Name: isotropic light-sheet microscopy and automated cell lineage analyses to catalogue caenorhabditis elegans embryogenesis with subcellular resolution
Uploaded: 2019-06-06T14:00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution at JoVE.com

Vi takker John Murray for integreret stamme, ujIs113, til at generere lineaging stamme BV514; Brandon Harvey (NIBIB) for at få hjælp til at teste protokollen; Jon Daniels og Gary Rondeau (Applied Scientific Instrumentation) for hjælp med Micro-Manager og diSPIM instrument; og Andrew York og Hank Eden for deres kritiske feedback på diSPIM systemet. Vi takker også forskningscenteret for mindretals institutioner-programmet og Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) for at levere en møde-og brainstorming-platform. Meget af dette arbejde blev udført på marine biologisk laboratorium i Woods Hole gennem Whitman programmet. Dette arbejde blev støttet af de Intramural forskningsprogrammer af NIH National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering og af NIH Grant No. U01-HD075602 og nej. R24-OD016474. Mark W. Moyle blev støttet af F32-NS098616 og Leighton H. Duncan blev støttet af et mangfoldigheds tillæg til R24-OD016474.

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Bao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cell+lineage+tracing+in+Caenorhabditis+elegans.">Automated cell lineage tracing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (8), 2707-2712 (2006).</li><li>Santella, A., Du, Z., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-local+neighborhood-based+framework+for+probabilistic+cell+lineage+tracing.">A semi-local neighborhood-based framework for probabilistic cell lineage tracing.</a> BMC Bioinformatics. 15, 217 (2014).</li><li>Santella, A., Du, Z., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+blob-slice+model+for+accurate+and+efficient+detection+of+fluorescence+labeled+nuclei+in+3D.">A hybrid blob-slice model for accurate and efficient detection of fluorescence labeled nuclei in 3D.</a> BMC Bioinformatics. 11, 580 (2010).</li><li>Boyle, T. J., Bao, Z., Murray, J. I., Araya, C. L., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AceTree:+a+tool+for+visual+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis.">AceTree: a tool for visual analysis of Caenorhabditis elegans embryogenesis.</a> BMC Bioinformatics. 7, 275 (2006).</li><li>Katzman, B., Tang, D., Santella, A., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AceTree:+a+major+update+and+case+study+in+the+long+term+maintenance+of+open-source+scientific+software.">AceTree: a major update and case study in the long term maintenance of open-source scientific software.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 121 (2018).</li><li>Murray, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+embryonic+gene+expression+with+cellular+resolution+in+C.+elegans.">Automated analysis of embryonic gene expression with cellular resolution in C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (8), 703-709 (2008).</li><li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree.">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy.">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nature Biotechnology. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Stage-+and+Slit-Scanning+to+Improve+Contrast+and+Optical+Sectioning+in+Dual-View+Inverted+Light+Sheet+Microscopy+(diSPIM).">Using Stage- and Slit-Scanning to Improve Contrast and Optical Sectioning in Dual-View Inverted Light Sheet Microscopy (diSPIM).</a> The Biological Bulletin. 231 (1), 26-39 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li><li>Wu, Y., Christensen, R., Colon-Ramos, D., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+optical+imaging+techniques+for+neurodevelopment.">Advanced optical imaging techniques for neurodevelopment.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1090-1097 (2013).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology.">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nature Methods. 12 (1), 23-26 (2015).</li><li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+fluorescence+microscopy:+advances+in+high+speed+biological+imaging.">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 46-53 (2014).</li><li>Lucy, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+technique+for+the+rectification+of+observed+distributions.">An iterative technique for the rectification of observed distributions.</a> Astronomical Journal. 76 (6), 745-754 (1974).</li><li>Richardson, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian-Based+Iterative+Method+of+Image+Restoration.">Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration.</a> JOSA. 62 (1), 55-59 (1972).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+microManager.">Computer control of microscopes using microManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 14, (2010).</li><li>Gualda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIM-fluid:+open+source+light-sheet+based+platform+for+high-throughput+imaging.">SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging.</a> Biomedical Optics Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).</li><li>Ardiel, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Calcium+Flux+in+Freely+Moving+Nematode+Embryos.">Visualizing Calcium Flux in Freely Moving Nematode Embryos.</a> Biophysical Journal. 112 (9), 1975-1983 (2017).</li><li>Walton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicoid+class+homeodomain+factors+ceh-36/OTX+and+unc-30/PITX+cooperate+in+C.+elegans+embryonic+progenitor+cells+to+regulate+robust+development.">The Bicoid class homeodomain factors ceh-36/OTX and unc-30/PITX cooperate in C. elegans embryonic progenitor cells to regulate robust development.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005003 (2015).</li><li>Altun, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormAtlas. , (2002).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology:+In+the+nematode+C.+elegans.">Embryology: In the nematode C. elegans.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. Chapter 8, 215-241 (1988).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314 (1165), (1986).</li><li>Bao, Z., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+Caenorhabditis+elegans+embryos+for+live+imaging+of+embryogenesis.">Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis.</a> Cold Spring Harb Protoc. (9), (2011).</li><li>Christensen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untwisting+the+Caenorhabditis+elegans+embryo.">Untwisting the Caenorhabditis elegans embryo.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Santella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormGUIDES:+an+interactive+single+cell+developmental+atlas+and+tool+for+collaborative+multidimensional+data+exploration.">WormGUIDES: an interactive single cell developmental atlas and tool for collaborative multidimensional data exploration.</a> BMC Bioinformatics. 16, 189 (2015).</li><li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first+version+of+the+Caenorhabditis+elegans+Promoterome.">A first version of the Caenorhabditis elegans Promoterome.</a> Genome Research. 14 (10B), 2169-2175 (2004).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+transcription+factor+gene+duplication+from+Caenorhabditis+elegans+Promoterome-driven+expression+patterns.">Insight into transcription factor gene duplication from Caenorhabditis elegans Promoterome-driven expression patterns.</a> BMC Genomics. 8 (27), (2007).</li><li>. WormBase Available from: <a target="_blank" href="https://www.wormbase.org">https://www.wormbase.org</a> (2019)</li><li>Lee, R. Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormBase+2017:+molting+into+a+new+stage.">WormBase 2017: molting into a new stage.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), D869-D874 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

C. elegans skiller sig ud som den eneste organisme med de endelige positioner og konnektivitet af hver voksen neuron kendt27. Men den udviklingsmæssige dynamik, der fører til organisering af de arbejds kredsløb og netværk, der udgør C. elegans connectome forbliver ukendt. Baseret på muligheder fra fremskridt i lys mikroskopi, kan vi nu fange og analysere celle positioner, morfogenesis, og neurogenese hele C. elegans embryonale udvikling.
Den procedure, som vi har beskrevet, og som vi rutinemæssigt bruger i laboratoriet, giver 4D-isotropiske billeder af mærkede neuroner og kerner til celle-lineaging i C. elegans -embryoner. Endnu vigtigere er det, at vi har optimeret langsigtede billeddannelses betingelser med diSPIM og koblede semi-automatiserede lineaging-funktioner med billeder i høj opløsning for at forbedre hastigheden og præcisionen ved at analysere C. elegans embryogenese. Denne integrerede protokol vil gøre det muligt for brugerne at visualisere og identificere celler og kvantificere tredimensionale funktioner såsom neurit migration og Axon fasciculation gennem debut af tidlig trækninger. Denne procedure kan let tilpasses til ethvert anlæg med et ASI diSPIM-system, og vi anbefaler dette system specifikt til denne protokol. Andre SPIM-formuleringer, der udbydes kommercielt, kan afvige fra ASI-konfigurationen i prøvekammeret og de optiske egenskaber. Data, der eksporteres fra andre platforme, kan dog også gennemføres via vores datapipeline. Derfor, vurdering af deres værdi i lineaging, en krævende test af billedkvalitet og instrument stabilitet, er muligt. Selvom vi aktivt bruger diSPIM til regelmæssigt at afbilde andre prøver (som f. eks. Drosophila og zebrafiske embryoner), er den beskrevne og omfattende analyse af embryonerne i øjeblikket stadig begrænset til fyrretræsnematoden-arterne. For større eller tykke prøver vælger vi at bruge trin-scanning tilgange, som scanner prøverne gennem en stationær lys ark. Kumar et al. har tidligere demonstreret denne forbedrede diSPIM skæring til at give billeder af høj kvalitet fra tykke prøver uden yderligere ændringer af diSPIM10.
De kritiske trin i protokollen omfatter montering C. elegans embryoner på poly-L-lysin belagt coverslip, dataopsamling, og databehandling. Høst og montering C. elegans embryoner på glasset dækglas kan være udfordrende for uerfarne brugere, men her giver vi en detaljeret protokol af centrale skridt til at lette læring. Hvis langsigtet billeddannelse ønskes, opnår vi de bedste resultater ved høst af fire-cellet eller tidligere embryoner fra 8-10 unge voksne28. Bemærk, at gamle voksne er mindre ønskeligt at høste tidlige stadier embryoner, fordi de har tendens til at indeholde ældre embryoner i livmoderen og ubefrugtede æg. Med hensyn til montering af embryoner kan problemer som blokering i den samlede indsugnings (mund pipette) eller en for stor åbning i mikrokapillar pipetten forhindre korrekt montering og orientering af embryoner. For at forberede den optimale billeddannelse udfører vi test før anskaffelsen på tidlige og sene præ-twitching-embryoner for at kontrollere ydeevnen af lysark, kameraer, mål og autofokus. Vi opnår de bedste resultater, når alle disse operationer er testet og giver billeder af høj kvalitet under vores pre-Acquisition test. Dette er især relevant for generering af billeder med isotropisk rumlig opløsning, hvor RAW-billeder, der er anskaffet fra begge synspunkter (mål), skal være af høj kvalitet. Efter købet behandles de mængder, der er anskaffet for hver visning, for at give isotropiske billeder. Det er vigtigt at bruge et passende GPU-kort (grafikprocessor) som beskrevet i denne protokol (se nedenfor). Dette forbedrer den behandlingshastighed, hvormed de isotropisk sammensmeltede billeder genereres, hvilket forkorter tiden til dataanalyser. Det er også bydende nødvendigt, at brugerne kører den nyeste version af CytoSHOW og bruger de parametre, der leveres med vores download bundle til StarryNite Auto-lineaging. Hvis brugerne er interesseret i at bruge Auto-lineaging til andre prøver (f. eks. zebrafish, Drosophila osv.), vil der være behov for yderligere optimering af de parametre, der anvendes i starrynite (Se referencer3,4).
Selv om vores integrerede protokol giver billeder og lineaging resultater i præ-twitching embryo, bør brugerne være opmærksomme på, at automatiseret lineaging i post-twitching embryo er i øjeblikket ikke muligt: nukleare positioner ændringer på rækkefølgen af sekunder i efter twitching embryo, for hurtigt at tillade Lineage tracking. Men, den dispim har faktisk vist en lovende evne til at indfange neuroudviklingsmæssige hændelser og spore nogle celle positioner i post-twitching stadier af embryo Genesis23,29. Hvis brugerne er interesseret i at undersøge post-twitching embryo, den diSPIM giver den hastighed for at opnå volumetriske Snapshots og spore fine neuroudviklingsmæssige hændelser, såsom neurite outgrowth, i hurtigt bevægende embryoner.
Denne protokol vil være grundlæggende for celle-for-celle færdiggørelse af WormGUIDES Atlas30, da det vil give en integreret tilgang med høj opløsning isotropiske billeder til at identificere og indfange 3D morfologier af mærkede neuroner under de første 430 minutter af embryogenese. Som det ser ud, prototypen WormGUIDES Atlas giver nukleare positioner af celler i det udviklende embryo og har til formål at indfange den udviklingsmæssige dynamik i en delmængde af embryonale neuroner. Denne protokol vil være nøglen til integration af yderligere udviklings neuroner i WormGUIDES Atlas30.
Vores integrerede protokol vil også forenkle udforskning af nye genekspressions profiler i C. elegans embryo. I transgene C. elegans, mange celle-specifikke initiativtagere rumligt og temporalt kontrol transgen udtryk. Mens udtrykket mønstre af de fleste gener er blevet udførligt karakteriseret i det voksne dyr31,32,33,34, næsten alle er endnu ikke karakteriseret i udviklingslandene (især forsinket) embryo. Den C. elegans promoterome har været en nyttig ressource til ormen samfund til at køre celle-specifikke transgen udtryk, samt afgøre, om gen funktion er celle-autonome eller ikke-autonome. At opfange isotropiske, højopløsnings-og dynamiske udtryks mønstre af gener og præcist at identificere celler via lineaging vil være værdifuldt for mange i forskersamfundet.
Embryogenese består af to sammenflettede store processer, cellulær differentiering og vævs morfogenese. En hel del er kendt om de mekanismer og molekyler, der definerer særskilte celletyper under udviklingen af C. elegans. Men, lidt er kendt om de mekanismer, der er vigtige for celle migration, celle vedhæftning, og celle form i C. elegans embryo. Med C. elegans invariant celle Lineage kendt, vores protokol lader os let skelne katalogiseret 3D-mikroanatomi af embryonet under morfogenese på nye niveauer af detaljer: fx Axon fasciculation, synaptogenesis, og neuronal aktivitet. Ardiel et al. har tidligere demonstreret styrken af diSPIM til at indfange calcium transienter på niveau med en enkelt neuroner i C. elegans embryoner23. Mange andre aspekter af udviklings fysiologi er moden til undersøgelse af disse metoder.
Endelig, denne protokol er stort set automatiseret og systematisk reducerer den tid, det tager at generere deconvolution billeder og udføre celle-lineaging via StarryNite og Acetree. De software strategier, der anvendes i denne protokol, kan anvendes på mange spørgsmål om biologi langt fra de meget specifikke områder, hvor vi har demonstreret dem her.
Oplysninger om software kompatibilitet og download-adgang
Oplysninger om Micro-Manager og plugins til diSPIM Imaging er tilgængelige på http://dispim.org/software/micro-manager og https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
Databehandlings pipelinen kræver i øjeblikket et Windows-operativsystem. Vi har bundtet en enkelt arkivfil for at forenkle installationen af alle nødvendige databehandling programmer og støtte filer. Den kan downloades på http://dispimlineage.wormguides.org.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) er baseret på den udbredte og open source billedanalyse platform, ImageJ (v1). Java skal være installeret og opdateret på computeren for at bruge CytoSHOW, og opdateringer til CytoSHOW installeres automatisk via Java Web Start. Mange ImageJ-baserede funktioner i CytoSHOW er som beskrevet og illustreret på https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. CytoSHOW er blevet tilpasset til at vise flerdimensionelle rå data fra ASI diSPIM, samt anden billedbehandling software, der skaber TIFF-output. I princippet kan andre MultiView SPIM billedsystemer understøttes af mindre ændringer af CytoSHOW, så denne protokol kan udføres på forskellige mikroskop systemer.

SpimFusion blev skrevet i CUDA/C++ med Visual Studio 2013 med CUDA Toolkit v 7.5. Kørsel af SpimFusion kræver specifik computer hardware: et GPU-kort (NVIDIA Graphics Processor Unit) med CUDA-databehandlingskapacitet 1,0 eller højere og mindst 2 GB grafikkorthukommelse. På tidspunktet for offentliggørelsen af vores protokol, SpimFusion er ikke offentliggjort (min Guo og Hari shroff), men findes i software Bundle Arkiv nævnt ovenfor.

En specialbygget kommandolinje drevet version af StarryNite kræver, at den frit tilgængelige MATLAB compiler Runtime er installeret, men kræver ikke en licens til kommerciel MATLAB-software. MATLAB compiler Runtime er inkluderet i software Bundle arkivet nævnt ovenfor. Koden for StarryNite som anvendt i denne protokol er stort set uændret fra den, der anvendes til confokale billeder6. Men, flere operationelle spørgsmål i skabelsen af input billeder til starrynite behandling og håndtering af starrynite resultater er blevet behandlet her ved metoder i cytoshow, der muliggør en kontinuerlig databehandling pipeline for smeltet isotropisk dispim Diskenheder. Disse ændringer er automatiseret af CytoSHOW kode, der håndterer disse præ-og efter behandling trin. CytoSHOW også redigerer en pre-optimeret diSPIM-specifik skabelon StarryNite parameter indstillet til automatisk at tune segmenterings algoritmen til fluorescens intensitet af kerner i de indpakkede data. De unikke parametre, der anvendes af StarryNite på hvert diSPIM datasæt gemmes derefter i en fil sammen med output-billede og line aging data.
En brugerdefineret version af AceTree, der fungerer med 16-bit-billeder og bevarer kompatibiliteten med Java3D-gengivelse, er bedst egnet til denne protokol. Det er også inkluderet i software Bundle Arkiv nævnt ovenfor.

C. elegans skiller sig ud som den eneste organisme, hvor hver celle i embryonet kan observeres gennem neurodevelopment. Med hele celle-Lineage kendt og invariant1, og med udviklingen af nye værktøjer, der tillader mærkning og kontinuerlig billeddannelse af enkeltceller i embryoner, kan biologer nu begynde at undersøge forskellige trin i udviklingen af fyrretræsnematoden nervøs system fra alle vinkler-celle fødsel; migration og differentiering; neurit formation, målrettet udvækst og fasciculation; synapse dannelse; og tuning af funktionelle kredsløb. Opfange neuronal udvækst dynamik i C. elegans embryo, ved at kombinere stabilt udtrykte journalister og Fluorescens mikroskopi, er værdifuld for det videnskabelige samfund.
Udviklingsmæssige undersøgelser i C. elegans ofte udnytte invariant celle-Lineage og celle-skæbne kort af denne art til at forøge kontekstuelle forståelse på enkelt celleniveau inden for intakt organisme1. Auto-lineaging analyse-ved hjælp af starrynite2,3,4 og acetree5,6,7,8 software-fordele ved høj kontrast, høj opløsning billeder af fluorescerende kerner. For at arbejde optimalt, StarryNite/AceTree afhænger også af forudsigelig begrænset orientering af indpakkede embryoner under udvikling. Confokal mikroskopi, udført i C. elegans embryoner komprimeret mellem to dæksedler, har været standard Auto-lineaging mikroskopi metode i mere end et årti, fordi det giver både høj kontrast/høj opløsning og en forudsigelig begrænset fostrets orientering7,8. Vi har tidligere beskrevet opførelsen og brugen af en ny lys-Sheet-baseret Dual-View inverteret selektiv plan belysning mikroskop (dispim) for levende prøve billeder såsom C. elegans embryogenese9,10 , 11 af , 12 ud af , 13. lysplade mikroskopi, generelt, giver lav fototoksicitet, høj hastighed, og langsigtet billeddiagnostik af levende 3D prøver14,15. Metoden diSPIM fremstiller specifikt fire-dimensionelle (4D) billeder med næsten isotropisk rumlig opløsning på ca. 330 nm9.
Sammenlignet med confokal mikroskopi, tilbyder diSPIM højere signal-støj og hastighed, mere isotropisk rumlig opløsning, og er mere velegnet til langsigtet in vivo Imaging16. Vi har derfor arbejdet på at tilpasse diSPIM data til input til StarryNite/AceTree og undersøgt, om dette ville forbedre lineaging analyserne. En større forhindring er, at dispim prøver ikke let kan begrænses af ægshell-kompression til at vedtage forventede retningslinjer for starrynite/acetree. Tilfældig orientering af celle positioner i den diskenhed, der analyseres, forringer nøjagtigheden af Auto-lineaging analyse.
Vi har derfor ansat CytoSHOW, en seer-guidet brugergrænseflade, som giver brugerne mulighed for at vælge præcis 3D orientering af embryoner under forbehandling af diSPIM billeder, giver billeddata, der er både kvalitet-optimeret og kontekst-Aware for input til StarryNite /AceTree. Ved brugervalg af indpakkede embryoner, organiserer CytoSHOW en automatiseret databehandling pipeline. Beskårne og baggrund-subtraede embryo billeder gemmes i TIFF stack-filer for hver position, tidspunkt og visning. Cytoshow derefter iterativt kalder programmet spimfusion at co-registrere og i fællesskab deconvolve de to præ-forarbejdede synspunkter, ved hjælp af Richardson-Lucy17,18 algoritme til at give isotropisk høj opløsning volumetriske billeder. En dispim-specifikke sæt af parametre er blevet optimeret til starrynite at styre sin adfærd under billed-segmentering og Nucleus-tracking i isotropisk smeltet billeder. Fusionerede billeder og lineaging resultater redigeres derefter ved hjælp af AceTree, som giver brugerne mulighed for at identificere og rette eventuelle fejl i Auto-Lineage spor genereret af StarryNite. AceTree kan også præsentere Lineage-træ og 3D modelleret gengivelser af sporede kerner i embryonet. Vi finder, at Auto-lineaging hastighed og nøjagtighed er markant forbedret ved hjælp af isotropisk smeltet billeder, sammenlignet med RAW-billeder fra enten spim kamera. Vores protokol, mens optimeret til C. elegans program beskrevet her, kunne generelt tilpasses til Auto-lineaging af dispim data produceret for andre arter eller enheder. Hvis dette er den tilsigtede anvendelse af protokollen, Bemærk venligst, at yderligere tuning af starrynite parametre vil sandsynligvis være påkrævet for nye enheder, som beskrevet3,4.
Vellykket gennemførelse af denne protokol resulterer i billeder med 4D-isotropisk opløsning og gør det muligt for biologer at spore celle lineages, samtidig med at identificere og analysere neuroner i det udviklende C. elegans embryo. Desuden, ved at fusionere flere efter behandling algoritmer-med hardwareacceleration er den mest tidskrævende af disse-vi kan nu analysere både fine under cellulære detaljer og celle-lineages og celle-skæbner af levende embryoner i stort set realtid. Denne nye protokol giver mulighed for præcis, informeret manipulation og observation af celle adfærd under bevis undersøgelser af differentiering og morfogenesis in vivo. I dette manuskript præsenterer vi en detaljeret forklaring på de forbedrede protokoller, vi har udviklet med henblik på lineaging og celle sporing i udviklingen af C. elegans -embryoner, for at forbedre undersøgelserne af embryogenesen, genekspression eller Neuro udvikling.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steps 1-4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concavity slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1519006</td>
			<td>5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with 10&#215;&#8211;50&#215; zoom range</td>
			<td>Motic</td>
			<td>SMZ-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, no. 1.5, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose &#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7509-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary pipette aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, no. 18G x 1 &#189; (1.2mm x 40mm)</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared as described by Brenner (1974)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring for imaging chamber</td>
			<td>O-Rings West</td>
			<td>M1.5X40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Corning/Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095D5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.5-mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>267201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm)</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td>I2450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Eyelash Pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hart, A. C. Behavior. WormBook.&#160; (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steps 5-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm long-pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-488 RU-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561-nm notch filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-561E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLP02-561R-25, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software for bottom camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td></td>
			<td>ProgRes CapturePro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSIPM assembly video</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSPIM alignment video</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>https://youtu.be/qnOrg30NNuE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSPIM imaging PC</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total,&#160;64&#160;GB memory, Windows 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF01-525/45-25, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF555-DI03-25X36, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging PC Graphics Card</td>
			<td>NVIDIDA</td>
			<td></td>
			<td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kumar et al diSPIM Setup</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 &#160;diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manager</td>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table with isolators, 4 feet &#215; 6 feet &#215; 12 inches</td>
			<td>TMC</td>
			<td>784-651-02DR and 14-416-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steps 7-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis PC</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis PC Graphics Card</td>
			<td>NVIDIDA</td>
			<td></td>
			<td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation instructions</td>
			<td>Software bundle</td>
			<td></td>
			<td>http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software bundle</td>
			<td>Software bundle</td>
			<td></td>
			<td>http://dispimlineage.wormguides.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isotropic light-sheet microscopy and automated cell lineage analyses to catalogue caenorhabditis elegans embryogenesis with subcellular resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) skiller sig ud som den eneste organisme, hvor udfordringen med at forstå den cellulære oprindelse af et helt nervesystem kan observeres, med en enkelt celle opløsning, in vivo. Her præsenterer vi en integreret protokol til undersøgelse af Neuro udvikling i C. elegans embryoner. Vores protokol kombinerer billeddannelse, lineaging og Neuro anatomisk sporing af enkeltceller i udvikling af embryoner. Vi opnår langsigtede, fire-dimensionelle (4D) billeddannelse af levende C. elegans embryoner med næsten isotropisk rumlig opløsning gennem brug af Dual-View inverteret selektiv plane belysning mikroskopi (dispim). Nuklei og neuronal strukturer i fyrretræsnematoden embryoner er afbildet og isotropisk smeltet til at give billeder med opløsning af ~ 330 nm i alle tre dimensioner. Disse minut-for-minut høj opløsning 4D datasæt analyseres derefter for at korrelere definitive celle-Lineage identiteter med genekspression og morfologiske dynamik på enkelt celle og subcellulære niveauer af detaljer. Vores protokol er struktureret til at muliggøre modulær gennemførelse af hver af de beskrevne trin og forbedre undersøgelser af embryogenesen, genekspression, eller Neuro udvikling.

Vi har først valideret levedygtigheden af embryoner, der er indpakket ved hjælp af protokollens parametre for diSPIM erhvervelse (afsnit 1-6). Ti embryoner blev samtidig indlagret ved 20 °C, et volumen/embryo/minut, fra 2-cellens fase til 2-dobling (7,5 timer, 451 volumen/embryo). For at overvåge celle divisioner i hele embryogenese brugte vi stamme BV514, som allestedsnærværende udtrykker Mcherry::histone reporter konstruterer fra den integrerede transgen matrix ujIs11324. Figur 6 viser en tidslinje for denne første halvdel af fosterudviklingen for en af de indpakkede embryoner. Hvert billede repræsenterer en enkelt visning maksimal intensitet projektion (produceret af trin 7-8) af det afbildet embryon. Vi konstaterede, at de optimerede protokoller ikke fremprovokeret nogen detekterbar fototoksicitet for embryonerne, vurderet ved timing af celle inddelinger (ikke vist), tidspunkt for klækning, og timing relateret til udviklingsmæssige milepæle (figur 6 og referencer1 , 25 stk. , 26).
Vi derefter anvendt protokollen til at analysere udvækst dynamik af enkelt neuroner i udvikling af embryoner. Vi afbildet DCR7692 (olaex4655), en transgene fyrretræsnematoden stamme, der udtrykker gfp off neuropeptid FLP-19 Promoter i en delmængde af uidentificerede celler (DACR2819, PFLP-19 (3.6 KB):: Syn21:: gfp:: caax::p 10 3 ' UTR) . Efter trinene i den protokol, der er skitseret her, besluttede vi, at de uidentificerede celler svarer til motoriske neuroner RMDDL og RMDDR, til den ekskretionsoriske kanal celle og til to muskelceller (figur 7). Derefter undersøgte og kvantificerede vi udvækstdynamikken i RMDDL og RMDDR neuroner. Vi bemærkede, at rmddl og rmddr neuroner er skråt formet så tidligt som 360 minutter efter befrugtning, med den længere cellulære akse, der repræsenterer den efterfølgende akse for neurite udvækst (figur 7 og Movie S1). Ved hjælp af den "simple neurite sporing" plugin i Fiji og anvende det til 3D rekonstruktioner af isotropisk smeltet mængder, vi derefter kvantificeret den stereotypiske udvækst af rmddl og rmddr neurites for seks embryoner. Vi fastslog, at udvækst-dynamikken var stereotyp for rmddl og rmddr på tværs af embryoner (heri kaldet rmdd'er). Fra 385-410 minutter efter befrugtning udvidede RMDDs neurites 6,0 ± 0,5 μm (gennemsnit ± SEM; n = 12 neurites) forreste af celle organerne (figur 7b, C, I). Fra 415-445 minutter efter befrugtning, begge neurites udvide dorsalt i og omkring den formodede nerve ring (stjerne i figur 7d). I gennemsnit udvidede hver RMDD neurite 11,0 ± 0,6 μm (middel ± SEM; n = 12 neurites) fra celle kroppen før synkront at møde sin kontralaterale modstykke i spidsen af ringen (figur 7i). Det er vigtigt, at vores repræsentative resultater viser, at vi er i stand til at undersøge, sammenligne og kvantificere neuronal udviklingsmæssige funktioner for enkelt identificerbare celler ved hjælp af vores integrerede protokol (figur 7 og figur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig1.jpg"> Figur 1: Opsætning af diSPIM-prøvemontering. A) fremstilling af dækglas med poly-L-lysin. I indsættet, 10 μl poly-L lysin blev brugt til at pels dækglas i 5 minutter. Poly-L-lysin tillader embryo ægskallen at holde fast til dækglas i rektanglet. B) skematisk af stål billedbehandlings kammeret og det samlede kammer. I den indsatte, repræsentative embryoner er orienteret med den forreste-posteriort akse vinkelret på den lange akse på coverslip. C) samlet aspiratorrør med mikrokapillar pipette. D) stål billedrum monteret i prøveholderen under dispim 40x-mål. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig2.jpg"> Figur 2: Opsætning af langsigtet diSPIM Imaging i Micro-Manager. (A) anbefalede dispim laser effektparametre (rødt rektangel) optimeret til langvarig billeddannelse og samtidig reducere fototoksicitet (vurderet ved højere udklæknings hastighed af C. elegans embryoner). Sæt 561 nm laser til 79 μW (0,25) og 488 nm laser til 179 μW (0,5). Bemærk, at nøjagtig kalibrering af software indstillinger til laser effekt varierer mellem diSPIM-installationer. Det anbefales, at brugerne måler og kalibrerer laser effekten for at opnå 79 μW (561 nm) og 179 μW (488 nm) laser effekt. (B) dispim parametre for databesparelse (grøn rektangel), lydstyrkeindstillinger (blå firkant), og udsnit indstillinger (orange firkant). (C) dispim autofokus parametre for langvarig billeddannelse af C. elegans embryogenese (Se trin 6.1-6.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig3.jpg"> Figur 3: billed visualisering og databehandlings opsætning ved hjælp af CytoSHOW. (A) RAW-dispim-billeder åbnet af cytoshow. CytoSHOW er i stand til at åbne billeder fanget af begge kamera stier (SPIM A og B). Disse rå billeder åbnes i flerdimensionelle Vinduer kaldet Dispim Monitor. I Dispim Monitorgenereres et "Bowtie mønster" for at udvælge fostrets forreste, bageste, dorsale og ventrale kanter (se trin 9,1). Bow-Tie valg indikerer embryo orientering for deconvolution og StarryNite-Assisted sporing af lineaging. (B) optimerede parametre, der anvendes til at generere isotropiske billeder. Angiv de parametre, der er angivet i trin 9.5.1-9.5.8, i vinduet Deconvolved, mens der anskaffer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig4.jpg"> Figur 4: konfiguration af diSPIM-kamera. (A) fotografi af dispim kameraplaceringer og retningslinjer. (B) skildring af + 90-graders rotationer af spim A til at MATCHE spim B billeder indsamlet. (C) input volumener i forhold til orienterings indeks + 1 baseret på vores dispims kamera konfiguration (Se trin 9.5.2). Vi roterer SPIM et billede (r) + 90 grader omkring Y-aksen før registrering for at matche SPIM B billede (r). Skala bjælker = 10 μm. billeder er repræsentative enkelt-visning, maksimal intensitet fremskrivninger og deconvolution billeder af 1,5-fold embryo med mærkede kerner (561-nm, rød) og neuroner (488-nm, grøn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig5.jpg"> Figur 5: curation og redigering C. elegans embryonale afstamning i acetree. (A) vi bruger acetree til at redigere starrynite Lineage spor (Se referencer5,6,8; manuskripter er også inkluderet i vores download Bundle). AceTree vil vise C. elegans systematiske navne for hver kerne (grøn rektangel) efter afslutning af trin 10.1-10.2. Dette vindue (a) indeholder oplysninger (sort rektangel) om hver celle i Lineage-sporingen (ABa, fremhævet med blåt), der hjælper brugerne, når de sporer og redigerer Lineage-sporene. Det anbefales, at brugerne kontrollerer og sammenligner lineare celler og deres positioner til C. elegans embryonale celle Lineage, der tidligere er indberettet af sulston et al.1 desuden, hvis brugerne er interesseret i at finde bestemte celler i deconvolved dataserie (se nedenfor, B) Indtast C. elegans systematiske navn i søgefeltet (orange rektangel). (B) brugerens deconvolveret dataserie åbnes også automatisk, når trin 10.1-10.2 er afsluttet. Vist her en isotropisk smeltet billede af en fire-cellet fase embryo med kerner mærket med rødt. Under sporing af en kerner, bør brugerne ændre intensiteten af billedet (rød firkant) og navigere gennem tiden og z ved hjælp af piletasterne på deres tastatur (tid-venstre/højre, z-op/ned). (C) 3D-tegneserie af tidspunktet i (b) med visse funktionaliteter (lilla rektangel), der muliggør roterbare 3D-visualisering. Se referencerne5,6,8for at få en oversigt over acetree og dens 3D-funktionalitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig6.jpg"> Figur 6: tidsindstillet udviklingsdynamik af C. elegans embryoner på dispim. Toppanel, diSPIM billeder, der viser den første halvdel af fosterudvikling for en af de afbildnede embryoner (Strain BV514 ujIs11324). Embryonerne blev kontinuerligt indpakket, hvert minut i 7,5 timer (ved 20 °C). De første to billeder af toppanelet repræsenterer 4-og 8-cellede embryoner med kerner (rød) og positioner af polære kroppe (tætte røde kugler, markeret med blå asterisker). Hvert billede repræsenterer en enkelt visning maksimal intensitet projektion af det afbildet embryon. Skala stænger = 10 μm. Tidslinjen (vandret linje) repræsenterer minutter efter befrugtning (m.p.f.) af udviklingen af C. elegans embryoner. Vi validerede, at vores protokol's parametre for diSPIM erhvervelse ikke inducerede nogen detekterbar fototoksicitet for de indpakkede embryoner som vurderet af levedygtighed, timing af celle divisioner, tidspunkt for klækning og timing af udviklingsmæssige milepæle (Se referencer 1 af , 25 stk. , 26). Vi bemærker, at timingen af udviklingsmæssige milepæle var reproducerbare på tværs af embryoner med vores Imaging parametre (SEM ± 8,174 minutter for 6,4 time lange billedbehandling sessioner; n = 10). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig7_v2.jpg"> Figur 7. Cellulære identifikation og enkelt celle karakterisering af neurite udvækst dynamik i udviklingen af C. elegans embryoner. Dual-Color Imaging af en stamme foretaget ved passage BV514 ujIs11324 (for lineaging) og DCR7692 (olaex4655), en transgene fyrretræsnematoden stamme, der udtrykker gfp off Neuro peptid FLP-19 Promoter i en delmængde af uidentificerede celler. (a-H) Efter trinene i den protokol, der er skitseret her, vi fastslået, at de uidentificerede celler svarer til motor neuroner RMDDL og RMDDR (gule pile), at den ekskretionsoriske kanal celle (blå pile), og to muskelceller (hvide pile). (I) kvantificering af udvækstdynamikken i rmddl-og rmddr-neuronerne ved hjælp af Fijis plugin "simpel neurite Tracing" og anvendelse af det på 3D-rekonstruktioner af isotropisk fusionerede volumener. Bemærk, hvordan både rmddl og rmddr viser stereotypisk udvækst-dynamik, der hver især strækker sig synkront for en samlet længde på 11,0 ± 0,6 μm (gennemsnit ± SEM; n = 12 neurites) og møde ved dorsale spids af nerve ring (Se også film S1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig8.jpg"> Figur 8: undersøgelse af isotropic diSPIM billeder af neuronal morfologier i C. elegans embryoner. Isotropisk visualisering af AVHL-og AVHR-neuroner (gule pile). Ved hjælp af diSPIM, neuronal morfologier kan optages giver fire-dimensionelle (4D) billeder med isotrope rumlig opløsning på ca 330 nm. Den diSPIM giver brugerne mulighed for næsten at rotere billed mængder med identisk opløsning i alle retninger. Billeder i A-D er maksimal intensitet fremskrivninger af samme isotropisk smeltet dispim billede volumen fra forskellige rotationer omkring embryoets lange akse. Skala stænger = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig8large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende film S1: C. elegans embryo udvikler sig fra 280 til 434 minutter efter befrugtning. Isotropisk film af stamme DCR7692 (olaex4655) udtrykker ujIs113 allestedsnærværende med DACR2819 tyndt mærknings rmdd Neurites (figur 7a-D, gule pile). DACR2819 også etiketter to muskelceller (figur 7a-d, hvide pile) og excretoriske kanal celle (figur 7a-d, blå pil) under fosterudvikling (figur 7a-d). Skala stænger = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/Movie_S1.mov">venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution at JoVE.com

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Her præsenterer vi en kombinatorisk tilgang ved hjælp af høj opløsning mikroskopi, beregningsmæssige værktøjer, og enkelt celle mærkning i levende C. elegans embryoner til at forstå enkelt celle dynamik under neurodevelopment.

Isotropisk lys-Sheet mikroskopi og automatiseret celle Lineage analyser til kataloget Caenorhabditis elegans Embryogenesis med Subcellular opløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Denne protokol muliggør effektiv sporing af celle slægter og identiteter i levende embryoner og samtidig analysere detaljerede celle morfologier såsom axoner og dendritter i udviklingen af C.elegans neuroner. Sammenlignet med konfokal mikroskopi, dual-view inverteret selektiv plan belysning mikroskopi eller diSPIM tilbyder højere signal til støj, mere isotropisk rumlig opløsning, og er bedre egnet til langsigtet in vivo imaging. Begynd med at tilføje 500 mikroliter af 1% methylcellulose opløsning i depression af en konkav mikroskop dias.Ved hjælp af en platin wire pick, overføre voksne fra en nematode vækst medium plade i M9 methylcellulose løsning. Brug de skærpede spidser af 18 gauge hypodermiske nåle til at skære hvert dyr på tværs af kroppen til mindst en til fire celle embryoner. Med en aspirator mundstykke holdes forsigtigt mellem tænderne, prefill en microcapillary pipette med 10 til 15 mikroliter af M9 buffer og forsigtigt aspirere flere embryoner fra diaset ind i kapillær.Embryoerne skal afleveres i det centrale rektangel i dækslet fra et stålbilledbilledkammer fyldt med frisk M9-buffer. Forsigtigt orientere embryonerne lodret, således at hvert embryons lange akse er vinkelret på dækslets lange akse. Anlæder derefter stålbilleddannelseskammeret i prøveholderen på scenen af en diSPIM.For at forberede embryonerne til billeddannelse skal du åbne mikrostyringen og indstille laserintensiteten til 179 mikrowatt 0,5 %ækvivalens for 488 nanometer og 79 mikrowatt 0,25 %ækvivalens for 561 nanometer. Kalibreringen mellem softwarejustering og ægte laseroutput skal ske på et tidspunkt for at sætte rammerne for specifikke mikrowatt. I menuen plugins skal du vælge enhedskontrol og anvendt videnskabelig billedbehandling diSPIM for at åbne det anvendte videnskabelige billedbehandlingsvisint set-inverteret selektivt flybelysningsmikroskopivindue.Under fanen Anskaffelse skal du bekræfte, at parametrene er angivet som angivet. Angiv parametrene som angivet under fanen Autofokus. Bemærk, at autofokuskanalen skal angive den nukleare fluorescenskanal for de planlagte lineaging-eksperimenter.Kontroller bjælken og arkboksene for sti A eller B, og klik live for at starte billedopetagelsen. Der åbnes et live view-vindue. Træk derefter en boks rundt om embryoet af interesse for at vælge embryonets autofokusanalyseområde og klik på start anskaffelse for at starte det langsigtede flerdimensionale billedoptagelse.For billedvisning, behandling og celle afstamning analyse, efter at have downloadet og udpakket software bundt, dobbeltklik på CytoSHOW_app. jnlp fil til at begynde at køre CytoSHOW. Vælg ny og diSPIM-skærmmikrostyring under filmenuen for at finde den roddatasætmappe, hvor de rå mikrostyringsbilleder blev gemt.Vælg en hvilken som helst tidspunktmappe, og klik på åbn. Flerdimensionale navigationsvinduer åbnes automatisk for både SPIM A og SPIM B.Using the polygon selection tool, click lige uden for den forreste, bageste, dorsale og ventrale kanter af embryo af interesse for at generere en butterfly mønster over fosteret i både SPIM A og SPIM B visninger og klik diSPIM. Juster de grønne og røde kanaler for hver SPIM-arm, og klik diSPIM igen.Skiftene udløses i alle de andre positionsvinduer. Klik derefter på diSPIM, og sikring for at åbne dialogboksen med deconvolved sikring diSPIM-rå datamængder og angive parametrene som angivet. Når alle parametrene er angivet, skal du klikke på ja og angive den outputmappe, hvor de behandlede filer skal gemmes, før du klikker på OK. I eksempelvinduet skal du flytte t-rullepanelet til tidspunkt to i vinduet og flytte z-skyderen, indtil visningen vises direkte langs embryonens lange akse.Flyt t-scroll-bjælken tilbage til et tidspunkt i eksempelvinduet, og brug stregmarkeringsværktøjet til at tegne en linje fra den mest runde vent kerne gennem planet af AB-cellemetastpladerne. Klik på diSPIM-eksempelknappen for at gemme de fine justeringer af retningen af den viste billedvolumen. Indstil t-scroll-panelerne i diSPIM-skærmvinduerne til start- og sluttidspunkterne for det fulde billedespænd, der skal behandles.Klik derefter på OK. For at opnå en effektiv og nøjagtig cellelinjeanalyse er det afgørende at opnå en præcis ADL-retning af datamængderne før Behandling af Stjernelysnatten. Hvis du vil åbne sporingsserien Stjerneklar nat i AceTree, skal du åbne den medfølgende tilpassede AceTree-fil og vælge åbn konfigurer fil for at finde den tidligere angivne outputmappe. Åbn sikringsundermappen for det foregangs embryon, og vælg den redigerede fil.Klik derefter på Åbn, og fortsæt med afstamningsvisualiseringen og -redigeringen som tidligere beskrevet. Optimerede protokoller fremkalder ikke nogen påviselig fototoksicitet til embryonerne som vurderet på tidspunktet for udklækning og timingen i forbindelse med udviklingsmilepæle. Ved hjælp af denne protokol som påvist, de uidentificerede celler i denne transgene grønne fluorescerende protein udtrykker nematode stamme blev bestemt til at svare til motoriske neuroner, ekskreturer kanalen celle, og to muskelceller.De identificerede neuroner blev skråt formet så tidligt som 360 minutter efter befrugtningen med den længere cellulære akse, der repræsenterer den efterfølgende akse for neurite udvækst. Fra 385 til 410 minutter efter befrugtningen, rmdd neurites udvidet cirka seks mikrometer forreste af celle organer. Fra 415 til 445 minutter efter befrugtningen, både neurites udvidet dorsally ind og omkring den formodede nervering.I gennemsnit forlængede hver RMDD neurite ca. 11 mikrometer fra cellekroppen, før de synkront mødte sin kontralaterale modstykke ved ringens spids. Samlet set viser disse data, at neuronale udviklingsmæssige funktioner for enkelt identificerbare celler er i stand til at blive undersøgt, sammenlignet og kvantificeret ved hjælp af denne integrerede protokol. Det er vigtigt at huske at orientere embryonerne lodret, så hvert embryons lange akse er vinkelret på dækslets lange akse.Ved hjælp af denne protokol, er vi begyndt at udforske den spirende embryonale nervesystem fra alle vinkler. For eksempel, under celle fødsel, migration og differentiering, neurite dannelse, udvækst og fasciculation.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattende vurdering af Kimcellelinje kemiske toksicitet Brug nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Brug Light Sheet Fluorescens mikroskopi til billede zebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Co-lokalisering af Cell Lineage Markers og tomat Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Cell Lineage Analyser og genfunktion undersøgelser under anvendelse af Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Lys Sheet-baserede Fluorescence Microscopy af Leve- eller fikseres og farves<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryoner

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple og robuste protokoller til behandling og visualisering af organiske materialer

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelationsmaalinger super-opløsning og elektronmikroskopi at løse Protein lokalisering i zebrafisk nethinden

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering af Caenorhabditis elegans at analysere intracellulær Transport i neuroner

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Vurdering af lysosomale basisk i tarmen af Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse af hjerte kammer udvikling under musen embryogenese bruger hele bjerget epifluorescensmikroskop

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...