Name: isotropic light-sheet microscopy and automated cell lineage analyses to catalogue caenorhabditis elegans embryogenesis with subcellular resolution
Uploaded: 2019-06-06T14:00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution at JoVE.com

אנו מודים לג מאריי על זן משולב, ujIs113, כדי לייצר זן הזדקנות BV514; ברנדון הארווי (NIBIB) לקבלת עזרה בבדיקת הפרוטוקול; ג'ון דניאלס וגרי רונדו (מיכשור מדעי יישומי) לסיוע בכלי מיקרו-מנהל ומכשיר diSPIM; ואנדרו יורק והאנק עדן על המשוב הקריטי שלהם על מערכת ה-diSPIM. כמו כן, אנו מודים למרכז המחקר לתכנית מוסדות המיעוט ולמכון לנוירוביולוגים חוסה דל קסטיליו (אוניברסינדה דה פוארטו ריקו) למתן מפגש ומערכת סיעור מוחות. הרבה מהעבודה הזאת נערכה במעבדה הביולוגית הימית ביער הול באמצעות תוכנית ויטמן. עבודה זו נתמכת על ידי תוכניות מחקר הפנים של המכון הלאומי NIH של הדמיה ביו-רפואית וביוהנדסה ועל ידי NIH מענק לא. U01-HD075602 ו-No. R24-OD016474. מארק W. Moyle נתמך על ידי F32-NS098616 ו לייטון ה. דאנקן נתמך על ידי תוספת גיוון ל R24-OD016474.

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Bao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cell+lineage+tracing+in+Caenorhabditis+elegans.">Automated cell lineage tracing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (8), 2707-2712 (2006).</li><li>Santella, A., Du, Z., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-local+neighborhood-based+framework+for+probabilistic+cell+lineage+tracing.">A semi-local neighborhood-based framework for probabilistic cell lineage tracing.</a> BMC Bioinformatics. 15, 217 (2014).</li><li>Santella, A., Du, Z., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+blob-slice+model+for+accurate+and+efficient+detection+of+fluorescence+labeled+nuclei+in+3D.">A hybrid blob-slice model for accurate and efficient detection of fluorescence labeled nuclei in 3D.</a> BMC Bioinformatics. 11, 580 (2010).</li><li>Boyle, T. J., Bao, Z., Murray, J. I., Araya, C. L., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AceTree:+a+tool+for+visual+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis.">AceTree: a tool for visual analysis of Caenorhabditis elegans embryogenesis.</a> BMC Bioinformatics. 7, 275 (2006).</li><li>Katzman, B., Tang, D., Santella, A., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AceTree:+a+major+update+and+case+study+in+the+long+term+maintenance+of+open-source+scientific+software.">AceTree: a major update and case study in the long term maintenance of open-source scientific software.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 121 (2018).</li><li>Murray, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+embryonic+gene+expression+with+cellular+resolution+in+C.+elegans.">Automated analysis of embryonic gene expression with cellular resolution in C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (8), 703-709 (2008).</li><li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree.">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy.">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nature Biotechnology. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Stage-+and+Slit-Scanning+to+Improve+Contrast+and+Optical+Sectioning+in+Dual-View+Inverted+Light+Sheet+Microscopy+(diSPIM).">Using Stage- and Slit-Scanning to Improve Contrast and Optical Sectioning in Dual-View Inverted Light Sheet Microscopy (diSPIM).</a> The Biological Bulletin. 231 (1), 26-39 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li><li>Wu, Y., Christensen, R., Colon-Ramos, D., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+optical+imaging+techniques+for+neurodevelopment.">Advanced optical imaging techniques for neurodevelopment.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1090-1097 (2013).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology.">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nature Methods. 12 (1), 23-26 (2015).</li><li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+fluorescence+microscopy:+advances+in+high+speed+biological+imaging.">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 46-53 (2014).</li><li>Lucy, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+technique+for+the+rectification+of+observed+distributions.">An iterative technique for the rectification of observed distributions.</a> Astronomical Journal. 76 (6), 745-754 (1974).</li><li>Richardson, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian-Based+Iterative+Method+of+Image+Restoration.">Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration.</a> JOSA. 62 (1), 55-59 (1972).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+microManager.">Computer control of microscopes using microManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 14, (2010).</li><li>Gualda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIM-fluid:+open+source+light-sheet+based+platform+for+high-throughput+imaging.">SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging.</a> Biomedical Optics Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).</li><li>Ardiel, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Calcium+Flux+in+Freely+Moving+Nematode+Embryos.">Visualizing Calcium Flux in Freely Moving Nematode Embryos.</a> Biophysical Journal. 112 (9), 1975-1983 (2017).</li><li>Walton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicoid+class+homeodomain+factors+ceh-36/OTX+and+unc-30/PITX+cooperate+in+C.+elegans+embryonic+progenitor+cells+to+regulate+robust+development.">The Bicoid class homeodomain factors ceh-36/OTX and unc-30/PITX cooperate in C. elegans embryonic progenitor cells to regulate robust development.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005003 (2015).</li><li>Altun, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormAtlas. , (2002).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology:+In+the+nematode+C.+elegans.">Embryology: In the nematode C. elegans.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. Chapter 8, 215-241 (1988).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314 (1165), (1986).</li><li>Bao, Z., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+Caenorhabditis+elegans+embryos+for+live+imaging+of+embryogenesis.">Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis.</a> Cold Spring Harb Protoc. (9), (2011).</li><li>Christensen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untwisting+the+Caenorhabditis+elegans+embryo.">Untwisting the Caenorhabditis elegans embryo.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Santella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormGUIDES:+an+interactive+single+cell+developmental+atlas+and+tool+for+collaborative+multidimensional+data+exploration.">WormGUIDES: an interactive single cell developmental atlas and tool for collaborative multidimensional data exploration.</a> BMC Bioinformatics. 16, 189 (2015).</li><li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first+version+of+the+Caenorhabditis+elegans+Promoterome.">A first version of the Caenorhabditis elegans Promoterome.</a> Genome Research. 14 (10B), 2169-2175 (2004).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+transcription+factor+gene+duplication+from+Caenorhabditis+elegans+Promoterome-driven+expression+patterns.">Insight into transcription factor gene duplication from Caenorhabditis elegans Promoterome-driven expression patterns.</a> BMC Genomics. 8 (27), (2007).</li><li>. WormBase Available from: <a target="_blank" href="https://www.wormbase.org">https://www.wormbase.org</a> (2019)</li><li>Lee, R. Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormBase+2017:+molting+into+a+new+stage.">WormBase 2017: molting into a new stage.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), D869-D874 (2018).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

ג. אלגיה בולטת כאורגניזם היחיד עם התפקידים הסופיים והקישוריות של כל תא מבוגר הידוע27. עם זאת, הדינמיקה ההתפתחותית המובילה לארגון מעגלי העבודה והרשתות היוצרת את המערכת מאפשרת להישאר בלתי ידוע. מבוסס על הזדמנויות המתעוררים מתוך התקדמות במיקרוסקופ אור, אנחנו יכולים כעת ללכוד ולנתח את עמדות התא, מורפוגנזה, ו נוירוגנזה ברחבי C. אלגיה התפתחות עובריים.
הנוהל שתיארנו ושאנו שימוש באופן שגרתי במעבדה התשואות 4D-isotropic תמונות של נוירונים וגרעינים שכותרתו עבור הזדקנות התא ב- C. אלגיה עוברים. חשוב מכך, יש לנו אופטימיזציה לטווח ארוך הדמיה התנאים עם diSPIM ומצמידים למחצה אוטומטי יכולות לינארי עם תמונות ברזולוציה גבוהה כדי לשפר את המהירות והדיוק של ניתוח C. אלגיה embryogenesis. פרוטוקול משולב זה יאפשר למשתמשים להמחיש ולזהות תאים ולכמת תכונות תלת ממדיות כגון הגירה neurite ו-אקסון באמצעות תחילתה של העווית המוקדמת. הליך זה יכול להיות מותאם בקלות לתוך כל מתקן עם מערכת הספק אסי diSPIM, ואנו ממליצים על מערכת זו במיוחד עבור פרוטוקול זה. ניסוחים SPIM אחרים המוצעים באופן מסחרי עשויים להיות שונים מתצורת ASI בתכונות החדר והאופטי לדוגמה. עם זאת, נתונים המיוצאים מפלטפורמות אחרות ניתן גם לשים דרך צינור הנתונים שלנו. לכן, הערכת הערך שלהם בהזדקנות, מבחן תובעני של איכות התמונה ויציבות הכלי, הוא אפשרי. למרות שאנו משתמשים באופן פעיל ב-dispim כדי לדמות בקביעות דגימות אחרות (כגון דרוזופילה ועוברי דגים), ניתוח העוברים לפני הזמן המתואר והמקיף של העוברי עדיין מוגבל למינים מסוג נמטודות. לדגימות גדולות או עבות, אנו בוחרים להשתמש בגישות לסריקת במה, הסורקים את הדגימות דרך גיליון אור נייח. קומאר ואח ' הפגינו בעבר את הפרטים המשופרים הללו כדי להניב תמונות באיכות גבוהה מדגימות עבות ללא שינויים נוספים ב-diSPIM10.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים את העוברים הבאים של C. אלגיה באמצעות שמיכות הציפוי פולי ליזין, רכישת נתונים ועיבוד נתונים. קציר והרכבה C. אלגיה עוברים על שמיכות זכוכית יכול להיות מאתגר למשתמשים לא מנוסים, אבל כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט של שלבי מפתח כדי להקל על הלמידה. אם הדמיה ארוכת טווח רצוי, אנו משיגים תוצאות הטוב ביותר קצירת ארבעה תאים או עוברים מוקדם מ 8-10 צעירים מבוגרים28. שימו לב כי המבוגרים הוותיקים פחות רצוי לקצור עוברי הבמה המוקדמים, משום שהם נוטים להכיל עוברים ישנים יותר ברחם ובביצים לא מופרות. לגבי העוברים, בעיות כגון סתימה בתוך מייבש הבית (פיפטה הפה) או גדול מדי של פתיחה בתוך הפיפטה מיקרוקפילר עשוי למנוע הרכבה נכונה וכיוון העוברים. כדי להתכונן לדימות אופטימלי, אנו מבצעים טרום רכישה בדיקות על עוברים מוקדם ומאוחר מתעוות לבדוק את הביצועים של יריעות אור, מצלמות, מטרות, פוקוס אוטומטי. אנו משיגים את התוצאות הטובות ביותר כאשר כל הפעולות הללו נבדקות ומפיקות תמונות באיכות גבוהה במהלך בדיקות טרום הרכישה שלנו. דבר זה רלוונטי במיוחד ליצירת תמונות עם פתרון מרחבי איזוטרופי, שעבורם תמונות raw שנרכשו משתי התצוגות (מטרות) חייבות להיות באיכות גבוהה. לאחר הרכישה, אמצעי האחסון שנרכשו עבור כל תצוגה מעובדים כדי להניב תמונות איזוטרופיות. חשוב להשתמש בכרטיס של יחידת עיבוד גרפית (GPU) מתאימה כמתואר בפרוטוקול זה (ראה להלן). פעולה זו משפרת את מהירות העיבוד שבה נוצרות התמונות האיזוטרומיות, קיצור הזמן לניתוחי נתונים. זה גם הכרחי כי משתמשים מריצים את הגירסה העדכנית ביותר של ציטוהצג והם משתמשים בפרמטרים שסופקו עם צרור ההורדה שלנו עבור הזדקנות אוטומטית StarryNite. אם משתמשים מעוניינים להשתמש באופן אוטומטי לבחירה עבור דגימות אחרות (למשל, zebrafish, דרוזופילה ילה וכו ') אז אופטימיזציה נוספת לפרמטרים המשמשים starrynite יידרש (ראה הפניות3,4).
למרות שהפרוטוקול המשולב שלנו מספק תמונות ותוצאות הזדקנות בעובר מראש, משתמשים צריכים להיות מודעים לכך ששינוי אוטומטי בעובר לאחר העווית אינו אפשרי כרגע: שינויים בתנוחות גרעיניות בסדר השניות ב עובר לאחר העווית, מהר מדי. כדי לאפשר מעקב אחר השושלת עם זאת, הדגים אכן הפגינו יכולת מבטיחה ללכוד אירועים נוירוהתפתחותיים ולעקוב אחר מיקומי תאים בשלבים שלאחר העווית של embryogenesis23,29. אם משתמשים מעוניינים לבחון את העובר לאחר העווית, הפונקציה מספקת את המהירות להשגת תמונות נפחי ולעקוב אחר אירועים נוירוטיביים משובחים, כגון neurite outgrowth, בעוברים במהירות.
פרוטוקול זה יהיה היסוד עבור השלמת תא אחר התא של המדריך לתולעים האטלס30, כפי שהוא יספק גישה משולבת עם ברזולוציה גבוהה איזוטרופי תמונות לזהות וללכוד 3d מורפולוגיות של נוירונים התווית במהלך את 430 הדקות הראשונות של הembryogenesis. כפי שהוא עומד, אב טיפוס האטלס מדריכים מספק עמדות גרעיניות של תאים בעובר המתפתח ומטרתו ללכוד את הדינמיקה ההתפתחותית של תת-ערכה של נוירונים עובריים. פרוטוקול זה יהיה מפתח עבור שילוב של הנוירונים המפתחים נוספים לתוך מדריכי התולעת אטלס30.
הפרוטוקול המשולב שלנו גם יפשט את הביקור בפרופילים חדשים של ביטוי גנים בעובר הג. באופן טרנסגניים, הרבה מיזמים ספציפיים לתאים ולשלוט באופן זמני בביטוי הטרנסגנטי. בעוד דפוסי הביטוי של רוב הגנים התאפיין בהרחבה בחיה למבוגרים31,32,33,34, כמעט כולם עדיין להיות מאופיין בפיתוח (במיוחד העובר בשלב מאוחר). מקדם ה -C. אלגיה מהווה משאב שימושי לקהילת התולעים כדי לכונן ביטוי העברה ספציפי לתאים, כמו גם לקבוע אם פונקציית גן היא אוטונומית או לא אוטונומית. לכידת איזוטרופי דפוסי ביטויים דינמיים ודינאמיים של גנים, ומזהה בדיוק לבטא תאים באמצעות הזדקנות יהיה ערך לרבים בקהילה המדעית.
Embryogenesis כולל שני תהליכים עיקריים שזורים, בידול סלולרי רקמה מורפוגנזה. הרבה ידוע על המנגנונים והמולקולות המגדירים סוגי תאים ברורים במהלך התפתחות הג. עם זאת, מעט ידוע על המנגנונים החשובים להעברת תאים, הדבקה בתאים וצורת תא בעובר C. אלגיה . עם כללי השושלת של ה- C. אלגיה הידועה, הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו להבחין בקלות את 3d-מיקרואנטומיה מקוטלגים של העובר במהלך מורפולגנזה ברמות חדשות של פירוט: למשל, האקסון, synaptogenesis, ופעילות עצבית. ארדיאל ואח ' הפגינו בעבר את הכוח של ה-diSPIM ללכוד מעבר סידן ברמה של נוירונים בודדים ב -C. אלגיה עוברים23. היבטים רבים אחרים של הפיזיולוגיה ההתפתחותיים בשלים לחקירה על ידי שיטות אלה.
לבסוף, פרוטוקול זה הוא אוטומטי ברובו באופן שיטתי מפחית את הזמן שלוקח כדי ליצור תמונות לפירוק ולבצע הזדקנות תא באמצעות StarryNite ו מרחרי. את אסטרטגיות התוכנה המשמשות בפרוטוקול זה ניתן להחיל על שאלות רבות של ביולוגיה הרחק מתוך השדות הספציפיים מאוד שבו הדגמנו אותם כאן.
פרטים על תאימות תוכנה וגישת הורדה
מידע על מיקרו-מנהל ותוספים עבור הדמיה של diSPIM זמינים ב http://dispim.org/software/micro-manager ו-https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
צינור עיבוד הנתונים מחייב כעת מערכת הפעלה של Windows. יש לנו ארוזות קובץ ארכיון יחיד כדי לפשט את ההתקנה של כל הדרושים עיבוד נתונים תוכניות ותמיכה קבצים. הוא זמין להורדה ב http://dispimlineage.wormguides.org.
ציטוהצג (http://run.cytoshow.org/) מבוסס על פלטפורמת ניתוח תמונת קוד פתוחה בשימוש נרחב, ImageJ (v1). על java להיות מותקן ומעודכן במחשב לשימוש ב-ציטוהצג, ועדכונים ל-ציטוהצג נפרסים באופן אוטומטי באמצעות הפעלת אתר Java. פונקציות מבוססות ImageJ רבות של ציטוהצג הן כמתואר ומומחשות ב-https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. ציטוהצג הותאם אישית כדי להציג נתונים גולמיים רב ממדיים מ-ASI diSPIM, כמו גם תוכנות דימות אחרות היוצרות פלט TIFF. בעיקרון, מערכות מרובות תצוגה SPIM הדמיה יכול להיות נתמך על ידי שינויים משניים של ציטוהצג כדי לאפשר פרוטוקול זה להתבצע על מערכות מיקרוסקופ שונים.

SpimFusion נכתב ב CUDA/C++ באמצעות Visual Studio 2013 עם ערכת הכלים של CUDA v 7.5. הפעלת SpimFusion דורש חומרה מחשב ספציפי: יחידת עיבוד גרפיקה של NVIDIA (GPU) כרטיס עם היכולת לחישוב CUDA 1.0 או יותר ומינימום של זיכרון כרטיס גרפי 2 GB. בזמן הפרסום של הפרוטוקול שלנו, SpimFusion הוא לא פורסם (מין גואו ו הארי Shroff) אבל זמין בארכיון צרור התוכנה שהוזכרו לעיל.

גירסה מונחית של שורת פקודה מוכללת של StarryNite מחייבת שהתקנת MATLAB קומפיילר זמן הפנוי הזמינה באופן חופשי, אך אינה דורשת רשיון עבור תוכנת MATLAB מסחרית. זמן הריצה של קומפיילר MATLAB נכלל בארכיון חבילת התוכנה שהוזכר לעיל. הקוד עבור סטארריניט כפי שנעשה בשימוש בפרוטוקול זה הוא ביסודו של דבר ללא שינוי ששימש עבור תמונות מיקוד6. עם זאת, כמה עניינים מבצעיים ביצירת תמונות קלט עבור העיבוד StarryNite והטיפול של התוצאות StarryNite טופלו כאן על ידי שיטות ב ציטוהצג המאפשרים צינור עיבוד נתונים רציפה עבור מחובר איזוטרופי diSPIM אמצעי אחסון. שינויים אלה אוטומטיים באמצעות קוד ציטוהצג המטפל בצעדים אלה לפני ולאחר עיבוד. בנוסף, ציטוהצג עורך את הפרמטר המותאם לפני הגדרת מיטוב של תבנית מותאמת להגדרה באופן אוטומטי כדי לכוונן את האלגוריתם של הפילוח לעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בנתוני התמונה. הפרמטרים הייחודיים המשמשים את סטארריניט בכל ערכת נתונים של diSPIM נשמרים לאחר מכן בקובץ יחד עם תמונת הפלט ונתוני השידור.
גירסה מותאמת אישית של מרחרי הפועלת עם תמונות של 16 סיביות ושומרת על תאימות עם Java3D רינדור מתאימה ביותר לפרוטוקול זה. הוא נכלל גם בארכיון צרור התוכנה שהוזכר לעיל.

ג. אלגיה בולטת כאורגניזם היחיד שבו כל תא בעובר ניתן לצפות במהלך התפתחות עצבית. עם כל התא-שושלת היוחסין ידוע וקבוע1, עם פיתוח של כלים חדשים המאפשרים תיוג והדמיה רציפה של תאים בודדים בעוברים, ביולוגים יכולים כעת להתחיל בחינת צעדים שונים בפיתוח של העצבים נמטודות מערכת מכל הזוויות-לידה תאים; הגירה ובידול; היווצרות neurite, ממוקד הצמיחה והפסטולציות; היווצרות סינפסה; וכוונון של מעגלים פונקציונליים. לכידת הדינמיקה העצבית במהלך העובר C. אלגיה , על ידי שילוב של כתבים מבוטא באופן בלתי נשכח ומיקרוסקופ קרינה, הוא בעל ערך לקהילה המדעית.
מחקרים התפתחותיים ב- C. אלגיה ממנף לעתים קרובות את השושלת הקבועה ומפות התאים של המין הזה כדי להגדיל את ההבנה ההקשרית ברמת התא הבודד בתוך האורגניזם השלם1. ניתוח הזדקנות אוטומטי-שימוש ב-starrynite2,3,4 ו-5,6,7,8 תוכנות-יתרונות מניגודיות גבוהה, רזולוציה גבוהה תמונות של גרעיני פלורסנט. כדי לעבוד בצורה אופטימלית, הסטרינייט/מרחרי תלוי גם בכיוון מוגבל צפוי של עוברי התמונה במהלך הפיתוח. מיקרוסקופיה קונפוקלית, מתבצעת ב -C. אלגיה עוברים שנדחסו בין שני שמיכות, היתה שיטת מיקרוסקופ אוטומטי סטנדרטי לינארי במשך יותר מעשור, כי הוא מספק הן חדות גבוהה/רזולוציה גבוהה ומוגבל צפוי התמצאות של העובר7,8. בעבר תיארנו את הבנייה והשימוש של הרומן המבוסס על גיליון האור מבוסס-תצוגה כפולה הפוכה מיקרוסקופ תאורה סלקטיבי (dispim) עבור הדמיה לדוגמה חיה כגון C. אלגיה embryogenesis9,10 , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , 13. מיקרוסקופ האור, באופן כללי, מספק פוטורעילות נמוכה, מהירות גבוהה והדמיה ארוכת טווח של יצורים חיים תלת-ממדיים14,15. השיטה diSPIM, במיוחד, מייצרת 4-מימדי (4D) תמונות עם רזולוציה כמעט איזוטרופי מרחבית של כ 330 ננומטר9.
בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, diSPIM מציעה אות לרעש גבוה יותר ומהירות, יותר רזולוציה איזוטרופית מרחבית, והוא מתאים יותר לטווח ארוך vivo הדמיה 16. לפיכך, עבדנו כדי להתאים את נתוני diSPIM עבור קלט לתוך StarryNite/מרחרי וחקרו אם זה ישפר את ניתוחי הששון. משוכה גדולה היא כי לא ניתן להיות מוגבל בקלות של דגימות של diSPIM על ידי דחיסת קליפת ביצה כדי לאמץ את הכיוונים הצפויים עבור StarryNite/מרחרי. כיוון אקראי של תנוחות תאים באמצעי האחסון המנותח מבזה את הדיוק של ניתוח לינשון אוטומטי.
לפיכך, העסקנו ציטוהצג, ממשק משתמש מונחה מציג המאפשר למשתמשים לבחור כיוון תלת-ממד מדויק של העוברים במהלך עיבוד טרום של תמונות diSPIM, מניב נתונים תמונה כי הוא גם איכות אופטימיזציה ההקשר מודע הקשר לקלט לתוך StarryNite . אני מבין על-ידי בחירת המשתמש של עוברי התמונות, בתזמולן מופיעים צינורות לעיבוד נתונים אוטומטיים. תמונות העובר שנחתכו ומופחתים על רקע נשמרות בתוך קבצי מחסנית TIFF עבור כל מיקום, נקודת זמן ותצוגה. ציטוהצג לאחר מכן שיחות לאחר מכן התוכנית spimfusion כדי שיתוף לרשום ובמשותף לפרק את שתי התצוגות טרום מעובד, באמצעות ריצ'רדסון-לוסי17,18 אלגוריתם לתשואה איזוטרופי ברזולוציה גבוהה נפח תמונות. ערכת פרמטרים ספציפית ל-diSPIM ממוטבת עבור StarryNite כדי למשול בהתנהגותו במהלך פילוח תמונה ומעקב אחר הגרעין בתמונות התמזגו באופן איזוטרואלי. תמונות התמזגו ותוצאות הזדקנות מתקבלות לאחר מכן באמצעות מרחרי, מה שמאפשר למשתמשים לזהות ולתקן שגיאות בעקבות השושלת האוטומטית שנוצרה על ידי StarryNite. מרחרי יכול גם להציג עץ השושלת ואת 3D עיבודים המודל של גרעינים מסומנים העובר. אנו מוצאים כי באופן אוטומטי מהירות ודיוק משופרת במידה ניכרת באמצעות תמונות התמזגו איזוטרובאלי, כאשר לעומת תמונות raw ממצלמת SPIM. הפרוטוקול שלנו, בעוד אופטימיזציה ליישום C. אלגיה המתואר כאן, יכול להיות מותאם בדרך כלל עבור הזדקנות אוטומטית של נתוני dispim המיוצרים עבור מינים אחרים או דגימות. אם זהו השימוש המיועד בפרוטוקול, הינכם מתבקשים לשים לב כי כוונון נוסף של פרמטרי הסטארריניט יהיה נדרש עבור דגימות חדשות, כמתואר3,4.
יישום מוצלח של פרוטוקול זה מביא תמונות עם רזולוציה 4D-isotropic ומאפשר לביולוגים לעקוב אחר שאריות התא, ובמקביל לזהות ולנתח נוירונים בהתפתחות העובר C. אלגיה . יתר על כן, על ידי מיזוג מספר אלגוריתמים לאחר עיבוד-עם האצת חומרה להיות הזמן הארוך ביותר של אלה-אנחנו יכולים עכשיו לנתח הן הפרטים הקטנים בסדר הסלולר ואת התאים לפני הצינוק ואת הגורלות התאים של עוברים חיים בזמן אמת למעשה. פרוטוקול חדש זה מאפשר מניפולציה מדויקת, מושכלת והתבוננות של התנהגות התא במהלך מחקרים המוקד של בידול ומורפולגנזה ב vivo. בכתב יד זה, אנו מציגים הסבר מפורט על הפרוטוקולים המשופרים שפיתחנו לאיתור הזדקנות ומעקב תאים בפיתוח העוברים של C. אלגיה , כדי לשפר את המחקרים של embryogenesis, ביטוי גנטי או התפתחות עצבית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steps 1-4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concavity slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1519006</td>
			<td>5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with 10&#215;&#8211;50&#215; zoom range</td>
			<td>Motic</td>
			<td>SMZ-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, no. 1.5, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose &#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7509-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary pipette aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, no. 18G x 1 &#189; (1.2mm x 40mm)</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared as described by Brenner (1974)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring for imaging chamber</td>
			<td>O-Rings West</td>
			<td>M1.5X40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Corning/Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095D5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.5-mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>267201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm)</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td>I2450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Eyelash Pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hart, A. C. Behavior. WormBook.&#160; (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steps 5-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm long-pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-488 RU-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561-nm notch filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-561E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLP02-561R-25, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software for bottom camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td></td>
			<td>ProgRes CapturePro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSIPM assembly video</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSPIM alignment video</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>https://youtu.be/qnOrg30NNuE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSPIM imaging PC</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total,&#160;64&#160;GB memory, Windows 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF01-525/45-25, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF555-DI03-25X36, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging PC Graphics Card</td>
			<td>NVIDIDA</td>
			<td></td>
			<td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kumar et al diSPIM Setup</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 &#160;diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manager</td>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table with isolators, 4 feet &#215; 6 feet &#215; 12 inches</td>
			<td>TMC</td>
			<td>784-651-02DR and 14-416-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steps 7-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis PC</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis PC Graphics Card</td>
			<td>NVIDIDA</td>
			<td></td>
			<td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation instructions</td>
			<td>Software bundle</td>
			<td></td>
			<td>http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software bundle</td>
			<td>Software bundle</td>
			<td></td>
			<td>http://dispimlineage.wormguides.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isotropic light-sheet microscopy and automated cell lineage analyses to catalogue caenorhabditis elegans embryogenesis with subcellular resolution

אלנבאבדיוטיס (ג. אלגיה) בולטת כאורגניזם היחיד שבו האתגר של הבנת המקורות הסלולריים של מערכת העצבים כולה ניתן לצפות, עם רזולוציית תא בודדת, בvivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול משולב לבדיקת ההתפתחות העצבית בעוברי המשך. הפרוטוקול שלנו משלב דימות, לשון ומעקב נוירואנטומי של תאים בודדים בפיתוח עוברים. אנו משיגים הדמיה לטווח ארוך, 4-מימדי (4D ) של החיים העוברים עם הרזולוציה המרחבית הכמעט איזוטרופית באמצעות שימוש באמצעות תצוגה כפולה הפוך מיקרוסקופית תאורה סלקטיבית (dispim). גרעינים ומבנים עצביים בעוברי נמטודות הם התמונה התמזגו איזוטרובאלי כדי להניב תמונות עם רזולוציה של ~ 330 ננומטר בכל שלושת הממדים. אלה של דקה אחר דקה ברזולוציה גבוהה 4D הנתונים מנותח לאחר מכן לתיאום זהויות מוחלטות היוחסין של התא עם ביטוי גנים ודינמיקה מורפולוגית בתוך תא יחיד ורמות subcellular של פירוט. הפרוטוקול שלנו מובנה כדי לאפשר יישום מודולרי של כל אחד מהשלבים המתוארים ולשפר את המחקרים על embryogenesis, ביטוי גנטי, או התפתחות עצבית.

בתחילה הצלחנו לאמת את יכולת הקיום של העוברים באמצעות הפרמטרים של הפרוטוקול לרכישת diSPIM (סעיפים 1-6). עשרה עוברים בו ב -20 ° c, אחד נפח/עובר/דקה, משלב 2-cell לשלב 2 קיפול (7.5 שעות, 451 כרכים/העובר). כדי לפקח על חטיבות התאים ברחבי הembryogenesis, השתמשנו במתח BV514, אשר מבטא באופן ברור את Mcherry:: העיתונאיhistone בונה ממערך הטרנסגנים המשולב ujIs11324. איור 6 מראה ציר זמן של המחצית הראשונה של ההתפתחות העובריים עבור אחד מעוברי התמונה. כל תמונה מייצגת הקרנה בעוצמה מקסימלית של תצוגה בודדת (המופקת על-ידי שלבים 7-8) של העובר בתמונה. מצאנו כי הפרוטוקולים אופטימיזציה לא לגרום לפוטורעילות כל גילוי לעוברים, כפי שמוערך על ידי תזמון של חטיבות התא (לא מוצג), זמן הבקיעה, והעיתוי הקשור אבני דרך התפתחותית (איור 6 והפניות1 , מיכל בן 25 , 26).
לאחר מכן להחיל את הפרוטוקול כדי לנתח את הדינמיקה התרחבות של נוירונים בודדים בפיתוח עוברים. אנו התמונה DCR7692 (olaex4655), זן נמטודות של הטרנסגניים המבטא gfp מחוץ נוירופפטיד flp-19 היזם בקבוצת משנה של תאים לא מזוהים (DACR2819, החזית-19 (3.6 kb):: Syn21:: gfp:::p 10 3 ' utr) . בעקבות הצעדים של הפרוטוקול המתואר כאן, קבענו כי התאים בלתי מזוהה מתאים נוירונים מוטוריים RMDDL ו RMDDL, לתא תעלת הפרשות, ועל שני תאי שריר (איור 7). לאחר מכן בדקנו לכמת את הדינמיקה מוצלח של rmddl ו rmddl נוירונים. הבחנו כי rmddl ו rmddl הנוירונים הם מעוצבים בצורה מוקדמת כמו 360 דקות הפריה פוסט, עם ציר הסלולר יותר המייצג את הציר הבא עבור neurite מוצלח (איור 7 והסרט S1). באמצעות "neurite פשוטה העקיבה" תוסף בפיג והחלת אותו 3d השחזורים של כרכים התמזגו איזוטרובאלי, אנחנו לאחר מכן כימות הצמיחה סטריוטיפית של rmddl ו rmddl neurites עבור שישה עוברים. קבענו כי הדינמיקה מוצלח הוקלדה עבור rmddl ו rmddl על פני העוברים (להלן המכונה rmdds). מ 385-410 דקות הפריה הפוסט, RMDDs neurites מורחב 6.0 ± 0.5 μm (פירושו ± SEM; n = 12 neurites) הקדמי של גופי התא (איור 7b, C, I). מ 415-445 דקות הפריה פוסט, שני neurites להאריך דורסלי לתוך וסביב טבעת העצב שוערת (כוכבית באיור 7d). בממוצע, כל rmdd neurite extended 11.0 ± 0.6 יקרומטר (ממוצע ± SEM; n = 12 neurites) מגוף התא לפני שפגש באופן סינכרוני את המקביל הטבעתי בקודקוד הטבעת (איור 7i). חשוב מכך, תוצאות הנציג שלנו להפגין כי אנו מסוגלים לבחון, להשוות ולכמת תכונות התפתחותיות עצבי לתאים לזיהוי יחיד באמצעות פרוטוקול משולב שלנו (איור 7 ואיור 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig1.jpg"> איור 1: הגדרת הרכבה לדוגמה של diSPIM. (א) הכנת שמיכות עם פולי-ל-ליזין. בכניסה, 10 μL של ליזין פולי-L שימש לציפוי הכיסויים במשך 5 דקות. פולי-L-ליזין מאפשר העובר ביצה כדי לתקוע בחוזקה את הכיסויים במלבן. (ב) סכמטי של חדר הדמיה הפלדה והחדר המורכב. בכניסה, עוברים נציגים מכוונים עם הציר האחורי הקדמי בניצב לציר הארוך על הכיסויים. (ג) מורכב שפופרת אספירין עם מיקרוקפילר. (ד) חדר הדמיה פלדה רכוב במחזיק לדוגמה תחת מטרות 40-x לפחות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig2.jpg"> איור 2: הגדרת הדמיה diSPIM ארוכת טווח במיקרו-מנהל. (א) מומלץ להפעיל פרמטרים של צריכת חשמל בלייזר (מלבן אדום) הממוטב לדימות ממושך תוך הפחתת רעילות התמונה (כפי שמוערך בשיעור הבקיעה גבוה יותר של עוברי המשך). להגדיר 561 ננומטר לייזר ל 79 μW (0.25) ו 488 לייזר ננומטר ל179 μW (0.5). שים לב שכיול מדויק של הגדרות התוכנה לצריכת חשמל בלייזר משתנה בין התקנות diSPIM. מומלץ למשתמשים למדוד ולכייל את כוח הלייזר כדי להשיג 79 μW (561 nm) ו 179 μW (488 nm) כוח לייזר. (ב) הגדרת פרמטרים עבור שמירת נתונים (מלבן ירוק), הגדרות אמצעי אחסון (ריבוע כחול) והגדרות פרוסה (ריבוע כתום). (ג) dispim פרמטרים פוקוס אוטומטי עבור הדמיה ארוכת טווח של C. אלגיה embryogenesis (ראה שלבים 6.1-6.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig3.jpg"> איור 3: הדמיית תמונה והתקנת עיבוד נתונים באמצעות ציטוהצג. (א) תמונות Raw שנפתחו על ידי ציטוהצג. ציטוהצג הוא מסוגל לפתוח תמונות שנתפסו על ידי שני נתיבי המצלמה (SPIM A ו-B). תמונות raw אלה נפתחות בחלונות רב-ממדיים שנקראים מוניטור Dispim. במוניטור Dispim, "דפוס עניבת הקשת" נוצר כדי לבחור את הקצוות הקדמי, האחורי, האחוריים והגטיים של העובר (ראה שלב 9.1). בחירות של עניבת פרפר מעידות על כיוון העובר לפירוק ומעקב אחר הזדקנות בסיוע כוכבים. (ב) פרמטרים ממוטבים המשמשים להפקת תמונות איזוטרופיות. במהלך הרכישה בעת רכישת חלון, הגדר את הפרמטרים המצוינים בשלבים 9.5.1-9.5.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig4.jpg"> איור 4: תצורת מצלמה diSPIM. (א) צילום של מיקומי מצלמה וכיוונים. (ב) תיאור של + 90 מעלות סבבים של Spim A כדי להתאים את Spim B תמונות שנאספו. (ג) אמצעי אחסון לקלט (C) ביחס לכיוון מדד הכיוון + 1 המבוסס על תצורת המצלמה של dispim (ראה שלב 9.5.2). אנחנו מסובבים SPIM תמונה (עם) + 90 מעלות סביב ציר Y לפני ההרשמה להתאים את התמונה SPIM B (s). קנה מידה של סרגלים = 10 μm. תמונות מייצגות תצוגה בודדת, הקרנות בעוצמה מקסימלית ותמונות פירוק של העובר מתקפל 1.5 עם גרעינים עם תוויות (561-nm, אדום) ונוירונים (488-nm, ירוק). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig5.jpg"> איור 5: היווצרות ועריכה ג. אלגיה היוחסין העובריים באצטרי. (א) אנו משתמשים במרחרי לערוך את עקבות השושלת של סטארריניט (ראה הפניות5,6,8; כתבי-יד נכללים גם בצרור ההורדות שלנו). מרחרי תציג שמות שיטתית עבור כל גרעין (מלבן ירוק) עם סיום השלבים 10.1-10.2. חלון זה (A) מספק מידע (מלבן שחור) על כל תא בסימן השושלת (ABa, מודגש בכחול) המסייעים למשתמשים להנחות בעת מעקב ועריכה של עקבות שושלת היוחסין. מומלץ למשתמשים לאמת ולהשוות בין תאי שורה ומיקומם לשושלת ה -C. אלגיה שושלת התאים העובריים שדווחה בעבר על ידי sulston et al.1 בנוסף, אם משתמשים מעוניינים לאתר תאים ספציפיים ב שינוי סדרות נתונים (ראה להלן, B) הזינו שם שיטתי של C. אלגיה בסרגל החיפוש (מלבן כתום). (ב) סדרת הנתונים של המשתמש לפירוק נפתחת גם באופן אוטומטי עם סיום השלבים 10.1-10.2. מוצג כאן תמונה התמזגו איזוטרופית של העובר בשלב ארבעה תאים עם גרעינים המסומנים באדום. במהלך מעקב אחר גרעינים, משתמשים צריכים לשנות את עוצמת התמונה (ריבוע אדום) ולנווט בזמן ו-z באמצעות מקשי החצים על המקלדת שלהם (זמן-שמאלה/ימינה, z-up/למטה). (ג) 3d קריקטורה של נקודת הזמן ב (ב) עם פונקציונליות מסוימת (מלבן סגול) המאפשר Rotatable 3d-הדמיה. לקבלת סקירה של מרחרי והפונקציונליות התלת-ממדית שלה, ראה הפניות5,6,8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig6.jpg"> איור 6: הדינמיקה ההתפתחותית של העוברים על הצדדים. הפאנל העליון, תמונות diSPIM המציגה את המחצית הראשונה של התפתחות עובריים עבור אחד העוברים התמונה (זן BV514 ujIs11324). העוברים הועשו ברציפות, כל דקה ל7.5 שעות (בעשרים ° c). שתי התמונות הראשונות של הפאנל העליון מייצגות עוברי 4 ו-8 תאים עם גרעינים (אדום) ועמדות של גופי הקוטב (כדורים אדומים צפופים, מסומנים עם כוכביות כחולות). כל תמונה מייצגת הקרנה בעלת עוצמה מרבית של העובר בתמונה. קנה מידה של סרגלים = 10 μm. ציר הזמן (פס אופקי) מייצג דקות הפריה לאחר ההפריה (m.p.f.) של התפתחות העוברים בתחום הג. אנו מאומתים כי הפרמטרים של הפרוטוקול שלנו עבור רכישת diSPIM לא לגרום לפני התמונות לעבור העוברים התמונה כפי שמוערך על ידי הכדאיות, תזמון חטיבות התא, תזמון של בקיעה ותזמון של אבני דרך התפתחותית (ראה הפניות מיכל בן , מיכל בן 25 , 26). אנו מודעים לכך שהתזמון של אבני הדרך ההתפתחותית מעבר לעוברים עם פרמטרי ההדמיה שלנו (SEM ± 8.174 דקות במשך 6.4 שעות הדמיה של הפעלות ארוכות; n = 10). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig7_v2.jpg"> . איור 7 זיהוי תאי ואפיון תא בודד של דינמיקה neurite מוצלח בפיתוח עוברי המשך. הדמיה של צבע כפול של זן שנעשו על ידי חציית BV514 ujIs11324 (עבור הזדקנות) ו DCR7692 (olaex4655), זן נמטודות של טרנסגניים המבטא gfp את המקדם flp הנוירופפטיד -19 בקבוצת משנה של תאים לא מזוהים. (א-ח) בעקבות הצעדים של הפרוטוקול המתואר כאן, קבענו כי התאים בלתי מזוהה מתאים נוירונים מוטוריים RMDDL ו RMDDL (חיצים צהובים), אל תא תעלת הפרשות (חיצים כחולים), ועל שני תאי שריר (חיצים לבנים). (I) הקוונפיקציה של הדינמיקה מוצלח של rmddl ו rmddl הנוירונים באמצעות תוסף פיג'י "neurite מעקב פשוט" והחלת אותו 3d שחזורים של כרכים התמזגו איזוטרופית. שים לב כיצד הפקודה rmddl ו-rmddl מציגות דינמיקה של התרחבות סטריוטיפית, כל הרחבה באופן סינכרוני עבור אורך כולל של 17.7 ± 0.6 μm (ממוצע ± SEM; n = 12 neurites) ומפגש בקודקוד של טבעת העצבים (ראה גם סרט S1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig8.jpg"> איור 8: בחינת תמונות איזוטרופיות של מורפולוגיות עצבי בג עוברים . הדמיית איזוטרופי של AVHL ו-AVHL נוירונים (חיצים צהובים). באמצעות diSPIM, מורפולוגיות עצביים ניתן ללכוד מניב 4-מימדי (4D) תמונות עם רזולוציה מרחבית איזוטרופי של כ 330 ננומטר. ה-diSPIM מאפשר למשתמשים לסובב כמעט אמצעי אחסון של תמונה עם רזולוציה זהה בכל הכיוונים. תמונות ב -D הן הקרנות בעצימות מקסימלית של עוצמת התמונה בעלת אותו מעבר איזוטרופית מסיבובים שונים סביב הציר הארוך של העובר. קנה מידה ברים = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרט משלים S1: C. אלגיה עובר פיתוח מ 280 עד 434 דקות הפריה פוסט. הסרט איזוטרופי של זן DCR7692 (olaex4655) הביע ujIs113 באופן מפורש עם תוויות DACR2819 בדלילות rmdd Neurites (איור 7a-D, חיצים צהובים). DACR2819 גם מתייג שני תאי שריר (איור 7a-d, חצים לבנים) ו תא תעלת הפרשות (איור 7a-d, חץ כחול) במהלך התפתחות עובריים (איור 7a-d). קנה מידה ברים = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/Movie_S1.mov">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution at JoVE.com

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

פרוטוקול זה מאפשר מעקב יעיל של שושלת תאים וזהויות בעוברים חיים ובו זמנית מנתח מטומטמים מפורטים של תאים כגון אקסונים ודנדריטים בפיתוח נוירונים C.elegans. בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקאלית, מיקרוסקופיית תאורת מישורים סלקטיבית הפוכה בתצוגה כפולה או diSPIM מציעה אות גבוה יותר לרעש, רזולוציה מרחבית איזוטרופית יותר, ומתאימה יותר להדמיית vivo לטווח ארוך. התחל על ידי הוספת 500 microliters של 1%methylcellulose פתרון לתוך הדיכאון של שקופית מיקרוסקופ קעור.באמצעות בורר חוט פלטינה, להעביר מבוגרים מצלחת בינונית צמיחה nematode לתוך פתרון M9 מתילקלולוז. השתמשו בטיפים המחודדים של 18 מחטי מזרק כדי לחתוך כל חיה רוחבית באמצע הגוף לפחות לעובר אחד עד ארבעה תאים. עם שופר שאפתן מוחזק בעדינות בין השיניים, לפני מילוי פיפטה microcapillary עם 10 עד 15 microliters של חיץ M9 בעדינות לשאוף כמה עוברים מן השקופית לתוך נימי.מחלקים את העוברים למלבן המרכזי של המכסה של תא הדמיה מפלדה מלא במאגר M9 טרי. כוון בעדינות את העוברים אנכית כך שהציר הארוך של כל עובר יצב לציר הארוך של העטיפה. לאחר מכן מניחים את תא הדמיית הפלדה לתוך מחזיק הדגימה על הבמה של diSPIM.כדי להכין את העוברים להדמיה, פתח את מנהל המיקרו והגדר את עוצמות הלייזר ל-179 מיקרו-וואט 0.5% שקילות עבור 488 ננומטר ו-79 מיקרו-וואט 0.25% שקילות עבור 561 ננומטר. הכיול בין התאמת תוכנה לפלט לייזר אמיתי חייב להיעשות מראש על מנת להגדיר את הטווח עבור מיקרו וואט ספציפי. בתפריט תוספים, בחר בקרת התקן והחיל diSPIM הדמיה מדעית כדי לפתוח את ההדמיה המדעית המיושמת כפולה תצוגה הפוכה חלון מיקרוסקופיית תאורת מישור סלקטיבית.תחת הכרטיסיה רכישה, ודא שה הפרמטרים מוגדרים כמצוין. תחת הכרטיסיה פוקוס אוטומטי, הגדר את הפרמטרים כמצוין. שים לב כי ערוץ הפוקוס האוטומטי צריך לציין את ערוץ הפלואורסצנטיות הגרעינית לניסויי הקו המתוכננים.סמן את תיבות הקרן והדף עבור נתיב A או B ולחץ על שידור חי כדי להתחיל ברכישת התמונה. ייפתח חלון תצוגה חיה. לאחר מכן צייר תיבה סביב העובר המעניין כדי לבחור את אזור ניתוח הפוקוס האוטומטי של העובר ולחץ על התחל רכישה כדי ליזום את לכידת התמונה הרב-מידית לטווח הארוך.לצפייה בתמונה, עיבוד וניתוח שושלת תאים, לאחר הורדה וחילוץ של חבילת התוכנה, לחץ פעמיים על הקובץ CytoSHOW_app. jnlp כדי להתחיל להפעיל את CytoSHOW. תחת תפריט הקובץ, בחר מנהל מיקרו צג חדש ו- diSPIM כדי לאתר את תיקיית ערכת נתוני הבסיס שבה נשמרו תמונות מנהל המיקרו הגולמיות.בחר כל תיקיית נקודת זמן ולחץ על פתח. חלונות ניווט רב-מידיים ייפתחו באופן אוטומטי הן עבור SPIM A והן עבור SPIM B.באמצעות כלי בחירת המצולע, לחץ ממש מחוץ לקצוות האחוריים, האחוריים, הגביים והפינטריים של העובר המעניין כדי ליצור תבנית עניבת פרפר מעל העובר הן בתצוגות SPIM A והן בתצוגות SPIM B ולחץ על diSPIM. יישר את הערוצים הירוקים והרדומיים עבור כל זרוע SPIM ולחץ שוב על diSPIM.המשמרות יופעלו בכל חלונות המיקום האחרים. לאחר מכן, לחץ על diSPIM והתמזג כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח של אמצעי אחסון גולמיים של נתיך diSPIM ולהגדיר את הפרמטרים כפי שצוין. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על כן וציין את ספריית הפלט שבה יש לשמור את הקבצים המעובדים לפני שתלחץ על אישור. בחלון התצוגה המקדימה, הזז את פס הגלילה לנקודת זמן שתיים מהחלון והזז את מחוון z עד שהתצוגה תוצג ישירות לאורך הציר הארוך של העובר.הזז את פס הגלילה T אחורה לנקודת הזמן הראשונה בחלון התצוגה המקדימה ולהשתמש בכלי בחירת הקו כדי לצייר קו מהגרעין העגול ביותר בגחון דרך המישור של לוחות המטה-פאס של תא AB. לחצו על לחצן התצוגה המקדימה של diSPIM כדי לשמור את ההתאמות העדינות בכיוון של עוצמת הקול עם התמונה בתצוגה מקדימה. הגדר את פסי הגלילה של חלונות צג diSPIM לנקודות זמן ההתחלה והסיום של טווח התמונות המלא לעיבוד.לאחר מכן לחץ על אישור. לניתוח שושלת תאים יעיל ומדויק, חיוני להשיג כיוון ADL מדויק של נפחי הנתונים לפני עיבוד ליל הכוכבים. כדי לפתוח את סדרת מעקב שושלת סטארי לילה ב AceTree, לפתוח את הקובץ AceTree מותאם אישית שסופקו ובחר לפתוח קובץ להגדיר כדי לאתר את ספריית הפלט שצוין קודם לכן. פתח את תיקיית המשנה של הנתיך עבור העובר המעניין ובחר את הקובץ הערוך.לאחר מכן לחץ על פתח והמשך עם הפריט החזותי והעריכה של שושלת היוחסין כפי שתואר קודם לכן. פרוטוקולים ממוטבים אינם גורמים לפוטוטוקסיות הניתנת לגילוי לעוברים כפי שהוערכה על ידי זמן הבקיעה והעיתוי הקשור לאבני דרך התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול זה כפי שהודגם, התאים הבלתי מזוהים בחלבון פלואורסצנטי ירוק מהוסס זה המבטאים זן נמטודה נקבעו כך שיתאימו לנוירונים מוטוריים, לתא התעלה הפרשתי ולשני תאי שריר.הנוירונים שזוהו עוצבו בצורה אלכסית כבר לפני 360 דקות לאחר ההפריה עם הציר התאי הארוך יותר המייצג את הציר הבא עבור נויריט יציבה. מ 385 עד 410 דקות לאחר ההפריה, נויריטס RMDD המורחבת כ שישה מיקרומטרים לפני גופי התא. מ 415 עד 445 דקות לאחר ההפריה, שני neurites המורחבת הגבית לתוך ומסביב טבעת העצבים המשוערת.בממוצע, כל נויריט RMDD הרחיב כ 11 מיקרומטרים מגוף התא לפני עמידה סינכרונית עמיתו contralateral בשיא הטבעת. יחד, נתונים אלה מראים כי תכונות התפתחותיות עצביות עבור תאים הניתנים לזיהוי יחיד מסוגלים להיבדק, להשוות ולכרות באמצעות פרוטוקול משולב זה. חשוב לזכור לכוון את העוברים אנכית כך שהציר הארוך של כל עובר יצב לציר הארוך של העטיפה.באמצעות פרוטוקול זה, התחלנו לחקור את מערכת העצבים העוברית המתהווה מכל הזוויות. לדוגמה, במהלך לידת תאים, הגירה והתבראות, היווצרות נוירית, תולדה ופציקולציה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

שיתוף לוקליזציה של סמני שושלת תא ואת האיתותים העגבניות

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

מיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה (HREM) - פרוטוקולים פשוטים ורב-עוצמה לעיבוד והדמיה של חומרים אורגניים

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...