Name: tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses
Uploaded: 2019-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por los institutos canadienses de investigación sanitaria (CIHR), las subvenciones MOP-130465 y PJT-156295 a SMMH. JC está parcialmente respaldada por una beca de posgrado de la Reina Isabel II en ciencia y tecnología del Ministerio de formación, colegios y universidades de Ontario. CEM fue un beneficiario de una beca de posgrado de Alexander Graham Bell Canada (doctorado) de Ciencias naturales y el Consejo de investigación de ingeniería de Canadá (NSERC).

Los experimentos descritos aquí siguen protocolos de uso de animales aprobados por entidades institucionales y se adhieren a las directrices nacionales establecidas.
1. inoculación de ratones C57BL/6 con T AG-expresando células tumorales
<ol><li>Cultivar la línea celular de fibrosarcoma SV40 transformada C57SV (o una línea celular de T AG+ adherente similar) en el medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/l D-glucosa y l-glutamina (1x) y complementado con piruv...

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	<li>Yewdell, J. W., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+in+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+T+lymphocyte+responses.">Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses.</a> Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+in+the+immunodominance+hierarchy+in+secondary+CD8++T+cell+responses+to+influenza+A+virus:+roles+for+cross-presentation+and+lysis-independent+immunodomination.">Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).</li><li>Otahal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+cross-presentation+limits+the+CD8++T+cell+response+to+a+subdominant+tumor+antigen+epitope.">Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope.</a> The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).</li><li>Lauron, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+induces+immunodomination+in+the+presence+of+viral+MHC+class+I+inhibition.">Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).</li><li>Crowe, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+presentation+regulates+the+changing+patterns+of+CD8++T+cell+immunodominance+in+primary+and+secondary+influenza+virus+infections.">Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).</li><li>Probst, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodominance+of+an+antiviral+cytotoxic+T+cell+response+is+shaped+by+the+kinetics+of+viral+protein+expression.">Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression.</a> The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).</li><li>Gileadi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immunodominant+CTL+epitope+is+affected+by+proteasome+subunit+composition+and+stability+of+the+antigenic+protein.">Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein.</a> The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).</li><li>Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+proteasomes+function+to+increase+viral+peptide+diversity+and+broaden+antiviral+CD8++T+cell+responses.">Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses.</a> The Journal of Immunology. 191 (1), 52-59 (2013).</li><li>Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+affinity,+peptide+liberation,+T+cell+repertoire,+and+immunodominance+all+contribute+to+the+paucity+of+MHC+class+I-restricted+peptides+recognized+by+antiviral+CTL.">MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL.</a> The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).</li><li>Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinant+selection+of+major+histocompatibility+complex+class+I-restricted+antigenic+peptides+is+explained+by+class+I-peptide+affinity+and+is+strongly+influenced+by+nondominant+anchor+residues.">Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues.</a> The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).</li><li>Kotturi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+precursor+frequencies+and+MHC+binding+rather+than+the+degree+of+epitope+diversity+shape+CD8++T+cell+immunodominance.">Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance.</a> The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).</li><li>Haeryfar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+deoxynucleotidyl+transferase+establishes+and+broadens+antiviral+CD8++T+cell+immunodominance+hierarchies.">Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies.</a> The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).</li><li>Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+immunodominance+hierarchies+of+influenza+A+virus-specific+H-2(b)-restricted+CD8++T+cells+in+the+absence+of+terminal+deoxynucleotidyl+transferase.">Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase.</a> Immunological Investigations. 37 (7), 714-725 (2008).</li><li>Kedl, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+compete+for+access+to+antigen-bearing+antigen-presenting+cells.">T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).</li><li>Kastenmuller, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-competition+of+CD8++T+cells+shapes+the+immunodominance+hierarchy+during+boost+vaccination.">Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).</li><li>Memarnejadian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+Blockade+Promotes+Epitope+Spreading+in+Anticancer+CD8(+)+T+Cell+Responses+by+Preventing+Fratricidal+Death+of+Subdominant+Clones+To+Relieve+Immunodomination.">PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination.</a> The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).</li><li>Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+CD8++T+cell+responses+induced+by+direct+priming+and+cross-priming+and+moderate+immunodominance+disparities.">Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities.</a> The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).</li><li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+immunodominant+antitumor+and+antiviral+CD8++T+cell+responses+by+indoleamine+2,3-dioxygenase.">Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase.</a> PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).</li><li>Maleki Vareki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+simultaneous+antitumor+and+alloreactive+CD8(+)+T-cell+responses+in+the+same+host+by+rapamycin.">Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin.</a> American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).</li><li>Irvine, K., Bennink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+immunodominance+hierarchies+in+TCD8++-mediated+antiviral+responses.">Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).</li><li>Grossmann, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+CD8(+)+T-lymphocyte+responses+to+multiple+epitopes+from+simian+virus+40+(SV40)+large+T+antigen+in+C57BL/6+mice+immunized+with+SV40,+SV40+T-antigen-transformed+cells,+or+vaccinia+virus+recombinants+expressing+full-length+T+antigen+or+epitope+minigenes.">Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).</li><li>Fu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endoplasmic+reticulum-targeting+signal+sequence+enhances+the+immunogenicity+of+an+immunorecessive+simian+virus+40+large+T+antigen+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope.">An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+of+CD8++T+cells+by+viral+and+tumor+antigens+is+a+robust+phenomenon.">Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon.</a> European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).</li><li>Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Alloantibody-Mediated+Cytotoxicity+In+Vivo.">Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo.</a> Transplantation. 100 (5), 1041-1051 (2016).</li><li>Aichele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+antigen+treatment+of+naive+and+virus-immune+mice:+antigen-specific+tolerance+versus+immunopathology.">Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology.</a> Immunity. 6 (5), 519-529 (1997).</li><li>Oehen, S., Brduscha-Riem, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+naive+CTL+to+effector+and+memory+CTL:+correlation+of+effector+function+with+phenotype+and+cell+division.">Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division.</a> The Journal of Immunology. 161 (10), 5338-5346 (1998).</li><li>Coles, R. M., Mueller, S. N., Heath, W. R., Carbone, F. R., Brooks, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+armed+CTL+from+draining+lymph+node+to+spleen+shortly+after+localized+infection+with+herpes+simplex+virus+1.">Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 834-838 (2002).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> The Journal of Immunology. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Meilleur, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+superantigens+expand+and+activate,+rather+than+delete+or+incapacitate,+preexisting+antigen-specific+memory+CD8++T+cells.">Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Goldszmid, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+charged+with+apoptotic+tumor+cells+induce+long-lived+protective+CD4++and+CD8++T+cell+immunity+against+B16+melanoma.">Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma.</a> The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).</li><li>Oberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+or+mismatch+of+MHC+class+I+is+sufficient+to+trigger+NK+cell-mediated+rejection+of+resting+lymphocytes+in+vivo+-+role+of+KARAP/DAP12-dependent+and+-independent+pathways.">Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways.</a> European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).</li><li>Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+cytotoxicity+by+invariant+NKT+cells+in+vivo+is+CD95/CD178-dependent+and+is+correlated+with+antigenic+potency.">Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency.</a> The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).</li><li>Brinster, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+harboring+SV40+T-antigen+genes+develop+characteristic+brain+tumors.">Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors.</a> Cell. 37 (2), 367-379 (1984).</li><li>Tatum, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+targeting+a+single+immunodominant+epitope+are+sufficient+for+elimination+of+established+SV40+T+antigen-induced+brain+tumors.">CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors.</a> The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).</li><li>Schell, T. D., Tevethia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+advanced+choroid+plexus+tumors+in+SV40+T+antigen+transgenic+mice+following+priming+of+donor+CD8(+)+T+lymphocytes+by+the+endogenous+tumor+antigen.">Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen.</a> The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).</li><li>Greenberg, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+in+a+transgenic+mouse.">Prostate cancer in a transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).</li></ol>

Los ensayos de citotoxicidad in vivo basados en CFSE ofrecen varias ventajas sobre los ensayos de matanza tradicionales, como el cromo radioactivo (51CR) y los ensayos de liberación colorimétrico de lactato deshidrogenasa (LDH). Primero, permiten el monitoreo de la función CTL dentro de un órgano linfoide secundario arquitectónicamente intacto.
En segundo lugar, el asesinato específico de células Diana en ensayos de citotoxicidad in vivo refleja el número absoluto de TC...

Las células t CD8+ convencionales (tCD8) juegan partes importantes en la vigilancia inmune contra el cáncer. Funcionan principalmente en la capacidad de los linfocitos T citolíticos (CTLs) que reconocen antígenos péptidos específicos o asociados al tumor (AGS) que se muestran dentro de la hendidura cerrada de las moléculas de clase I del complejo de histocompatibilidad principal (MHC). Los CTLs completamente armados utilizan su arsenal citotóxico para destruir las células malignas. El anticancerígeno TCD8 puede detectarse en la circulación o incluso en las masas primarias y metastásicas de muchos pacientes con cáncer y animales portadores de tumores. Sin embargo, a menudo son anérgicas o exhaustas y no logran erradicar el cáncer. Por lo tanto, muchas modalidades de inmunoterapia están diseñadas para aumentar las frecuencias TCD8 anticancerígenas y para restaurar y potenciar sus funciones.
Las proteínas tumorales albergan muchos péptidos, algunos de los cuales pueden ser inmunogénicos y potencialmente inmunoprotectores. Sin embargo, las respuestas TCD8 cuantificables se provocan con magnitudes variables contra pocos péptidos solamente. Esto crea una "jerarquía de inmunodominancia" entre TCD8 clones1. En consecuencia, inmunodominante (ID) TCD8 ocupan rangos jerárquicos prominentes, que es comúnmente juzgado por su abundancia. Por el contrario, las células TCD8 cuyo receptor de linfocitos t (TCR) es específico para epitopos SUBDOMINANTES (SD) ocurren en frecuencias más bajas. Nosotros y otros hemos identificado algunos de los factores que dictan o dan forma a la inmunodominación en las respuestas TCD8 . Estos incluyen, entre otros, el modo de presentación de AG a TCD8 ingenuos (es decir, presentación directa, presentación cruzada, travestismo)2,3,4, el tipo de células presentadoras de AG (APCs) participandoen la activación5TCD8 , la abundancia y estabilidad de la proteína AGS6,7 y la eficiencia y cinética de su degradación por proteasomas7,8, el selectividad relativa del transportador asociado con el procesamiento de AG (TAP) para los péptidos9, la afinidad de los péptidos liberados para las moléculas de MHC I9,10, la presencia, las frecuencias precursoras y la diversidad de TCR de cognar tCD8 en las agrupaciones de células t11,12,13, competencia cruzada entre las células t para el acceso a los APCs14,15, y la capacidad fratricida de tCD8 clones16. Además, la inmunodominación TCD8 está sometida a mecanismos inmunoreguladores mediadas por varios tipos de células supresoras, como las células t (nTreg) reguladorasque ocurren de forma natural, la molécula Co-inhibitoria de la superficie celular programada muerte-1 (PD-1)16, y ciertas enzimas intracelulares como indoleamina 2, 3-dioxigenasa (ido)18 y el objetivo de mamífero de rapamicina (mTOR)19. Es importante tener en cuenta, sin embargo, que los factores anteriores no siempre tienen en cuenta completamente la inmunodominación.
Aparte de la biología básica de la inmunodominación TCD8 , el examen de este fenómeno intrigante tiene importantes implicaciones en la inmunología del cáncer y la inmunoterapia. En primer lugar, un estado de identificación no confiere necesariamente a un clon dado de TCD8 la capacidad de prevenir el inicio del tumor o la progresión20. Si y cómo los ID y SD TCD8 contribuyen a la inmunidad antitumoral pueden depender del tipo y el grado de malignidad y el sistema experimental empleado. En segundo lugar, se cree que ID TCD8 clones pueden ser "demasiado visibles" para el sistema inmunológico y por lo tanto más propensos a los mecanismos de tolerancia central y/o periférica16,21. En tercer lugar, los tumores heterogénicos pueden contener células neoplásicas que evitan la detección por muchos, si no la mayoría, CTLs mostrando sólo un espectro estrecho de péptidos: MHC complejos. Bajo estas circunstancias, TCD8 respuestas de amplitud insuficiente son propensos a permitirse tales células tumorales una ventaja de supervivencia, potenciando así su crecimiento de la salida22. Es por las razones anteriores que muchos ver inmunodominación como un obstáculo a la vacunación exitosa a base de TCD8y terapias contra el cáncer.
La inoculación de ratones C57BL/6 con virus simio 40 (SV40)-células transformadas que expresan gran tumor AG (T AG) proporciona un potente sistema preclínico para estudiar el inmunopredominio de TCD8 . Este modelo ofrece varios beneficios. En primer lugar, los epítopos peptídicos de esta oncoproteína clínicamente relevante están bien caracterizados en esta cepa de ratón23 (tabla 1). En segundo lugar, los epítopos de T AG, que se denominan sitios I, II/III, IV y V, desencadenan respuestas TCD8 que se organizan sistemáticamente en el siguiente orden jerárquico: sitio iv > > sitio I ≥ sitio II/III > &Gt; sitio V. en consecuencia, el sitio IV-específico TCD8 Monte la respuesta más robusta a T AG. Por el contrario, los sitios I y II/III son subdominantes, y los TCD8 específicos del sitio V son menos abundantes y por lo general sólo son detectables en ausencia de capacidad de respuesta a otros epítopos23,24. En tercer lugar, la línea celular del tumor T AG+ utilizada en el protocolo aquí descrito, es decir, C57SV células de fibrosarcoma, y las utilizadas en nuestras investigaciones anteriores16,17,18,19 ,25,26, se transforman con fragmentos subgenómicos SV4025. Por lo tanto, son incapaces de ensamblar y liberar SV40 viriones que potencialmente podrían infectar APCs del host. Además, las células C57SV carecen de moléculas coestimuladores clásicas como CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) y ligando del CD137 (4-1BBL)16. Los atributos anteriores hacen que estas líneas sean ideales para el examen de la activación in vivo de TCD8 mediante cebado cruzado. La cebado cruzado es una vía importante para inducir respuestas TCD8 , especialmente aquellas lanzadas contra células tumorales de origen no hematopoyético que fallan directamente en las células T ingenuas25.
Las frecuencias y/o funciones antitumorales TCD8 pueden controlarse mediante la tinción de MHC I tetrámero, la tinción intracelular para citoquinas efectoras (p. ej., el interferón [IFN]-γ) o las moléculas líticas (p. ej., perforación), los ensayos de inmunosolla ligada a enzimas (ELISPOT) y ex ensayos de citotoxicidad vivo. Desde su creación en los 199027,28, carboxyfluorescein succinimidil Ester (CFSE)-basado en ensayos de matanza in vivo han permitido la evaluación de las respuestas citotóxicas mediadas por antiviral CTLs29,30 , 31, antitumorales CTLs16,32, natural killer (NK) células33, glicolipid reactivo natural invariante T (iNKT) células34, y pre existente y de Novo específico del donante aloanticuerpos26. Por lo tanto, sus aplicaciones pueden ser de interés para un amplio número de lectores, incluyendo pero no limitado a los investigadores que trabajan en las áreas de Inmunología tumoral e inmunoterapia, inmunidad antipatógeno, y el diseño de la vacuna preventiva y terapéutica.
Para evaluar la citotoxicidad mediada por células en escenarios típicos, dos poblaciones de splenocitos ingenuos que exhiben un AG irrelevante o un AG (s) cognado están etiquetados con dos dosis diferentes de CFSE, mezcladas en igual número e inyectadas en ingenua (control) o asesino ratones que albergan células. A continuación, la citometría de flujo examina la presencia/ausencia de cada población objetivo.
Hemos optimizado y empleado ensayos de matanza in vivo en nuestros estudios sobre inmunodominancia en las respuestas antiviral y antitumoral T CD812,16,17. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la evaluación simultánea de las respuestas de ID y SD TCD8 a los epítopos de t AG, que pueden adoptarse fácilmente para investigaciones similares en otros sistemas experimentales. También proporcionamos resultados representativos que demuestran que el agotamiento de células nTreg y el bloqueo PD-1 pueden mejorar selectivamente la citotoxicidad inducida por ID TCD8-y SD tCD8, respectivamente. Al final, discutiremos múltiples ventajas de los ensayos de matanza in vivo, así como algunas de sus limitaciones inherentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:872px;" width="871">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">25200-056</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFSE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-150</td>
			<td>Heat-inactivate prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>10 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock is 100X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2)</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0116-01</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone HRPN)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0088</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG1 (clone TNP6A7)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG2a (clone 2A3)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BP0089</td>
			<td>Isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM final concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tailoring in vivo cytotoxicity assays to study immunodominance in tumor-specific cd8+ t cell responses

Los ensayos de citotoxicidad con base en el éster de carboxyfluorescein succinimidil (CFSE) permiten la cuantificación sensible y precisa de las respuestas de linfocitos T de CD8+ citolíticos (CTL) obtenidas contra péptidos derivados de tumores y patógenos. Ofrecen varias ventajas sobre los ensayos de matanza tradicionales. En primer lugar, permiten el seguimiento de la citotoxicidad por CTL mediada dentro de los órganos linfoides secundarios arquitectónicamente intactos, típicamente en el bazo. En segundo lugar, permiten estudios mecaniísticos durante las fases de cebado, efector y recuperación de las respuestas CTL. En tercer lugar, proporcionan plataformas útiles para las pruebas de eficacia de vacunas/fármacos en un entorno verdaderamente in vivo. Aquí, proporcionamos un protocolo optimizado para el examen de las respuestas CTL concomitantes contra más de un epitopo péptido de un antígeno tumoral modelo (AG), a saber, el virus Simia 40 (SV40)-codificado grande t AG (t AG). Al igual que la mayoría de las otras proteínas del tumor clínicamente relevantes, T AG alberga muchos péptidos potencialmente inmunogénicos. Sin embargo, sólo cuatro de estos péptidos inducen respuestas CTL detectables en ratones C57BL/6. Estas respuestas se organizan sistemáticamente en un orden jerárquico basado en su magnitud, que forma la base para TCD8 "inmunodominancia" en este potente sistema. En consecuencia, la mayor parte de la respuesta TCD8 específica de t AG se centra en un único epítopo inmunodominante, mientras que los otros tres epítopos se reconocen y responden sólo débilmente. La inmunodominación compromete la amplitud de las respuestas antitumorales TCD8 y es, como tal, considerado por muchos como un impedimento para la vacunación exitosa contra el cáncer. Por lo tanto, es importante entender los factores celulares y moleculares y los mecanismos que dictan o dan forma a la inmunodominación TCD8 . El protocolo que Describimos aquí está adaptado a la investigación de este fenómeno en el modelo de inmunización de T AG, pero se puede modificar y extender fácilmente a estudios similares en otros modelos de tumores. Proporcionamos ejemplos de cómo el impacto de las intervenciones inmunoterapéuticas experimentales se puede medir utilizando ensayos de citotoxicidad in vivo.

El objetivo del experimento cuyos resultados se muestran en la figura 1 fue determinar si la presencia y las funciones de las células nTreg forman o alteran la jerarquía de inmunodominancia de tCD8específico de t AG. C57BL/6 ratones fueron inyectados i.p. con PBS o con 0,5 mg de un anti-CD25 mAb (Clone PC-61.5.3 [PC61]) cuatro días antes de que recibieran 2 x 107 C57SV células tumorales i.p. En experimentos separados, se usó un control de isotipo IgG1 de rata en l...

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Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

Describimos aquí un ensayo de matanza in vivo basado en citometría de flujo que permite el examen de inmunodominancia en las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a un antígeno tumoral modelo. Proporcionamos ejemplos de cómo este ensayo elegante se puede emplear para estudios mecaniísticos y para pruebas de eficacia de fármacos.

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Este ensayo se puede emplear para cuantificar simultáneamente la citotoxicidad mediada por células T contra dos epítopos peptídicos distintos de antígenos tumorales. La naturaleza in vivo de este ensayo permite medir la función citotóxica de las células T dentro de la arquitectura intacta de un órgano linfoide secundario. Además, la matanza observada es un reflejo preciso del número absoluto de células T, y no sólo sus frecuencias, lo que puede ser engañoso.Este ensayo permite el examen de las respuestas de los linfocitos T citotóxicos a antígenos tumorales inmunodominantes y subminantes. Por lo tanto, proporciona información valiosa cuando se diseña una vacuna, así como protocolos inmunoterapéuticos para el cáncer. Nuestro protocolo ha sido diseñado para estudiar las respuestas de los células T CD8.Sin embargo, se puede modificar para medir la citotoxicidad provocada por otros tipos de células asesinas, como las células NK y los linfocitos T de forma innata. Este ensayo requiere experiencia en técnica aséptica, manejo de tejido de ratón, preparación de células diana, así como experiencia en inyecciones de venas de cola. Uno necesita adquirir este conjunto de habilidades antes de intentar el ensayo de asesinato in vivo.Una vez que la línea celular tumoral adherente del antígeno T se haya vuelto totalmente confluente o ligeramente sobrefluente, enjuague suavemente la monocapa con PBS estéril y caliente, y desprenda las células tumorales con 0.25%trypsin EDTA en un gabinete de bioseguridad. Toque los lados del matraz de cultivo varias veces para liberar las células adherentes restantes y detenga la reacción después de unos cinco minutos con la adición de cinco mililitros de medio DMEM. Pipetear la solución celular unas cuantas veces antes de filtrar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros-poro en un tubo cónico de 50 mililitros.Recoger las células por centrifugación, y resuspender el pellet en 10 mililitros de PBS estéril, frío para el primero de tres lavados en las mismas condiciones. Después del tercer lavado, resuspender las células a cuatro veces 10 a las siete células por mililitro de concentración estéril de PBS, e inyectar 500 microlitros de la suspensión de células tumorales T-antígeno positivo intraperitonealmente en cada receptor de ratón C57 Black 6 de seis a 12 semanas de edad. Para la preparación del esplenocito objetivo, coloque el ratón donante eutanizado en la posición propensa y rocíe el animal con 70% de etanol.Usando fórceps estériles y tijeras, levante la piel y haga una pequeña incisión ventral de la línea media. Corta la piel de una manera cruzada para exponer el peritoneo, y usa los fórceps para levantar el peritoneo de una manera similar a una tienda de campaña, sin atrapar ninguno de los órganos internos. Abra el peritoneo para exponer la cavidad peritoneal y transfiera suavemente el bazo a una trituradora de tejido Dounce de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de PBS estéril.Utilice el émbolo para aplicar presión manual hasta que el tejido esplénico se disipe en una suspensión celular homogénea roja, y transfiera el homogeneato a un tubo de 15 mililitros. Recoger la suspensión por centrifugación, y resuspender el pellet en cuatro mililitros de cloruro de amonio de cloruro de amonio tampón de lisina de potasio para eliminar los eritrocitos. Después de cuatro minutos, detenga el proceso con ocho mililitros de medio completo y filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros de poro en un nuevo tubo de 50 mililitros.Separe los glóbulos blancos de los restos de glóbulos rojos por centrifugación, y resuspendir el pellet en 12 mililitros de medio completo. A continuación, divida la suspensión del esplenocito en tres alícuotas de cuatro mililitros iguales. Para la codificación de péptidos de los splenocitos diana, pulse una alícuota de esplenocito con un micromolar de péptido irrelevante, una alícuota con un micromolar del péptido del sitio I y una alícuota con un micromolar del péptido del sitio IV durante una hora a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono.Al final de la incubación, retire el exceso de péptido por centrifugación y lave los esplocitos pulsados por péptidos dos veces en 12 mililitros de PBS estéril y frío por lavado por tubo. Después del segundo lavado, resuspender las células en cuatro mililitros de PBS fresco y estéril por tubo. Agregue 025, 0.25 y CFSE de dos micromolares a las suspensiones de esplenocitos con pulsos de péptidos irrelevantes, del sitio I y del sitio IV, respectivamente.Coloque los tubos a 37 grados centígrados durante 15 minutos con inversión manual una vez cada cinco minutos. Al final de la incubación, añadir tres mililitros de suero bovino fetal inactivado por calor a cada tubo para detener la reacción CFSE y llevar el volumen final en cada tubo hasta 15 mililitros con PBS. Luego recoge las células etiquetadas con tinte por centrifugación para dos lavados en 12 mililitros de PBS fresco y estéril por lavado.Para confirmar un etiquetado CFSE adecuado de los esplenocitos diana, resuspendir el pellet en tres mililitros de PBS y mezclar con vórtices suaves. Transfiera 10 microlitros de cada suspensión celular etiquetada con CFSE a una clasificación individual de células de poliestireno inferior redondo de cinco mililitros, o tubo FACS, que contiene PBS, y cargue el tubo en un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nanómetros. En el software del citometro de flujo, cree una puerta de linfocitos basada en las propiedades de dispersión hacia adelante y dispersión lateral de las células antes de adquirir 5.000 eventos que caen dentro de la puerta de linfocitos en el canal Fluorescencia 1.Dentro de la población cfSE-positiva principal, dibuje puertas de histograma adicionales para identificar las subpoblaciones CFSE-bajas, CFSE-intermedias y CFSE-high. A continuación, confirme un número de evento igual o casi igual dentro de las tres puertas para los otros dos tubos de las células etiquetadas. Para la inyección de las células diana, primero vórtice suavemente los tubos de origen y acote las tres suspensiones de células etiquetadas con CFSE en un nuevo tubo con las mismas proporciones.Rebanar el contenido del tubo con PBS estéril, y recoger las células por centrifugación para el conteo. Luego ajuste el volumen a una vez 10 a las siete células diana mixtas por cada 200 microlitros de PBS por concentración de receptor, e inyecte 200 volúmenes de microlitro de la suspensión celular en la vena de la cola de cada receptor C57 Black 6 ratón. Dos o cuatro horas después de la inyección, retire y procese el bazo de cada animal receptor como se ha demostrado, y resuspendir los glóbulos blancos aislados en tres mililitros de PBS por bazo.Transfiera aproximadamente una vez 10 a las siete células de cada bazo procesado en un tubo FACS limpio, e inmediatamente ejecute las células en el citómetro de flujo como se demostró para gatear las poblaciones de células de destino bajo, intermedio y alto CFSE. A continuación, adquiera un total de 2.000 eventos cfSE-bajos en el canal Fluorescence 1, y calcule la lysis específica de cada población de células diana cognada de acuerdo con la fórmula detallada en el texto. En este experimento representativo, el éxito del agotamiento de las células T reguladoras de origen natural en ratones inyectados con anticuerpos monoclonales anti-CD25 fue confirmado por citometría de flujo.Como era de esperar, los picos casi iguales correspondientes a las células diana de control y cognados eran detectables en ratones ingenuos. Por el contrario, las células diana que mostraban el sitio IV estaban casi completamente ausentes en ratones con T-antígeno-cebado, independientemente de su tratamiento previo con anticuerpos monoclonales anti-CD25 o PBS. Curiosamente, el agotamiento natural de las células T reg por anticuerpos monoclonales anti-CD25 aumenta la lysis mediada por linfocitos T citotóxicas in vivo de las células diana pulsadas por el sitio I.En esta segunda investigación representativa, el bloqueo programado de la muerte 1 mejoró los sitios de células T subminiopositivas CD8 positivos, una y dos respuestas específicas de dos cortes de tres, lo que sugiere que interferir con las interacciones programadas del ligando de muerte 1/ligando de muerte programada 1 puede inducir la propagación del epítopo en las respuestas de células T cd8-positivas contra el cáncer. Es fundamental cuando etiquete las células de su donante con CFSE, asegúrese de que sus concentraciones sean precisas. De lo contrario, esto puede dar lugar a picos de histograma superpuestos, lo que dificulta los cálculos necesarios y la interpretación de datos, si no imposible.Será importante optimizar los ensayos de citotoxicidad in vivo para cuantificar las funciones de efector provocadas por diferentes tipos de células asesinas que reconocen antígenos péptidos y no peptídicos en el mismo huésped.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em&gt; En vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...