrifugação e lave os esplenócitos pulsados com peptídeo duas vezes em 12 mililitros de PBS frio estéril por lavagem por tubo. Após a segunda lavagem, resuspenque as células em quatro mililitros de PBS fresco e estéril por tubo. Adicione 025, 0,25 e CFSE de dois micromolares nas irrelevantes suspensões de esplenócitos pulsadas pelo local I e pelo local IV, respectivamente.Coloque os tubos a 37 graus Celsius por 15 minutos com inversão manual uma vez a cada cinco minutos. No final da incubação, adicione três mililitros de soro bovino fetal inativado a calor em cada tubo para parar a reação de CFSE e trazer o volume final em cada tubo até 15 mililitros com PBS. Em seguida, colete as células com rótulo de corante por centrifugação para duas lavagens em 12 mililitros de PBS fresco e estéril por lavagem.Para confirmar uma rotulagem CFSE adequada dos esplenócitos de destino, resuspenque a pelota em três mililitros de PBS e misture com vórtices suaves. Transfira 10 microliters de cada suspensão celular rotulada por CFSE para uma classificação celular de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros, ou tubo FACS, contendo PBS, e carregue o tubo em um citômetro de fluxo equipado com um laser de 488 nanômetros. No software do citómetro de fluxo, crie um portão de linfócitos com base nas propriedades de dispersão dianteira e dispersão lateral das células antes de adquirir 5.000 eventos que caem dentro do portão de linfócitos no canal Fluorescence 1.Dentro da população pai CFSE-positive, desenhe portões de histograma adicionais para identificar as subpopulações CFSE-low, CFSE-intermediate e CFSE-high. Em seguida, confirme um número de evento igual ou quase igual dentro dos três portões para os outros dois tubos de células rotuladas. Para a injeção das células-alvo, primeiro o vórtice suavemente os tubos de origem e acovo as três suspensões celulares rotuladas por CFSE em um novo tubo em proporções iguais.Cubra o conteúdo do tubo com PBS estéril e colete as células por centrifugação para contar. Em seguida, ajuste o volume para uma única vezes 10 para as sete células-alvo mistas por 200 microliters de PBS por concentração de receptor, e injete 200 volumes de microliter da suspensão celular na veia traseira de cada rato C57 Black 6 receptor. Duas ou quatro horas após a injeção, remova e processe o baço de cada animal receptor como demonstrado, e resuspenque os glóbulos brancos isolados em três mililitros de PBS por baço.Transfira aproximadamente uma vez 10 para as sete células de cada baço processado em um tubo FACS limpo, e execute imediatamente as células no cítmetro de fluxo, como demonstrado para portalar as populações de células-alvo baixas, intermediárias e altas células-alvo do CFSE. Em seguida, adquira um total de 2.000 eventos CFSE-baixo no canal Fluorescence 1, e calcule a lise específica de cada população de células-alvo cogina de acordo com a fórmula detalhada no texto. Neste experimento representativo, o sucesso do esgotamento das células T regulatórias de ocorrência natural em camundongos injetados com anticorpo monoclonal anti-CD25 foi confirmado pela citometria de fluxo.Como esperado, picos quase iguais correspondentes ao controle e células-alvo coginadas foram detectáveis em camundongos ingênuos. Em contraste, as células-alvo de exibição local-IV estavam quase completamente ausentes em camundongos t-antígenos, independentemente de seu tratamento prévio com anticorpo monoclonal anti-CD25 ou PBS. Curiosamente, o esgotamento natural das células T reg por anticorpo monoclonal anti-CD25 aumentado in vivo citotóxico T-linfócitos mediados lysis de células-alvo com pulso local I.Nesta segunda investigação representativa, o bloqueio programado de morte 1 aumentou os locais sub-dominantes de células T CD8 positivos uma e duas respostas específicas, sugerindo que interferir com a morte programada 1/ligante de morte programada 1 interações pode induzir a propagação de epitope em respostas de células T anti-câncer CD8-positivos. É fundamental ao rotular suas células doadoras com CFSE, certifique-se de que suas concentrações são precisas. Caso contrário, isso pode resultar em sobreposição de picos de histograma, o que dificulta seus cálculos e interpretação de dados necessários, se não impossível.Será importante otimizar ensaios in vivo de citotoxicidade para quantificar funções de efeitos provocadas por diferentes tipos de células assassinas que reconhecem peptídeos e antígenos não peptídeos no mesmo hospedeiro.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitiva Ensaios Homing para Estudar Gut trópico-Migração de Células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...