Name: isotropic light-sheet microscopy and automated cell lineage analyses to catalogue caenorhabditis elegans embryogenesis with subcellular resolution
Uploaded: 2019-06-06T14:00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution at JoVE.com

Wir danken John Murray für die integrierte Sorte, ujIs113, für die Erzeugung von Linienstrakt BV514; Brandon Harvey (NIBIB) für die Hilfe beim Testen des Protokolls; Jon Daniels und Gary Rondeau (Angewandte wissenschaftliche Instrumente) für die Unterstützung von Micro-Manager und DiSPIM-Instrument; Und Andrew York und Hank Eden für ihr kritisches Feedback zum DiSPIM-System. Wir danken auch dem Forschungszentrum für Minderheitseinrichtungen und dem Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) für die Bereitstellung einer Tagungs-und Brainstorming-Plattform. Ein großer Teil dieser Arbeit wurde im Rahmen des Whitman Programms am Marine Biological Laboratory in Woods Hole durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die intramuralen Forschungsprogramme des NIH-Nationalen Instituts für Biomedizinische Bildgebung und Bioengineering und durch das NIH-Stipendium Nr. U01-HD075602 und Nr. R24-OD016474. Mark W. Moyle wurde von F32-NS098616 und Leighton H. Duncan unterstützt von einem Diversity Supplement to R24-OD016474.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

C. elegans sticht als der einzige Organismus mit den letzten Positionen und der Konnektivität jedes erwachsenenNeuronsbekannt 27. Die Entwicklungsdynamik, die zur Organisation der Arbeitskreise und Netzwerke führt, aus denen sich die C. elegans connectome zusammensetzt, ist jedoch unbekannt. Basierend auf den Chancen, die sich aus den Fortschritten in der Lichtmikroskopie ergeben, können wir nun Zellpositionen, Morphogenese und Neurogenese in der gesamten Embryonalentwicklung von C. elegans erfassen und analysieren.
Die Prozedur, die wir beschrieben haben und die wir routinemäßig im Labor verwenden, liefert 4D-isotrope Bilder von beschrifteten Neuronen und Kernen für die Zelllineare in C. eleganischem Embryonen. Noch wichtiger ist, dass wir mit den DiSPIM und den gekoppelten semi-automatischen Linienbildungsfunktionen langfristige Bildgebungsbedingungen optimiert haben, um die Geschwindigkeit und Präzision der Analyse von C. elegans Embryogenese zu verbessern. Dieses integrierte Protokoll wird es den Nutzern ermöglichen, Zellen zu visualisieren und zu identifizieren und dreidimensionale Merkmale wie Neuriten-Migration und Axonfaschisierung durch den Beginn des frühen Twitching zu quantitieren. Dieses Verfahren lässt sich mit einem ASI-DiSPIM-System problemlos in jede Anlage integrieren, und wir empfehlen dieses System speziell für dieses Protokoll. Andere SPIM-Formulierungen, die kommerziell angeboten werden, können sich von der ASI-Konfiguration in der Probenkammer und den optischen Eigenschaften unterscheiden. Daten, die von anderen Plattformen exportiert werden, können aber auch über unsere Datenpipeline übertragen werden. Daher ist eine Bewertung ihres Wertes in der Linienführung, einem anspruchsvollen Test der Bildqualität und der Stabilität des Instruments, machbar. Auch wenn wir die DiSPIM aktiv nutzen, um regelmäßig andere Exemplare (wie Drosophila und Zebrafisch-Embryonen) abzubilden, ist die beschriebene und umfassende lineätische Analyse von Embryonen derzeit noch auf die Nematoden-Arten beschränkt. Bei größeren oder dicken Proben entscheiden wir uns für die Verwendung von Bühnenscannern, die die Proben durch ein stationäres Lichtblech scannen. Kumar et al. haben zuvor diese verbesserte DiSPIM-Sparung demonstriert, um qualitativ hochwertige Bilder aus dicken Proben ohne zusätzliche Änderungen an der DiSPIM10zu erzeugen.
Zu den kritischen Schritten innerhalb des Protokolls gehören die Montage von C. elegans Embryonen an der poly-Lysin-lysin-beschichteten Coverslip, Datenerfassung und Datenverarbeitung. Die Ernte und Montage von C. eleganischem Embryonen an den Glaskappe kann für unerfahrene Anwender eine Herausforderung sein, aber hier stellen wir ein detailliertes Protokoll der wichtigsten Schritte zur Verfügung, um das Lernen zu erleichtern. Wenn eine langfristige Bildgebung gewünscht ist, erhalten wir die besten Ergebnisse bei der Ernte von Vierzellen oder früheren Embryonenvon 8-10 jungen Erwachsenen 28. Es ist zu beachten, dass ältere Erwachsene weniger wünschenswert sind, Embryonen im Frühstadium zu ernten, da sie dazu neigen, ältere Embryonen in der Gebärmutter und unbefruchtete Eizellen zu enthalten. Bei der Montage von Embryonen können Probleme wie die Blockade des montierten Aspirators (Mundpipette) oder eine zu große Öffnung in der Mikrokapillarpipette eine korrekte Montage und Orientierung der Embryonen verhindern. Um sich auf eine optimale Bildgebung vorzubereiten, führen wir Vorbeschaffungstests an frühen und späten Pre-twittifenden Embryonen durch, um die Leistung der Lichtblätter, Kameras, Ziele und Autofokus zu überprüfen. Wir erzielen beste Ergebnisse, wenn alle diese Operationen getestet werden und liefern qualitativ hochwertige Bilder während unserer Vorbeschaffungstests. Dies ist vor allem für die Erzeugung von Bildern mit isotropher Raumauflösung von Bedeutung, für die Rohbilder, die aus beiden Blickwinkeln (Ziele) aufgenommen wurden, von hoher Qualität sein müssen. Nach der Akquisition werden die für jede Ansicht erworbenen Volumina zu isotropen Bildern verarbeitet. Es ist wichtig, eine entsprechende Grafikverarbeitungseinheit (GPU) zu verwenden, wie in diesem Protokoll beschrieben (siehe unten). Dadurch wird die Verarbeitungsgeschwindigkeit verbessert, mit der die isotropical verschmolzenen Bilder erzeugt werden, was die Zeit für Datenanalysen verkürzt. Es ist auch zwingend erforderlich, dass die Benutzer die neueste Version von CytoSHOW verwenden und die mit unserem Download-Bundle für StarryNite Auto-Linaging zur Verfügung gestellten Parameter verwenden. Wenn Nutzer daran interessiert sind, die automatische Linie für andere Proben (z.B. Zebrafische, Drosophila etc.) zu verwenden, ist eine zusätzliche Optimierung der in StarryNite verwendeten Parameter erforderlich (siehe Referenzen3,4).
Obwohl unser integriertes Protokoll Bilder und Linienresultate im Pre-twitching-Embryo liefert, sollten sich die Nutzer darüber im Klaren sein, dass eine automatisierte Linienführung im Post-twittiching-Embryo derzeit nicht machbar ist: Die nuklearen Positionen ändern sich in der Reihenfolge der Sekunden in der Nachzwitschern Embryo, zu schnell, um Abstammung zu ermöglichen. In der Tat hat die DiSPIM in der Tateinevielversprechende Fähigkeit gezeigt, neuroentwicklungsbedingte Ereignisse zu erfassen und einige Zellpositionen in den nachtwitternden Stadien der Embryogenese 23,29zu verfolgen. Wenn Nutzer daran interessiert sind, den nachtwitternden Embryo zu untersuchen, bietet das diSPIM die Geschwindigkeit an, um volumetrische Schnappschüsse zu erhalten und feine neuroentwicklungsbedingte Ereignisse, wie Neuriten-Auswuchs, in schnell bewegten Embryonen zu verfolgen.
Dieses Protokoll wird für die Zell-by-Zell-Fertigstellung des WormGUIDES Atlas 30 grundlegend sein,da es einen integrierten Ansatz mit hochauflösenden isotropen Bildern bieten wird, um 3D-Morphologien von beschrifteten Neuronen zu identifizieren und zu erfassen. Die ersten 430 Minuten der Embryogenese. Der Prototyp WormGUIDES Atlas liefert derzeit nukleare Positionen von Zellen im sich entwickelnden Embryo und zielt darauf ab, die Entwicklungsdynamik einer Teilmenge von embryonalen Neuronen zu erfassen. Dieses Protokoll wird ein Schlüssel für die Integration von zusätzlichen sich entwickelnden Neuronen in den WormGUIDES Atlas30 sein.
Unser integriertes Protokoll wird auch die Erforschung neuer Genexpressionsprofile im C. eleganischen Embryo vereinfachen. In transgenen C. elegans steuernviele zellspezifische Promoter räumlich und zeitlich die Transgenexpression. Während die Expressionsmuster der meisten Gene beim erwachsenenTier 31,32, 33,34ausgiebig charakterisiert wurden, müssen in der Entwicklung fast alle noch charakterisiert werden (insbesondere Spätstadium) Embryo. Das Promoterom C. elegans war eine nützliche Ressource für die Wurmgemeinschaft, um die zellspezifische Transgene-Expression zu fördern und festzustellen, ob die G-Funktion zellautonom oder nicht autonom ist. Die Erfassung isotropes hochauflösender und dynamischer Expressionsmuster von Genen und die präzise Identifizierung von Expressionsgegenständen über Linaging wird für viele in der wissenschaftlichen Gemeinschaft wertvoll sein.
Die Embryogenese besteht aus zwei miteinander verknüpften Hauptprozessen, der zellulären Differenzierung und der Gewebemorphogenese. Über die Mechanismen und Moleküle, die bei der Entwicklung von C. elegansverschiedene Zelltypen definieren, ist viel bekannt. Über die Mechanismen, die für die Zellmigration, die Zellhaftung und die Zellform im C. eleganischem Embryo wichtig sind, ist jedoch wenig bekannt. Mit der invarianten Zelllinie C . elegans können wir mit unserem Protokoll die katalogisierte 3D-Mikroanatomie des Embryos während der Morphogenese auf neuen Detailebenen erkennen: z.B. Axonfaschisierung, Synaptogenese und neuronale Aktivität. Ardiel et al. haben zuvor die Macht des DiSPIM demonstriert, Kalziumvergängiger auf der Ebene eines einzelnen Neurons in C. elegans Embryonen23 zu erfassen. Viele andere Aspekte der Entwicklungsphysiologie sind mit diesen Methoden reif für die Untersuchung.
Schließlich ist dieses Protokoll weitgehend automatisiert und reduziert systematisch die Zeit, die es braucht, um Dekonvolution-Bilder zu erzeugen und Zell-Linienführung über StarryNite und Acetree durchzuführen. Die in diesem Protokoll verwendeten Softwarestrategien können auf viele Fragen der Biologie angewendet werden, die weit von den ganz spezifischen Bereichen entfernt sind, in denen wir sie hier demonstriert haben.
Details zur Software-Kompatibilität und zum Download-Zugang
Informationen zu Micro-Manager und Plugins für die DiSPIM-Bildgebung gibt es bei http://dispim.org/software/micro-manager und https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
Die Datenverarbeitungs-Pipeline benötigt derzeit ein Windows-Betriebssystem. Wir haben eine einzelne Archivdatei gebündelt, um die Installation aller erforderlichen Datenverarbeitungsprogramme und Support-Dateien zu vereinfachen. Sie steht zum Download auf http://dispimlineage.wormguides.org zur Verfügung.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) basiert auf der weit verbreiteten und Open-Source-Bildanalyseplattform ImageJ (v1). Java muss auf dem Computer installiert und auf dem neuesten Stand sein, um CytoSHOW zu verwenden, und Updates zu CytoSHOW werden automatisch über Java Web Start eingesetzt. Viele ImageJ-basierte Funktionen von CytoSHOW sind wie beschrieben und auf https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html illustriert. CytoSHOW wurde angepasst, um mehrdimensionale Rohdaten des ASI diSPIM sowie anderer Bildbearbeitungssoftware anzuzeigen, die TIFF-Ausgabe erzeugt. Im Prinzip könnten andere SPIM-Bildgebungssysteme mit mehreren Ansichten durch kleinere Modifikationen von CytoSHOW unterstützt werden, um dieses Protokoll auf verschiedenen Mikroskopsystemen durchführen zu können.

SpimFusion wurde in CUDA/C + + mit Visual Studio 2013 mit CUDA Toolkit v7.5 geschrieben. Das Laufen von SpimFusion erfordert eine spezielle Computer-Hardware: Eine NVIDIA-Grafikverarbeitungseinheit (GPU) mit CUDA-Komputationsfähigkeit 1,0 oder höher und mindestens 2 GB Grafikkarten-Speicher. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung unseres Protokolls ist SpimFusion unveröffentlicht (Min Guo und Hari Shroff), aber im oben genannten Software-Bündel-Archiv verfügbar.

Eine speziell gebaute Kommandozeilenversion von StarryNite verlangt, dass der frei verfügbare MATLAB Compiler Runtime installiert ist, aber keine Lizenz für kommerzielle MATLAB-Software benötigt. Der MATLAB Compiler Runtime ist im oben genannten Software-Bundle-Archiv enthalten. Der Code für StarryNite, wie er in diesem Protokoll verwendet wird, ist im Wesentlichen unverändert als der für konfokaleBilder 6. Allerdings wurden hier mehrere operative Fragen bei der Erstellung von Eingangsbildern für die StarryNite-Verarbeitung und dem Umgang mit StarryNit-Ergebnissen mit Methoden in CytoSHOW befasst, die eine kontinuierliche Datenverarbeitungs-Pipeline für verschmolzene isotrope diSPIM ermöglichen. Volumes. Diese Änderungen werden durch den CytoSHOW-Code automatisiert, der diese Vor-und Nachbearbeitungsschritte bearbeitet. CytoSHOW editiert auch eine voroptimierte diSPIM-spezifische Vorlage StarryNite Parameter gesetzt, um automatisch den Segmentierungsalgorithmus auf die Fluoreszenz-Intensität von Kernen in den abgebauten Daten zu stimmen. Die einzigartigen Parameter, die StarryNite auf jedem DiSPIM-Datensatz verwendet, werden dann zusammen mit dem Ausgabebild und den Liniendaten in einer Datei gespeichert.
Eine benutzerdefinierte Version von AceTree, die mit 16-Bit-Bildern arbeitet und die Kompatibilität mit dem Joom3D-Rendering beibehält, ist für dieses Protokoll am besten geeignet. Es ist auch in dem oben genannten Software-Paketarchiv enthalten.

C. elegans sticht als einziger Organismus hervor, in dem jede Zelle im Embryo während der gesamten Neuroentwicklung beobachtet werden kann. Mit der gesamten Zelllinie bekannt und invariant1, und mit der Entwicklung neuer Werkzeuge, die die Kennzeichnung und kontinuierliche Abbildung von einzelnen Zellen in Embryonen ermöglichen, können Biologen nun beginnen, verschiedene Schritte in der Entwicklung der Nematoden nervös zu untersuchen System aus allen Blickwinkeln-Zellgeburt; Migration und Differenzierung; NeuritBildung, gezieltes Auswachsen und Faschisierung; Synapsbildung; Und Abstimmung von Funktionskreisen. Die Erfassung der neuronalen Auswuchsdynamik im C. eleganischen Embryo durch die Kombination von stabil ausgedrückten Reportern und Fluoreszenzmikroskopie ist für die wissenschaftliche Gemeinschaft wertvoll.
Die Entwicklungsstudien in C. elegans nutzen oft die invarianten Zellabstammung und die Karten des Zellschicks dieser Art, um das kontextbezogene Verständnis auf der Einzeller-Ebene imintakten Organismus zu erweitern. Die Auto-Line-Age-Analyse-mit der Software StarryNite2,3, 4 und AceTree5,6, 7, 8-profitiertvon hohem Kontrast,hoher Auflösung Bilder von fluoreszierenden Kernen. Um optimal zu arbeiten, hängt StarryNite/AceTree auch von einer vorhersehbaren eingeschränkten Orientierung der abgebildeten Embryonen während der Entwicklung ab. Die konfokale Mikroskopie, die in C. eleganischem Embryonen, die zwischen zwei Coverslips komprimiert werden, durchgeführt wird, ist seit mehr als einem Jahrzehnt die Standardmethode der Autolinesmikroskopie, weil sie sowohl eine hohe kontrast-/hohe Auflösung als auch eine vorhersehbare Beschränkung bietet. Ausrichtung des Embryos7,8. Wir haben zuvor den Bau und die Verwendung eines neuartigen Lichtbogen-Basis, das selektive Flächenbeleuchtungsmikroskop (diSPIM) für die Live-Probenbildgebungwie C. elegans embryogenesis 9, 10 verwendet . , 11 , 12 , 13. Die Lichtbogenmikroskopie bietet in der Regel eine geringe Phototoxizität, hohe Geschwindigkeit und eine langfristige Abbildung von lebenden 3D-Exemplaren14,15. Die DiSPIM-Methode erzeugt insbesondere vierdimensionale (4D) Bilder mit einer nahezu isotropen Raumauflösung von etwa 330 nm9.
Im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie bietet diSPIM eine höhere Signal-zu-Rausch-und-geschwindigkeit, eine isotropere Raumauflösung und eignet sich besser für die langfristige Bildgebung16 . Deshalb haben wir daran gearbeitet, die diSPIM-Daten für die Eingabe in StarryNite/AceTree anzupassen und zu untersuchen, ob dies die Linienanalysen verbessern würde. Eine große Hürde ist, dass DiSPIM-Exemplare nicht einfach durch Auberginen-Kompression eingeschränkt werden können, um erwartete Orientierungen für StarryNiteTree zu übernehmen. Die zufällige Ausrichtung der Zellpositionen in dem analysierten Volumen mindert die Genauigkeit der Auto-Line-Analyse.
Wir haben daher CytoSHOW, eine von den Seiten geführte Benutzeroberfläche, eingesetzt, die es Nutzern ermöglicht, bei der Vorverarbeitung von DiSPIM-Bildern eine präzise 3D-Ausrichtung von Embryonen auszuwählen, die sowohl qualitätsoptimierte als auch kontextbewusste Bilddaten für den Einstieg in StarryNite liefert. /AceTree. Bei der Nutzerauswahl von abgebildeten Embryonen inszeniert CytoSHOW eine automatisierte Datenverarbeitungs-Pipeline. Eingeschreifte und rückensubtrahierte Embryo-Bilder werden in TIFF-Stapeldateien für jede Position, jeden Zeitpunkt und jede Ansicht gespeichert. CytoSHOW ruft dann iterativ das Programm SpimFusion auf, die beiden vorverarbeiteten Ansichten gemeinsam zu registrieren und gemeinsam zu dekonvolvieren, indem er den Richardson-Lucy 17,18Algorithmus verwendet, um isotrope hochauflösende volumetrische Bilder zu liefern. Für StarryNite wurde ein diSPIM-spezifischer Parametersatz optimiert, um sein Verhalten während der Bildsegmentierung und der Nukleus-Tracking in isotropical verschmolzenen Bildern zu steuern. Geschmolzene Bilder und Liniengebnisse werden dann mit AceTree bearbeitet, was es dem Benutzer ermöglicht, Fehler in der von StarryNite generierten Auto-Linie zu erkennen und zu beheben. AceTree kann auch Line-Baum-und 3D-modellierte Renderings von geprägten Kernen im Embryo präsentieren. Wir stellen fest, dass die Geschwindigkeit und Genauigkeit der automatischen Linie durch isotropical verschmolzene Bilder deutlich verbessert wird, im Vergleich zu Rohbildern der beiden SPIM-Kameras. Unser Protokoll, das für die hier beschriebene C . elegans-Anwendung optimiert wurde, könnte in der Regel für die automatische Abfertigung von DiSPIM-Daten, die für andere Arten oder Proben produziert werden, angepasst werden. Wenn es sich um die beabsichtigte Verwendung des Protokolls handelt, beachten Sie bitte, dass für neue Exemplare eine zusätzliche Abstimmung der StarryNite-Parameter erforderlich ist, wie beschrieben3,4.
Die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls führt zu Bildern mit 4D-isotropen Auflösung und ermöglicht Biologen, Zelllinien zu verfolgen und gleichzeitig Neuronen im sich entwickelnden C. eleganischen Embryo zu identifizieren und zu analysieren. Darüber hinaus können wir durch die Verschmelzung mehrerer nachverarbeiteter Algorithmen-wobei die Hardwarebeschleunigung die zeitaufwändigste dieser Algorithmen ist-nun sowohl feine subzelluläre Details als auch die Zelllinien und Zellverschlüsse lebender Embryonen in einer im Wesentlichen realen Zeit analysieren. Dieses neue Protokoll ermöglicht eine präzise, informierte Manipulation und Beobachtung des Zellverhaltens während der probativen Studien der Differenzierung und Morphogenese in vivo. In diesem Manuskript stellen wir eine detaillierte Erklärung der verbesserten Protokolle vor, die wir für die Linienführung und die Zellverfolgung in der Entwicklung von C. eleganischem Embryonen entwickelt haben, um Studien zur Embryogenese, Genexpression oder Neuroentwicklung zu verbessern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steps 1-4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concavity slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1519006</td>
			<td>5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with 10&#215;&#8211;50&#215; zoom range</td>
			<td>Motic</td>
			<td>SMZ-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, no. 1.5, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose &#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7509-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary pipette aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, no. 18G x 1 &#189; (1.2mm x 40mm)</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared as described by Brenner (1974)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring for imaging chamber</td>
			<td>O-Rings West</td>
			<td>M1.5X40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Corning/Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095D5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.5-mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>267201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm)</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td>I2450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Eyelash Pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hart, A. C. Behavior. WormBook.&#160; (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steps 5-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm long-pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-488 RU-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561-nm notch filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-561E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLP02-561R-25, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software for bottom camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td></td>
			<td>ProgRes CapturePro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSIPM assembly video</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSPIM alignment video</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>https://youtu.be/qnOrg30NNuE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSPIM imaging PC</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total,&#160;64&#160;GB memory, Windows 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF01-525/45-25, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF555-DI03-25X36, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging PC Graphics Card</td>
			<td>NVIDIDA</td>
			<td></td>
			<td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kumar et al diSPIM Setup</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 &#160;diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manager</td>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table with isolators, 4 feet &#215; 6 feet &#215; 12 inches</td>
			<td>TMC</td>
			<td>784-651-02DR and 14-416-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steps 7-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis PC</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis PC Graphics Card</td>
			<td>NVIDIDA</td>
			<td></td>
			<td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation instructions</td>
			<td>Software bundle</td>
			<td></td>
			<td>http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software bundle</td>
			<td>Software bundle</td>
			<td></td>
			<td>http://dispimlineage.wormguides.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isotropic light-sheet microscopy and automated cell lineage analyses to catalogue caenorhabditis elegans embryogenesis with subcellular resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) sticht als einziger Organismus hervor, in dem die Herausforderung, die zellulären Ursprünge eines gesamten Nervensystems zu verstehen, mit einer einzigen Zellauflösung in vivo beobachtet werden kann. Hier stellen wir ein integriertes Protokoll zur Untersuchung der Neuroentwicklung in C. eleganischen Embryonen vor. Unser Protokoll kombiniert die Bildgebung, die Linienführung und die neuroanatomische Verfolgung einzelner Zellen bei der Entwicklung von Embryonen. Durch den Einsatz der Dual-View-Invertitionslinge-Illuminationsmikroskopie (DiSPIM) erreichen wir eine langfristige, vierdimensionale (4D) Bildgebung lebender C . eleganischer Embryonen mit nahezu isotropher räumlicher Auflösung. Nuklei und neuronale Strukturen in den Nematoden Embryonen werden abgebildet und isotropical verschmolzen, um Bilder mit einer Auflösung von ~ 330 nm in allen drei Dimensionen zu erzeugen. Diese minutenlangen hochauflösenden 4D-Datensätze werden dann analysiert, um definitive zelllineare Identitäten mit Genexpression und morphologischer Dynamik auf einzelligen und subzellulären Detailebenen zu korrelieren. Unser Protokoll ist so strukturiert, dass es eine modulare Umsetzung der einzelnen beschriebenen Schritte ermöglicht und Studien zu Embryogenese, Genexpression oder Neuroentwicklung verbessert werden kann.

Wir haben zunächst die Lebensfähigkeit von Embryonen bestätigt, die mit den Parametern des Protokolls für die DiSPIM-Übernahme (Abschnitte 1-6) abgebildet wurden. Zehn Embryonen wurden gleichzeitig bei 20 ° C, einer Volumen-/Embryo/Minute, vom 2-Zellen-Stadium bis zum 2-fachen Stadium (7,5 Stunden, 451 Volumina/Embryo) abgebildet. Um die Zellteilung während der Embryogenese zu überwachen, haben wir die Sorte BV514 verwendet, die allgegenwärtig die mCherry::Histon-Reporter aus dem integrierten Transgenarray-Array ujIs113 24 ausdrückt. Abbildung 6 zeigt eine Zeitachse dieser ersten Hälfte der Embryonalentwicklung für einen der abgebildet Embryonen. Jedes Bild stellt eine Projektion mit einer maximalen Intensität (erzeugt durch die Schritte 7-8) des abgebildeten Embryos dar. Wir fanden heraus, dass die optimierten Protokolle keine nachweisbare Phototoxizität zu den Embryonen veranlassten, wie der Zeitpunkt der Zellteilung (nicht abgebildet), die Zeit des Schlüpfens und das Timing, das mit den Meilensteinen der Entwicklung zusammenhängt, bewertet wurden (Abbildung 6 und Referenzen 1). , 25 , 26).
Wir haben dann das Protokoll angewendet, um die Auswuchsdynamik einzelner Neuronen bei der Entwicklung von Embryonen zu analysieren. Wir haben DCR7692 (olaex4655)abgebildet, Eine transgene Nematode-Strafung, die GFP aus dem Neuroptid-Flp-19-Promoter in einer Untergruppe von nicht identifizierten Zellen (DACR2819, Pflp-19 ( 3.6kb) ausdrückt :: Syn21:CAAX::p 10 3 ' UTR) . Nach den Schritten des hier skizzierten Protokolls stellten wir fest, dass die nicht identifizierten Zellen den motorischen Neuronen RMDDL und RMDDR, der Ausscheidungskanalzelle und zwei Muskelzellen entsprechen (Abbildung7). Wir haben dann die Auswuchsdynamik der RMDDL und RMDDR-Neuronen untersucht und quantifiziert. Wir beobachteten, dass die RMDDL und RMDDR-Neuronen bereits 360 Minuten nach der Befruchtung schräg geformt sind, wobei die längere zelluläre Achse die nachfolgende Achse für Neurit-Auswuchs darstellt (Abbildung 7 und Film S1). Mit dem "einfachen Neurit-Tracing"-Plugin in FIJI und der Anwendung auf 3D-Rekonstruktionen isotropical verschmolzenen Volumina quantifizierten wir dann das stereotype Auswachsen der RMDDL und RMDDR-Neuriten für sechs Embryonen. Wir stellten fest, dass die Outwusting-Dynamik für RMDDL und RMDDR über Embryonen hinweg (hier RMDDs genannt) stereotypisiert wurde. Ab 385-410 Minuten Nachdüngung verlängerten die RMDDs Neuriten 6,0 ± 0,5 μm (Mittelwert ± SEM; n = 12 Neuriten) vor den Zellkörpern (Abbildung7B, C, I). Von 415-445 Minuten Nachdüngung dehnen sich beide Neuriten dorsal in und um den voraussichtlichen Nervenring aus (Sternchen in Abbildung 7D). Im Durchschnitt hat sich jeder RMDD-Neurit um 11,0 ± 0,6 μm verlängert (Mittelwert ± SEM; n = 12 Neuriten) aus dem Zellkörper, bevor er synchron auf sein kontralaterales Pendant an der Spitze des Ringes trifft (Abbildung 7I). Wichtig ist, dass unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass wir in der Lage sind, neuronale Entwicklungsmerkmale für einzelne identifizierbare Zellen anhand unseres integrierten Protokolls zu untersuchen, zu vergleichen und zu quantifizieren (Abbildung 7 und Abbildung 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig1.jpg"> Abbildung 1: DiSPIM-Probenmontage. (A) Zubereitung der Kerkel mit Poly-L-Lysin. Im Einsetzen wurde 10 μL Poly-L Lysin verwendet, um den Keillip für 5 Minuten zu beschichten. Poly-L-Lysin ermöglicht es der Embryonalechale, fest an der Keillinie im Rechteck zu haften. B) Schematic der Stahlbildkammer und der zusammengesetzten Kammer. Im Einsetzen orientieren sich repräsentative Embryonen mit der anterioralen Nachachse senkrecht zur langen Achse am Keillip. (C) Assembled Aspirator-Röhre mit mikrocapillaren Pipette. D) Stahlbildkammer, die im Probenhalter nach den Zielen von diSPIM 40x montiert ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig2.jpg"> Abbildung 2: Langfristige DiSPIM-Bildgebungseinrichtung im Micro-Manager. A) empfohlene DiSPIM-Laserleistungsparameter (rotes Rechteck), die für eine längere Bildgebung bei gleichzeitiger Reduzierung der Phototoxizität optimiert sind (gemessen an einer höheren Schraffurate von C. eleganischen Embryonen). Set 561 nm Laser auf 79 μW (0,25) und 488 nm Laser auf 179 μW (0,5). Beachten Sie, dass die exakte Kalibrierung von Software-Einstellungen auf Laserleistung zwischen den DiSPIM-Installationen variiert. Es wird empfohlen, dass Anwender die Laserleistung messen und kalibrieren, um 79 μW (561 nm) und 179 μW (488 nm) Laserleistung zu erreichen. (B) DiSPIM-Parameter zur Datenspeicherung (grünes Rechteck), Lautstärke-Einstellungen (blaues Quadrat) und Slice-Einstellungen (orange Quadrat). (C) diSPIM-Autofokus-Parameter für die langfristige Abbildung von C. elegans Embryogenese (siehe Schritte 6.1-6.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig3.jpg"> Abbildung 3: Bildvisualisierung und Datenverarbeitung mit CytoSHOW. (A) Raw diSPIM Bilder, die von CytoSHOW geöffnet wurden. CytoSHOW ist in der Lage, Bilder zu öffnen, die von beiden Kamerawegen (SPIM A und B) aufgenommen wurden. Diese Rohbilder werden in mehrdimensionalen Fenstern geöffnet, die diSPIM-Monitorgenannt werden. Im DiSPIM-Monitorwird ein "Bowtie-Muster" erzeugt, um die vorderen, hinteren, dorsalen und ventralen Kanten des Embryos auszuwählen (siehe Schritt 9.1). Bow-tie Selektionen zeigen die Embryonenorientierung für die Dekonvolution und die StarryNite-assistierte Linienverfolgung an. (B) Optimierte Parameter zur Erzeugung von isotropen Bildern. Setzen Sie im Dekonvolved beim Erwerb des Fensters die in Schritten 9.5.1-9.5.8 angegebenen Parameter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig4.jpg"> Bild 4: DiSPIM-Kamerakonfiguration. (A) Foto von DiSPIM-Kamera-Platzierungen und Orientierungen. B) Darstellung von + 90-Grad-Rotationen von SPIM A, um SPIM B-Bilder zu entsprechen. (C) Eingabebumina im Verhältnis zum Orientierungsindex + 1 auf Basis der Kamerakonfiguration unseres DiSPIM (siehe Schritt 9.5.2). Wir drehen SPIM A Bild (s) + 90 Grad um Y-Achse vor der Registrierung, um SPIM B Bilder (s) zu entsprechen. Skalierbalken = 10 μm. Bilder sind repräsentative Einzelansicht, Maximalintensitätsprojektionen und Dekonvolution-Bilder des 1,5-fachen Embryos mit beschrifteten Kernen (561-nm, rot) und Neuronen (488-nm, grün). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig5.jpg"> Abbildung 5: Kuration und Bearbeitung C . Eleganten embryonale Linie in AceTree. (A) Wir verwenden AceTree, um die Abstammungsspuren von StarryNite zu bearbeiten (siehe Referenzen 5,6,8; Manuskripte sind auch in unserem Download-Bundle enthalten). AceTree zeigt C . elegans systematische Namen für jeden Kern (grünes Rechteck) nach Abschluss der Schritte 10.1-10.2 an. Dieses Fenster (A) bietet Informationen (schwarzes Rechteck) über jede Zelle in der Linie Spur (ABa, in blau hervorgehoben), die den Nutzern helfen, die Linienspuren zu verfolgen und zu bearbeiten. Es wird empfohlen, dass Nutzer lineare Zellen und ihre Positionen mit der C. elegans embryonalen Zelllinie, die zuvor von Sulston et al. Dekonalisierte Datenreihen (siehe unten, B) geben den Systemnamen C. elegans in der Suchleiste ein (orangefarbenes Rechteck). (B) Die dekonvertierte Datenreihe des Nutzers öffnet sich auch automatisch nach Abschluss der Schritte 10.1-10.2. Gezeigt wird hier ein isotropical verschmolztes Bild eines Vier-Zellen-Stadionembryos mit in Rot beschrifteten Kernen. Während der Verfolgung eines Kerls sollten die Benutzer die Intensität des Bildes ändern (rotes Quadrat) und mit den Pfeiltasten auf ihrer Tastatur durch die Zeit und z navigieren (time-left/right, z-up/down). (C) 3D-Zeichentrickfilm des Zeitrahmenin (B) mit bestimmten Funktionalitäten (lila Rechteck), die eine drehbare 3D-Visualisierung ermöglicht. Eine Übersicht über AceTree und seine 3D-Funktionalität finden Sieunter Referenzen 5,6,8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig6.jpg"> Abbildung 6: Zeitgemäße Entwicklungsdynamik von C. eleganischem Embryonen auf der DiSPIM. Top-Panel, DiSPIM-Bilder, die die erste Hälfte der Embryonalentwicklung für einen der abgebildeten Embryonen zeigen (Strain BV514 ujIs113 24). Embryonen wurden kontinuierlich abgebildet, jede Minute für 7,5 Stunden (bei 20 ° C). Die ersten beiden Bilder der oberen Tafel repräsentieren 4-und 8-Zellen-Embryonen mit Kernen (rot) und Positionen polarer Körper (dichte rote Kugeln, markiert mit blauen Sternchen). Jedes Bild stellt eine Einbliw-Maximalintensitätsprojektion des abgebildeten Embryos dar. Skalierbalken = 10 μm. Die Zeitachse (horizontaler Balken) stellt eine minder postbefruchtete (m.p.f.) der Entwicklung von C. elegans Embryonen dar. Wir bestätigten, dass die Parameter unseres Protokolls für die DiSPIM-Übernahme keine nachweisbare Phototoxizität zu den abgebildeten Embryonen veranlasst haben, wie sie durch die Lebensfähigkeit, den Zeitpunkt der Zellteilung, den Zeitpunkt des Schraffings und den Zeitpunkt der Entwicklung von Meilensteinen bewertet wurden (siehe Referenzen). 1 , 25 , Wirstellen fest, dass der Zeitpunkt der Meilensteine der Entwicklung über Embryonen hinweg mit unseren Bildungsparametern reproduzierbar war (SEM ± 8,174 Minuten für 6,4 Stunden lange bildgebende Sitzungen; N = 10). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig7_v2.jpg"> Bild 7. Zelluläre Identifikation und Einzelzellcharakterisierung der Neurit-Auswuchdynamik bei der Entwicklung von C. eleganen Embryonen. Duale Farbdarstellung einer Sorte, die durch die Überquerung von BV514 ujIs113 24 (für Lineaging) und DCR7692 (olaex4655), einer transgenen Nematoden-Stamm, die GFP von der Neuroptid-Flp-19-Promoter in einer Untergruppe von nicht identifizierten Zellen ausdrückt. (A-H) Nach den Schritten des hier skizzierten Protokolls stellten wir fest, dass die nicht identifizierten Zellen den motorischen Neuronen RMDDL und RMDDR (gelbe Pfeile), der Ausscheidungskanalzelle (blaue Pfeile) und zwei Muskelzellen (weiße Pfeile) entsprechen. I) Quantifizierung der Auswuchdynamik der RMDDL und RMDDR-Neuronen durch die Verwendung von FIJI-Plugin "einfache Neuritverfolgung" und die Anwendung auf 3D-Rekonstruktionen isotropical verschmolzenen Volumina. Beachten Sie, dass sowohl RMDDL als auch RMDDR eine stereotype Auswuchsdynamik aufweisen, die sich synchron auf eine Gesamtlänge von 11,0 ± 0,6 μm ausdehnt (Mittelwert ± SEM; n = 12 Neuriten) und Treffen an der dorsalen Spitze des Nervenrings (siehe auch Film S1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig8.jpg"> Abbildung 8: Untersuchung von Isotropen DiSPIM-Bildern neuronaler Morphologien in C. eleganischem Embryonen. Isotropische Visualisierung von AVHL und AVHR Neuronen (gelbe Pfeile). Mit Hilfe des DiSPIM lassen sich neuronale Morphologien erfassen, die vierdimensionale (4D) Bilder mit einer isotropen Raumauflösung von etwa 330 nm ergeben. Das diSPIM ermöglicht es dem Benutzer, Bildvolumen mit identischer Auflösung in alle Richtungen virtuell zu drehen. Bilder in A-D sind Projektionen mit maximaler Intensität des gleichen isotropical geschmolzenen DiSPIM-Bildvolumens aus unterschiedlichen Rotationen um die lange Achse des Embryos. Skalierbalken = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig8large.jpg" target="_blank"></a>
Ergänzende Film S1 : C. elegans Embryo entwickelt sich von 280 bis 434 Minuten nach der Befruchtung. Isotropen Film der Sorte DCR7692 (olaex4655), die ujIs113 allgegenwärtig mit DACR2819 spärlich beschrifteten RMDD-Neuriten (Abbildung 7A-D, gelbe Pfeile) ausdrückt. DACR2819 kennzeichnet auch zwei Muskelzellen(Abbildung 7A-D, weiße Pfeile) und Ausscheidungskanalzellen (Abbildung7A-D, blauer Pfeil) während der embryonalen Entwicklung (Abbildung 7A-D). Skalierbalken = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/Movie_S1.mov"></a>

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Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Hier stellen wir einen kombinatorischen Ansatz vor, bei dem hochauflösende Mikroskopie, Rechenwerkzeuge und Einzellen-Beschriftungen in lebenden C. eleganischen Embryonen verwendet werden, um die Einzelzellendynamik während der Neuroentwicklung zu verstehen.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Rückverfolgung von Zelllinien und Identitäten in lebenden Embryonen und analysiert gleichzeitig detaillierte Zellmorphologien wie Axone und Dendriten bei der Entwicklung von C.elegans Neuronen. Im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie bietet die invertierte selektive Hintergrundbeleuchtungsmikroskopie oder DiSPIM mit doppelter Ansicht ein höheres Rauschensignal, eine isotropere räumliche Auflösung und eignet sich besser für die langzeitige In-vivo-Bildgebung. Beginnen Sie mit 500 Mikrolitern 1%Methylcelluloselösung in die Vertiefung eines konkaven Mikroskopschlittens.Mit einem Platindrahtpicker werden Erwachsene von einer nematoden Wachstumsmediumplatte in die M9-Methylcelluloselösung übertragen. Verwenden Sie die geschärften Spitzen von 18 Gauge hypodermischen Nadeln, um jedes Tier quer am mittleren Körper auf mindestens ein bis vier Zellembryonen zu schneiden. Mit einem Sauger Mundstück sanft zwischen den Zähnen gehalten, prefill eine Mikrokapillarpipette mit 10 bis 15 Mikroliter M9 Puffer und sanft aspirieren mehrere Embryonen aus dem Rutsch in die Kapillare.Geben Sie die Embryonen in das zentrale Rechteck des Deckels einer Stahlbildkammer, die mit frischem M9-Puffer gefüllt ist. Richten Sie die Embryonen vorsichtig vertikal aus, so dass die lange Achse jedes Embryos senkrecht zur langen Achse des Deckels verläuft. Legen Sie dann die Stahlbildkammer in den Probenhalter auf der Bühne eines diSPIM.Um die Embryonen für die Bildgebung vorzubereiten, öffnen Sie Mikromanager und stellen Sie die Laserintensitäten auf 179 Mikrowatt 0,5%Äquivalenz für 488 Nanometer und 79 Mikrowatt 0,25% Äquivalenz für 561 Nanometer. Die Kalibrierung zwischen Softwareeinstellung und echter Laserleistung muss im Voraus erfolgen, um den Spielraum für bestimmte Mikrowatt festzulegen. Wählen Sie im Plugin-Menü die Gerätesteuerung und die angewandte wissenschaftliche Bildgebung diSPIM aus, um das angewandte wissenschaftliche Bildgebungsfenster für die invertierte selektive Ebenezulage zu öffnen.Bestätigen Sie auf der Registerkarte "Erfassung", dass die Parameter wie angegeben festgelegt sind. Legen Sie unter der Registerkarte Autofokus die angegebenen Parameter fest. Beachten Sie, dass der Autofokuskanal den Kernfluoreszenzkanal für die geplanten Lineaging-Experimente angeben sollte.Aktivieren Sie die Balken- und Blattfelder für Pfad A oder B, und klicken Sie auf live, um mit der Bildaufnahme zu beginnen. Ein Live-Ansichtsfenster wird geöffnet. Zeichnen Sie dann ein Kästchen um den von Interesse interessierten Embryo, um den Autofokus-Analysebereich des Embryos auszuwählen, und klicken Sie auf Starterfassung, um die langfristige multidimensionale Bildaufnahme zu initiieren.Für die Bildanzeige, Verarbeitung und Zelllinienanalyse, nach dem Herunterladen und Extrahieren des Software-Bundles, doppelklicken Sie auf die CytoSHOW_app. jnlp-Datei, um mit der Ausführung von CytoSHOW zu beginnen. Wählen Sie im Dateimenü den neuen und diSPIM-Monitor-Mikromanager aus, um den Stammdatensatzordner zu finden, in dem die unformatierten Mikromanager-Images gespeichert wurden.Wählen Sie einen beliebigen Zeitpunktordner aus, und klicken Sie auf Öffnen. Multidimensionale Navigationsfenster werden automatisch für SPIM A und SPIM B geöffnet. Mit dem Polygonauswahlwerkzeug klicken Sie direkt außerhalb der vorderen, hinteren, dorsalen und ventralen Kanten des von Interesse sind, um ein Bogenbindenmuster über dem Embryo in den SPIM A- und SPIM B-Ansichten zu erzeugen, und klicken Sie auf diSPIM. Richten Sie die grünen und roten Kanäle für jeden SPIM-Arm aus, und klicken Sie erneut auf diSPIM.Die Verschiebungen werden in allen anderen Positionsfenstern ausgelöst. Klicken Sie als Nächstes auf diSPIM und sichern Sie die Sicherung, um das Dialogfeld für die Entsicherungs-DiSPIM-Rohdatenvolumen zu öffnen, und legen Sie die angegebenen Parameter fest. Wenn alle Parameter festgelegt wurden, klicken Sie auf ja, und geben Sie das Ausgabeverzeichnis an, in dem die verarbeiteten Dateien gespeichert werden sollen, bevor Sie auf OK klicken. Verschieben Sie im Vorschaufenster die t-Scroll-Leiste auf den Zeitpunkt zwei des Fensters, und verschieben Sie den Z-Schieberegler, bis die Ansicht direkt entlang der langen Achse des Embryos angezeigt wird.Verschieben Sie die t-Scroll-Leiste zurück zum Zeitpunkt 1 im Vorschaufenster, und verwenden Sie das Linienauswahlwerkzeug, um eine Linie aus dem ventralen, rundsten Kern durch die Ebene der AB-Zellmetaphasenplatten zu zeichnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche diSPIM-Vorschau, um die Feineinstellungen an der Ausrichtung des in der Vorschau angezeigten Bildvolumens zu speichern. Legen Sie die t-scroll-Balken der diSPIM-Monitorfenster auf die Start- und Endzeitpunkte der gesamten zu verarbeitenden Bildspanne fest.Klicken Sie dann auf OK. Für eine effiziente und genaue Zelllinienanalyse ist es wichtig, eine präzise ADL-Ausrichtung der Datenmengen vor der Verarbeitung von Starry Night zu erreichen. Um die Starry Night-Abstammungsverfolgungsserie in AceTree zu öffnen, öffnen Sie die bereitgestellte angepasste AceTree-Datei, und wählen Sie die Datei "Konfigurieren" auswählen, um das zuvor angegebene Ausgabeverzeichnis zu finden. Öffnen Sie den Sicherungsunterordner für den von Interesse interessierten Embryo, und wählen Sie die bearbeitete Datei aus.Klicken Sie dann auf Öffnen, und fahren Sie mit der Linienvisualisierung und -bearbeitung fort, wie zuvor beschrieben. Optimierte Protokolle führen zu keiner nachweisbaren Phototoxizität für die Embryonen, wie sie zum Zeitpunkt des Schlüpfens und dem Zeitlichen im Zusammenhang mit Entwicklungsmeilensteinen beurteilt werden. Mit diesem Protokoll, wie gezeigt, wurden die nicht identifizierten Zellen in diesem transgenen grünen fluoreszierenden Protein, das Nematodenstamm exzessient, bestimmt, um motorischen Neuronen, der Ausscheidungskanalzelle und zwei Muskelzellen zu entsprechen.Die identifizierten Neuronen wurden bereits nach 360 Minuten nach der Befruchtung schräg geformt, wobei die längere Zellachse die nachfolgende Achse für das Neuritenwachstum darstellte. Von 385 bis 410 Minuten nach der Befruchtung verlängerten die RMDD-Neuriten etwa sechs Mikrometer vor der Zellkörper. Von 415 bis 445 Minuten nach der Befruchtung verlängerten sich beide Neuriten dorsal in und um den mutmaßlichen Nervenring.Im Durchschnitt verlängerte jedes RMDD-Neurit etwa 11 Mikrometer aus dem Zellkörper, bevor es synchron sein kontralaterales Gegenstück an der Spitze des Rings traf. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass neuronale Entwicklungsmerkmale für einzelne identifizierbare Zellen mit diesem integrierten Protokoll untersucht, verglichen und quantifiziert werden können. Es ist wichtig, daran zu denken, die Embryonen vertikal zu orientieren, so dass die lange Achse jedes Embryos senkrecht zur langen Achse des Deckels ist.Mit diesem Protokoll haben wir begonnen, das entstehende embryonale Nervensystem aus allen Blickwinkeln zu erforschen. Zum Beispiel während der Zellgeburt, Migration und Differenzierung, Neuritenbildung, Wachstum und Faszikulation.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Co-Lokalisierung von Zell Lineage Marker und die Tomate Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

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Hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) - Einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung und Visualisierung von organischen Materialien

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

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Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...