Name: isotropic light-sheet microscopy and automated cell lineage analyses to catalogue caenorhabditis elegans embryogenesis with subcellular resolution
Uploaded: 2019-06-06T14:00:00
Duration: 8 min 16 s
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우리는 통합 된 스트레인에 대 한 존 머 레이 감사, ujIs113, 선 에이징 스트레인 BV514를 생성 하; 브 랜던 하 비 (NIBIB) 프로토콜 테스트에 대 한 도움; 존 다니엘 스와 게리 르노 (응용 과학 계측) 마이크로 관리자 및 diSPIM 악기에 대 한 지원을 위해; 그리고 앤드류 요크와 행 크 에덴은 diSPIM 시스템에 대 한 그들의 중요 한 피드백. 우리는 또한 회의 및 브레인스토밍 플랫폼을 제공 하기 위해 소수 기관 프로그램에 대 한 연구 센터와 Neurobiología 호세 델 카스 티 요 (Universidad 데 푸에르토 리코)에 게 감사를 드립니다. 이 작업의 대부분은 위트 먼 프로그램을 통해 우즈 홀에서 해양 생물 실험실에서 실시 되었다. 이 작업은 생물 의학 영상 및 생물 공학의 NIH 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 및 NIH 보조금 No. U01-HD075602 및 아니오. R24-OD016474 마크 w. Moyle는 F32-NS098616에 의해 지원 되었고, 레이 턴 h. 던컨는 R24 OD016474에 다양성 보충에 의해 지원 되었다.

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	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Bao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cell+lineage+tracing+in+Caenorhabditis+elegans.">Automated cell lineage tracing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (8), 2707-2712 (2006).</li><li>Santella, A., Du, Z., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-local+neighborhood-based+framework+for+probabilistic+cell+lineage+tracing.">A semi-local neighborhood-based framework for probabilistic cell lineage tracing.</a> BMC Bioinformatics. 15, 217 (2014).</li><li>Santella, A., Du, Z., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+blob-slice+model+for+accurate+and+efficient+detection+of+fluorescence+labeled+nuclei+in+3D.">A hybrid blob-slice model for accurate and efficient detection of fluorescence labeled nuclei in 3D.</a> BMC Bioinformatics. 11, 580 (2010).</li><li>Boyle, T. J., Bao, Z., Murray, J. I., Araya, C. L., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AceTree:+a+tool+for+visual+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis.">AceTree: a tool for visual analysis of Caenorhabditis elegans embryogenesis.</a> BMC Bioinformatics. 7, 275 (2006).</li><li>Katzman, B., Tang, D., Santella, A., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AceTree:+a+major+update+and+case+study+in+the+long+term+maintenance+of+open-source+scientific+software.">AceTree: a major update and case study in the long term maintenance of open-source scientific software.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 121 (2018).</li><li>Murray, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+embryonic+gene+expression+with+cellular+resolution+in+C.+elegans.">Automated analysis of embryonic gene expression with cellular resolution in C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (8), 703-709 (2008).</li><li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree.">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy.">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nature Biotechnology. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Stage-+and+Slit-Scanning+to+Improve+Contrast+and+Optical+Sectioning+in+Dual-View+Inverted+Light+Sheet+Microscopy+(diSPIM).">Using Stage- and Slit-Scanning to Improve Contrast and Optical Sectioning in Dual-View Inverted Light Sheet Microscopy (diSPIM).</a> The Biological Bulletin. 231 (1), 26-39 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li><li>Wu, Y., Christensen, R., Colon-Ramos, D., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+optical+imaging+techniques+for+neurodevelopment.">Advanced optical imaging techniques for neurodevelopment.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1090-1097 (2013).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology.">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nature Methods. 12 (1), 23-26 (2015).</li><li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+fluorescence+microscopy:+advances+in+high+speed+biological+imaging.">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 46-53 (2014).</li><li>Lucy, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+technique+for+the+rectification+of+observed+distributions.">An iterative technique for the rectification of observed distributions.</a> Astronomical Journal. 76 (6), 745-754 (1974).</li><li>Richardson, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian-Based+Iterative+Method+of+Image+Restoration.">Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration.</a> JOSA. 62 (1), 55-59 (1972).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+microManager.">Computer control of microscopes using microManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 14, (2010).</li><li>Gualda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIM-fluid:+open+source+light-sheet+based+platform+for+high-throughput+imaging.">SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging.</a> Biomedical Optics Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).</li><li>Ardiel, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Calcium+Flux+in+Freely+Moving+Nematode+Embryos.">Visualizing Calcium Flux in Freely Moving Nematode Embryos.</a> Biophysical Journal. 112 (9), 1975-1983 (2017).</li><li>Walton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicoid+class+homeodomain+factors+ceh-36/OTX+and+unc-30/PITX+cooperate+in+C.+elegans+embryonic+progenitor+cells+to+regulate+robust+development.">The Bicoid class homeodomain factors ceh-36/OTX and unc-30/PITX cooperate in C. elegans embryonic progenitor cells to regulate robust development.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005003 (2015).</li><li>Altun, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormAtlas. , (2002).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology:+In+the+nematode+C.+elegans.">Embryology: In the nematode C. elegans.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. Chapter 8, 215-241 (1988).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314 (1165), (1986).</li><li>Bao, Z., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+Caenorhabditis+elegans+embryos+for+live+imaging+of+embryogenesis.">Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis.</a> Cold Spring Harb Protoc. (9), (2011).</li><li>Christensen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untwisting+the+Caenorhabditis+elegans+embryo.">Untwisting the Caenorhabditis elegans embryo.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Santella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormGUIDES:+an+interactive+single+cell+developmental+atlas+and+tool+for+collaborative+multidimensional+data+exploration.">WormGUIDES: an interactive single cell developmental atlas and tool for collaborative multidimensional data exploration.</a> BMC Bioinformatics. 16, 189 (2015).</li><li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first+version+of+the+Caenorhabditis+elegans+Promoterome.">A first version of the Caenorhabditis elegans Promoterome.</a> Genome Research. 14 (10B), 2169-2175 (2004).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+transcription+factor+gene+duplication+from+Caenorhabditis+elegans+Promoterome-driven+expression+patterns.">Insight into transcription factor gene duplication from Caenorhabditis elegans Promoterome-driven expression patterns.</a> BMC Genomics. 8 (27), (2007).</li><li>. WormBase Available from: <a target="_blank" href="https://www.wormbase.org">https://www.wormbase.org</a> (2019)</li><li>Lee, R. Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormBase+2017:+molting+into+a+new+stage.">WormBase 2017: molting into a new stage.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), D869-D874 (2018).</li></ol>

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C. 엘 더는 각 성인 뉴런의 최종 위치 및 연결성을 가진 유일한 유기 체로 서27개의 알려진 것으로 눈에 띈다. 그러나, C 를 구성 하는 작업 회로 및 네트워크의 조직으로 이어지는 발달 역학은 커넥터는 알 수 없는 남아. 빛 현미경의 진보에서 떠오르는 기회에 기초 하 여, 우리는 지금 포착 하 고 C 에 걸쳐 세포 위치, 형태 형성 및 신경 형성을 분석할 수 있습니다.
우리가 설명 하 고 우리가 일상적으로 실험실에서 사용 하는 절차는 C 에서 세포 선 노화에 대 한 레이블이 있는 뉴런 및 핵의 4d 등방성 이미지를 산출 합니다. 더 중요 한 것은 분석의 속도와 정밀도를 향상 시키기 위해 diSPIM과 결합 된 반자동 라인 에이징 기능과 고해상도 이미지를 사용 하 여 장기적인 이미징 조건을 최적화 하 여 C. 엘 레 강 스 배아 발생을 개선 하는 것입니다. 이 통합 프로토콜은 사용자가 세포를 시각화 하 고 식별 하 고 초기 경련의 발병을 통해 신경 테 이주 및 축 삭 파스 트와 같은 3 차원 기능을 정량화 할 수 있게 합니다. 이 절차는 ASI diSPIM 시스템으로 모든 시설에 쉽게 적용 할 수 있으며이 프로토콜을 위해 특별히이 시스템을 권장 합니다. 상업적으로 제공 되는 다른 SPIM 제형은 샘플 챔버 및 광학 특성에서 ASI 구성과 다를 수 있다. 그러나 다른 플랫폼에서 내보낸 데이터는 데이터 파이프라인을 통해 넣을 수도 있습니다. 따라서 선 에이징에서의 가치 평가, 이미지 품질 및 기기 안정성에 대 한 까다로운 테스트가 가능 합니다. 우리가 적극적으로 다른 표본을 정기적으로 이미지 (예: 드로 소 필 라 및 제 브라 피쉬 배아)를 사용 하지만, 설명 된 배아의 포괄적 인 선 노화 분석은 여전히 현재 마 테 오드 종으로 제한 된다. 더 크거나 두꺼운 샘플의 경우, 우리는 고정 된 라이트 시트를 통해 샘플을 스캔 하는 단계 스캐닝 접근법을 사용 하도록 선택 합니다. 쿠마 르 외. 이전에는 diSPIM10에 추가 수정 없이 두꺼운 샘플에서 고품질 이미지를 생성 하기 위해 개선 된 dispim 단면을 시연 했습니다.
프로토콜 내의 중요 한 단계에는 폴 리-L-라이 신 코팅 커버 슬립, 데이터 수집 및 데이터 처리에 대 한 c. 엘 더 란 트 배아가 포함 됩니다. 유리 커버 슬립의 수확 및 장착 c. 엘 더 란 스 배아는 미숙한 사용자에 게 어려울 수 있지만 여기에서는 학습을 촉진 하기 위한 주요 단계의 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 장기 화상 진 찰이 요구 되는 경우에, 우리는 8-10 청년 성인28에서 4 세포 또는 초기 배아를 수확 하는 최상의 결과를 얻습니다. 오래 된 성인은 자 궁과 수정 되지 않은 계란에 있는 이전 배아를 포함 하는 경향이 있기 때문에 초기 단계 배아를 수확 하는 것이 덜 바람직합니다. 배아를 장착 하는 것과 관련 하 여 조립 된 흡 인기 (입 피 펫)의 막힘 또는 미세 모 세관 파이 펫의 개 구 부의 너무 큰 등의 문제는 배아의 적절 한 장착 및 배 향을 방해할 수 있습니다. 최적의 이미징에 대비 하기 위해, 우리는 초기 및 후반 사전 경련 배아에 대 한 사전 획득 테스트를 수행 하 여 라이트 시트, 카메라, 목표 및 자동 초점의 성능을 확인 합니다. 우리는 이러한 모든 작업을 테스트 하 고 우리의 사전 획득 테스트 중에 높은 품질의 이미지를 얻을 때 최상의 결과를 얻을. 이는 등방성 공간 해상도로 이미지를 생성 하는 데 특히 적합 하며 두 뷰 (목표)에서 획득 한 raw 이미지는 고품질 이어야 합니다. 획득 후 각 뷰에 대해 획득 된 볼륨이 등방성 이미지를 생성 하도록 처리 됩니다. 이 프로토콜에 설명 된 대로 적절 한 GPU (그래픽 처리 장치) 카드를 사용 하는 것이 중요 합니다 (아래 참조). 이를 통해이 트로피 칼 융합 이미지가 생성 되는 처리 속도가 향상 되어 데이터 분석 시간이 단축 됩니다. 또한 사용자가 최신 버전의 사이토 쇼를 실행 하 고 StarryNite 자동 라인 에이징에 대 한 우리의 다운로드 번들과 함께 제공 되는 매개 변수를 사용 하는 것이 필수적 이다. 사용자가 다른 샘플에 대해 자동 라인 에이징 (예: 제 브라 피시, 초파리 등)을 사용 하려는 경우 starrynite에 사용 되는 매개 변수에 대 한 추가 최적화가 필요 합니다 (참조3,4참조).
우리의 통합 프로토콜은 사전 경련 배아에 이미지와 선 노화 결과를 제공 하지만, 사용자는 포스트 경련 배아의 자동화 된 선 노화가 현재 실현 가능 하지 않다는 것을 알고 있어야 합니다: 핵 위치는 초 단위로 변경 됩니다. 후 경련 배아, 너무 빠르게 계보 추적을 허용 합니다. 그러나, dispim은 실제로 신경 발달 사건을 포착 하 고 배아 발생23,29의 포스트 경련 단계에서 일부 세포 위치를 추적 할 수 있는 유망한 능력을 입증 했습니다. 사용자가 포스트 경련 배아를 검사 하는 데 관심이 있다면 diSPIM은 빠른 속도로 움직이는 배아에서 체적 스냅샷을 얻고 신경 근 성장 등의 미세 신경 발달 사건을 추적 하는 속도를 제공 합니다.
이 프로토콜은 WormGUIDES atlas30의 셀 바이 셀 완성을 위한 기초가 되며,이는 고해상도 등방성 이미지와 통합 된 접근법을 제공 하 여 표시 된 뉴런의 3d 형태학을 식별 하 고 포착 합니다. 첫 번째 430 분의 배아 발생. 그것은 스탠드, 프로토 타입 WormGUIDES atlas 개발 배아 세포의 핵 위치를 제공 하 고 배아 뉴런의 하위 집합의 발달 역학을 캡처하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 추가 개발 뉴런을 WormGUIDES atlas30으로 통합 하기 위한 열쇠가 될 것입니다.
당사의 통합 프로토콜은 또한 c. 엘 레 강 스 배아에서 새로운 유전자 발현 프로필을 탐색 하는 것을 단순화 합니다. 형질 전환 c.엘 레 강 스에서, 많은 세포 특이 적 프로모터는 공간적으로 및 시간적으로 이식 유전자 발현을 조절 한다. 대부분의 유전자의 발현 패턴은 성인 동물 (31),32,33,34등을 광범위 하 게 특징으로 하는 반면에, 거의 모든 것이 아직 개발 (특히 후반 단계) 배아. C. 엘에이 칸의 상태 올리기형은 세포 특유의 이식 유전자 발현을 촉진 하 고, 유전자 기능이 세포 자치 또는 비 자율적 인지 여부를 결정할 수 있도록 웜 커뮤니티에 유용한 자원이 되었습니다. 유전자의 등방성 고 분해능 및 동적 발현 패턴을 포착 하 고, 선 노화를 통해 발현 세포를 정확 하 게 식별 하는 것은 과학계의 많은 사람들에 게 가치가 있습니다.
배아 발생은 두 가지 주요 과정, 세포 분화 및 조직 형태 형성을 포함 한다. 큰 거래는 메커니즘 및 C의 개발 하는 동안 고유 세포 유형을 정의 하는 분자에 대 한 알려져 있다. 그러나 c. 엘 레 강 스 배아에서 세포 이동, 세포 부착 및 세포 형태에 중요 한 메카니즘에 대해 거의 알려지지 않았다. 알려진 c. 엘 더 린 불변 세포 혈통으로, 우리의 프로토콜은 우리가 쉽게 새로운 세부 수준에서 형태학 상 동안 배아의 카탈로그 된 3d-미세 해부학을 분별 할 수 있습니다: 예를 들어, 축 삭 파스, synaptogenesis 및 신경 활동. 디스트 렐 외. 이전에는 C 에서 단일 뉴런의 수준에서 칼슘 과도 상태를 포착 하기 위해 diSPIM의 힘을 입증 했습니다. 엘 레 강 스 배아23. 발달 생리학의 그밖 많은 양상은이 방법에 의하여 조회를 위해 익은 다.
마지막으로,이 프로토콜은 주로 자동화 되 고 체계적으로 해체 이미지를 생성 하 고 StarryNite 및 비구를 통해 세포 라인 노화를 수행 하는 데 걸리는 시간을 줄입니다. 이 프로토콜에 사용 되는 소프트웨어 전략은 우리가 여기에서 보여준 매우 특정 분야에서 멀리 떨어진 생물학의 많은 질문에 적용 될 수 있습니다.
소프트웨어 호환성 및 다운로드 액세스에 대 한 세부 정보
DiSPIM 이미징 용 마이크로 관리자 및 플러그인에 대 한 정보는 http://dispim.org/software/micro-manager 및 https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin에서 확인할 수 있습니다.
데이터 처리 파이프라인에는 현재 Windows 운영 체제가 필요 합니다. 우리는 모든 필요한 데이터 처리 프로그램 및 지원 파일의 설치를 단순화 하기 위해 단일 아카이브 파일을 번들로 제공 하 고 있습니다. 그것은 http://dispimlineage.wormguides.org에서 다운로드 할 수 있습니다.
사이토 쇼 (http://run.cytoshow.org/)는 널리 사용 되 고 오픈 소스 이미지 분석 플랫폼을 기반으로, ImageJ (v1). Java는 사이토 쇼를 사용 하는 컴퓨터에 최신 설치 되어 있어야 하며, 사이토 쇼에 대 한 업데이트는 자바 웹 시작을 통해 자동으로 배포 됩니다. 사이토 쇼의 많은 ImageJ 기반 기능은 https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html에서 설명 되 고 도시 된 바와 같다. 사이토 쇼는 TIFF 출력을 생성 하는 다른 이미징 소프트웨어 뿐만 아니라 ASI diSPIM에서 다차원 원시 데이터를 표시 하도록 사용자 정의 되었습니다. 원칙적으로 다른 다중 뷰 SPIM 이미징 시스템은이 프로토콜이 다른 현미경 시스템에서 수행 될 수 있도록 사이토 쇼의 사소한 수정에 의해 지원 될 수 있습니다.

SpimFusion은 cuda 툴킷 v 7.5와 함께 Visual Studio 2013을 사용 하 여 CUDA/c + +로 작성 되었습니다. SpimFusion 실행에는 특정 컴퓨터 하드웨어가 필요 합니다: CUDA 컴퓨팅 기능이 1.0 이상인 NVIDIA 그래픽 처리 장치 (GPU) 카드 및 최소 2gb의 그래픽 카드 메모리. 우리의 프로토콜의 출판 시점에서 SpimFusion은 미 출간 (분 궈와 하 리 Shroff) 하지만 위에서 언급 한 소프트웨어 번들 아카이브에서 사용할 수 있습니다.

StarryNite의 특수 제작 된 명령줄 기반 버전을 사용 하려면 자유롭게 사용할 수 있는 MATLAB 컴파일러 런타임이 설치 되어 있어야 하지만 상업용 MATLAB 소프트웨어에 대 한 라이센스가 필요 하지 않습니다. MATLAB 컴파일러 런타임은 위에서 언급 한 소프트웨어 번들 아카이브에 포함 되어 있습니다. 이 프로토콜에서 사용 되는 StarryNite에 대 한 코드는 기본적으로 공초점 이미지6에 사용 되는 것과 변경 되지 않습니다. 그러나, StarryNite 처리 및 StarryNite 결과의 처리를 위한 입력 이미지의 생성에 몇 가지 운영 문제는 융합 등방성 diSPIM에 대 한 연속 데이터 처리 파이프 라인을 가능 하 게 하는 세포 쇼의 방법으로 여기에서 해결 되었습니다 볼륨. 이러한 변경 사항은 이러한 전처리 및 후 처리 단계를 처리 하는 사이토 쇼 코드에 의해 자동화 됩니다. 또한 사이토 쇼는 미리 최적화 된 diSPIM 특정 템플릿을 편집 하 여 이미지 데이터에서 핵의 형광 강도로 세그먼트 알고리즘을 자동으로 조정 하는 StarryNite 매개 변수를 설정 합니다. 각 diSPIM 데이터 세트에서 StarryNite가 사용 하는 고유한 매개 변수는 출력 이미지 및 lineaging 데이터와 함께 파일에 저장 됩니다.
16 비트 이미지와 함께 작동 하 고 Java3D 렌더링과의 호환성을 유지 하는 사용자 지정 버전의 비구는이 프로토콜에 가장 적합 합니다. 또한 위에서 언급 한 소프트웨어 번들 아카이브에 포함 되어 있습니다.

C. 엘 레 강 스는 배아의 모든 세포가 신경 발달을 통해 관찰 될 수 있는 유일한 유기 체로 서 두드러집니다. 전체 세포-계보 알려진 불변1, 그리고 배아에서 단일 세포의 라벨링 및 연속 이미징을 허용 하는 새로운 도구의 개발과 함께, 생물학자는 이제 신경 세포의 개발에 다른 단계를 검토 시작할 수 있습니다 긴장 모든 각도에서 시스템-세포 출생; 이주 및 분화; 신경 돌기 형성, 표적으로 한 성장 및 근 막; 시 냅 스 형성; 및 기능 회로의 튜닝. 안정적으로 발현 된 기자와 형광 현미경을 결합 하 여 c. 엘 레 강 스 배아에서 뉴런의 성장 역학을 포착 하는 것은 과학적 공동체에 게 가치가 있습니다.
C. 엘 레 강 스에서의 발달 연구는 무 손상 유기 체1내의 단일 세포 수준에서 문맥 이해를 증강 하기 위하여 수시로이 종의 불변 세포-혈통 그리고 세포 운명 지도를 활용 합니다. 자동 라인 에이징 분석-starrynite2,3,4 및 아 세 리5,6,7,8 소프트웨어 사용-고대비, 고해상도의 이점 형광 핵의 이미지. 최적으로 작동 하려면, 스타 린 트/아 세토 또한 개발 중에 이미지 배아의 예측 가능한 제한 방향에 따라 달라 집니다. 두 커버 슬립 사이에 압축 된 c. 엘 레 강 트 배아에서 수행 된 공초점 현미경 검사 법은 고 콘트라스트/고 분해능과 예측 가능한 제약을 모두 제공 하기 때문에 10 년 이상 표준 자동 라인 에이징 현미경 법입니다. 배아의 방향7,8. 우리는 이전에 신규 한 광 시트 기반의 이중 보기 거꾸로 선택적 평면 조명 현미경 (dispim)의 건설 및 사용을 설명 하는 등의 라이브 샘플 이미징 c. 엘 더 니스 배아 발생 발생9,10 , 11 , 12 , 13. 가벼운 시트 현미경은 일반적으로 라이브 3d 표본14,15의 낮은 광 독성, 고속 및 장기 이미징 기능을 제공 합니다. DiSPIM 방법은 특히 거의 등방성 공간 해상도가 약 330 nm9의 4 차원 (4d) 이미지를 생성 합니다.
DiSPIM은 공초점 현미경과 비교 하 여 더 높은 신호 대 잡음비와 속도, 등방성 공간 분해능을 제공 하며 장기 생체 이미징16에 더 적합 합니다. 따라서 우리는 StarryNite/아 세이 어에 입력을 위한 diSPIM 데이터를 조정 하 고 이것이 선 에이징 분석을 향상 시킬 수 있는지 여부를 조사 했습니다. 주요 장애물은 diSPIM 표본이 StarryNite/비구에 대 한 예상 방향을 채택 하기 위해 계란-압축에 의해 쉽게 구속 될 수 없다는 것입니다. 분석 중인 볼륨에서 셀 위치의 임의 방향은 자동 라인 에이징 분석의 정확도를 저하 시킵니다.
따라서 사용자가 diSPIM 이미지의 전처리 중에 배아의 정확한 3D 방향을 선택할 수 있는 뷰어 안내 사용자 인터페이스인 사이토 쇼를 채택 하 여 품질에 최적화 된 이미지 데이터를 산출 하 고 StarryNite에 입력을 위한 상황 인식 /비구. 이미지 배아의 사용자 선택에 따라, 사이토 쇼는 자동화 된 데이터 처리 파이프라인을 조율 합니다. 자른 및 배경 뺀 배아 이미지는 각 위치, 타임 포인트 및 보기에 대 한 TIFF 스택 파일 내에 저장 됩니다. 그런 다음, 사이토 쇼는 프로그램 spimfusion을 반복적으로 호출 하 여, 리차드 슨-루시17,18 알고리즘을 사용 하 여 등방성 고해상도 체적 이미지를 산출 하는 두 개의 사전 처리 된 뷰를 공동 등록 하 고 공동으로 해체 합니다. DiSPIM 특정 매개 변수 집합은 이미지 세분화 및이에이 트로피 칼 융합 이미지의 핵 추적 중에 동작을 제어 하기 위해 StarryNite에 최적화 되었습니다. 융합 된 이미지와 lineaging 결과는 사용자가 StarryNite에 의해 생성 된 자동 계보 추적의 오류를 식별 하 고 수정할 수 있는 아 세 트리를 사용 하 여 편집 됩니다. 아 세토 트리는 또한 배아에서 추적 된 핵의 계보 트리와 3D 모델링 렌더링을 제시할 수 있습니다. 우리는 자동 라인 에이징 속도와 정확도가 모두 SPIM 카메라의 raw 이미지와 비교할 때이 트로피 칼 융합 이미지를 사용 하 여 현저 하 게 향상 된 것을 발견 합니다. 여기에 설명 된 c. 엘 더 스 응용 프로그램에 최적화 된 우리의 프로토콜은 일반적으로 다른 종이나 표본에 대해 생성 된 diSPIM 데이터의 자동 라인 에이징에 적합 할 수 있습니다. 이 프로토콜이 의도 된 용도로 사용 되는 경우에는3,4와 같이 새 표본에 starrynite 매개 변수의 추가 조정이 필요할 수 있음을 유의 하십시오.
이 프로토콜의 성공적인 구현은 4D 등방성 해상도로 이미지를 구현 하 고 생물학자가 세포 라인을 추적 할 수 있게 하는 동시에 개발 C. 엘 레 강 스 배아에서 뉴런을 식별 하 고 분석 합니다. 또한, 몇 가지 후 처리 알고리즘을 병합 하 여 하드웨어 가속이 가장 많은 시간을 소비 하는-우리는 이제 본질적으로 실시간으로 미세 세포의 세부 사항과 살아있는 배아 세포의 운명 모두를 분석 할 수 있습니다. 이 새로운 프로토콜은 생체 내에서 분화 및 형태 형성을 연구 하는 동안 세포 거동을 정확 하 고 정보에 입각 한 조작 및 관찰을 가능 하 게 합니다. 이 원고에서 우리는 선 노화 및 세포 추적을 위해 개발 된 개선 된 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제시 합니다 c. 엘 레 강 스 배아를 개발, 배아 발생의 연구를 향상 시키기 위해, 유전자 발현 또는 신경 개발.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steps 1-4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concavity slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1519006</td>
			<td>5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with 10&#215;&#8211;50&#215; zoom range</td>
			<td>Motic</td>
			<td>SMZ-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, no. 1.5, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose &#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7509-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary pipette aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, no. 18G x 1 &#189; (1.2mm x 40mm)</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared as described by Brenner (1974)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring for imaging chamber</td>
			<td>O-Rings West</td>
			<td>M1.5X40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Corning/Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095D5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.5-mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>267201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm)</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td>I2450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Eyelash Pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hart, A. C. Behavior. WormBook.&#160; (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steps 5-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm long-pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-488 RU-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561-nm notch filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-561E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLP02-561R-25, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software for bottom camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td></td>
			<td>ProgRes CapturePro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSIPM assembly video</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSPIM alignment video</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>https://youtu.be/qnOrg30NNuE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSPIM imaging PC</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total,&#160;64&#160;GB memory, Windows 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF01-525/45-25, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF555-DI03-25X36, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging PC Graphics Card</td>
			<td>NVIDIDA</td>
			<td></td>
			<td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kumar et al diSPIM Setup</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 &#160;diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manager</td>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table with isolators, 4 feet &#215; 6 feet &#215; 12 inches</td>
			<td>TMC</td>
			<td>784-651-02DR and 14-416-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steps 7-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis PC</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis PC Graphics Card</td>
			<td>NVIDIDA</td>
			<td></td>
			<td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation instructions</td>
			<td>Software bundle</td>
			<td></td>
			<td>http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software bundle</td>
			<td>Software bundle</td>
			<td></td>
			<td>http://dispimlineage.wormguides.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isotropic light-sheet microscopy and automated cell lineage analyses to catalogue caenorhabditis elegans embryogenesis with subcellular resolution

아닌, 캘리포니아 (C.엘 레 강 스)는 전체 신 경계의 세포 기원을 이해 하는 도전이 생체 내에서 단일 세포 분해능과 함께 관찰 될 수 있는 유일한 유기 체로 서 두드러집니다. 여기서 우리는 c. 엘 레 강 스 배아에서 신경 발달 검사를 위한 통합 프로토콜을 제시 합니다. 우리의 프로토콜은 개발 배아에서 단일 세포의 이미징, 선 노화 및 신경 해부학 적 추적을 결합 합니다. 살아있는 C. 이중 보기 반전 선택적인 평면 조명 현미경 검사 법 (diSPIM)을 사용 하 여 거의 등방성 공간 해상도를 가진 엘 레 건스 배아의 장기, 4 차원 (4d) 이미지를 얻습니다. 선 충 배아의 핵 및 뉴런 구조는 3 차원 모두에서 ~ 330 nm의 분해능으로 이미지를 산출 하 고이에이 트로피 칼 융합을 이미지화 한다. 이 분 별 고 분해능 4D 데이터 세트는 단일 셀 및 하위 셀룰러 수준의 세부 수준에서 유전자 발현 및 형태학 적 역학과 함께 확실 한 세포 계보 정체성을 연관 시키기 위해 분석 됩니다. 당사의 프로토콜은 설명 된 각 단계의 모듈식 구현을 가능 하 게 하 고 배아 발생, 유전자 발현 또는 신경 발달에 대 한 연구를 강화 하도록 구성 되어 있습니다.

우리는 먼저 diSPIM 취득을 위한 프로토콜의 매개 변수를 사용 하 여 이미지 된 배아의 생존 가능성을 검증 (섹션 1-6). 10 개의 배아는 2-세포 단계에서 2 배 단계 (7.5 시간, 451 부피/배아)로 20°c, 1 부피/배아에서 동시에 영상 촬영 하였다. 배아 발생 전반에 걸쳐 세포 분열을 모니터링 하기 위해 우리는 Mcherry를 표현 하는 UBIQUITOUSLY 스트레인 BV514를 사용 했습니다:: ujIs11324통합 된 이식 유전자 배열에서histone 리포터 구조. 도 6 은 이미지 된 배아 중 하나에 대 한 배아 개발의이 상반기의 타임 라인을 보여준다. 각 이미지는 이미지화 된 배아의 단일 뷰 최대 강도 투영 (7-8 단계에서 생성)을 나타냅니다. 우리는 최적화 된 프로토콜이 세포 분열 (도시 되지 않음)의 타이밍, 부 화 시간 및 발달 이정표와 관련 된 타이밍에 의해 평가 됨에 따라 배아에 대 한 검출 가능한 광 독성을 유발 하지 않는다는 것을 발견 했습니다 (그림 6 및 참조1 , 25 , 26).
그런 다음이 프로토콜을 적용 하 여 배아 발병에서 단일 뉴런의 성장 동력을 분석 했습니다. 우리는 DCR7692 (olaex4655), 정체 불명의 세포의 서브 세트에서의 neuropeptide flp-19 프로모터 떨어져 GFP를 표현 하는 형질 전환 된 네 마 충 균 주를 이미지화 하였다 (DACR2819, pflp- 199K(3.6KB)::: caax::p 10 3 ' UTR) . 여기에 설명 된 프로토콜의 단계에 따라, 우리는 알 수 없는 세포가 운동 뉴런 RMDDL 및 RMDDL, 배설물 운하 세포 및 2 개의 근육 세포에 상응 하는 것으로 판단 하였다 (도 7). 그런 다음 RMDDL 및 RMDDL 뉴런의 성장 동력을 검사 하 고 정량화 했습니다. 우리는 RMDDL 및 RMDDL 뉴런을 360 분 후에 경사지 게 형성 하는 것을 관찰 했 고,이는 신경 세포의 성장에 대 한 후속 축을 나타내는 더 긴 셀룰러 축 (그림 7 및 영화 S1)입니다. 피지의 "단순 신경 테 추적" 플러그인을 사용 하 여이 등 트로피 칼 융합 볼륨의 3d 재구성에 적용, 우리는 6 개의 배아에 대 한 rmddl 및 rmddl 신경의 입체 파생물을 정량화. 우리는 배아에 걸쳐 RMDDL과 RMDDL에 대 한 성장 역학이 입체 형식 이라고 결정 했습니다 (여기에 Rmddl 라고 함). 385-410 분부터 수정 후, RMDDs 신경은 6.0 ± 0.5 µm 확장 (평균 ± SEM; 세포 체의 전방 (도 7b, c1). 415-445 분부터 게시물 수정, 두 신경은도 마를 확장 하 고 추정 신경 링 ( 그림 7d에서 별표) 주위. 평균적으로 각각의 RMDD 신경은 확장 11.0 ± 0.6 µm (평균 ± SEM; n = 12 신경 세포)에서 링의 정점에서의 반대편 대응을 동기적으로 충족 시키기 전에 (그림 7i). 중요 한 것은, 우리의 대표적인 결과는 우리의 통합 프로토콜을 사용 하 여 단일 식별 가능한 세포에 대 한 신경 발달 기능을 검사, 비교 및 정량화 할 수 있다는 것을 입증 합니다 (그림 7 및 그림 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig1.jpg"> 그림 1: diSPIM 샘플 장착 설정 (A) 폴 리 신을 사용한 커버 슬립의 제조. 인 셋에서, 10 µ L의 폴 리 라이 신은 커버 슬립을 5 분 동안 코팅 하는 데 사용 되었다. 폴 리-L-라이 신은 배아에 그 쉘이 직사각형의 커버 슬립에 단단히 붙어 있습니다. (B) 스틸 이미징 챔버와 조립 된 챔버의 개략도. 인 삽입에서, 대표적인 배아는 커버 슬립 상의 장 축에 수직인 전방 후방 축으로 지향 된다. (C) 미세 모 세관 파이 펫과 함께 조립 된 흡 기 튜브. (D) diSPIM 40x 대물 렌즈의 샘플 홀더에 장착 된 스틸 이미징 챔버. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig2.jpg"> 그림 2: 마이크로 관리자의 장기 diSPIM 이미징 설정 (A) 광 독성을 줄이면서 장기간 이미징에 최적화 된 권장 diSPIM 레이저 전력 매개 변수 (적색 직사각형). 561 nm 레이저를 79 µW 0.25) 및 488 nm 레이저를 179 µW (0.5)로 설정 합니다. 레이저 전력에 대 한 소프트웨어 설정의 정확한 교정은 diSPIM 설치에 따라 다릅니다. 79 µW 561 nm) 및 179 488 µW 레이저 파워를 달성 하기 위해 사용자가 레이저 파워를 측정 하 고 교정 하는 것이 좋습니다. (B) 데이터 저장을 위한 dispim 매개 변수 (녹색 직사각형), 볼륨 설정 (파란색 정사각형) 및 슬라이스 설정 (주황색 정사각형) C.dispim af의 장기 이미징에 대 한 자동 초점 매개 변수 (6.1 ~ 6.6 단계 참조) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig3.jpg"> 그림 3: 사이토 쇼를 사용 하 여 이미지 시각화 및 데이터 처리 설정. (A) 사이토 쇼에 의해 열린 원시 diSPIM 이미지. 사이토 쇼는 두 카메라 경로 (SPIM A와 B)에 의해 캡처된 이미지를 열 수 있습니다. 이러한 raw 이미지는 Dispim 모니터라는 다차원 창에서 열립니다. Dispim 모니터에서 "보 타이 패턴"은 배아의 전방, 후방, 등 쪽 및 복 부 가장자리를 선택 하기 위해 생성 됩니다 (9.1 단계 참조). 리본 타이 선택은 해체 및 StarryNite 지원 lineaging 추적을 위한 배아 방향을 나타냅니다. (B) 등방성 이미지를 생성 하는 데 사용 되는 최적화 된 매개 변수입니다. 윈도우를 가져오는 동안 해체 에서 9.5.1-9.5.8 단계에 지정 된 매개 변수를 설정 하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig4.jpg"> 그림 4: diSPIM 카메라 구성 (A) diSPIM 카메라 배치 및 방향에 대 한 사진. (B) 수집 된 spim 이미지와 일치 하도록 Spim A의 90도 회전을 묘사 합니다. (C) diSPIM의 카메라 구성에 따라 방향 인덱스 + 1에 상대적인 입력 볼륨 (9.5.2 단계 참조) 스 핌 B 이미지에 맞추기 위해, 등록 전에 스 핌 이미지 (들) + 90도를 Y 축 주위로 회전 시킵니다. 축척 막대 = 10 µm 이미지는 대표 단일 뷰, 최대 강도 프로젝션 및 1.5-표시 핵 (561-nm, 빨간색) 및 뉴런 (488-nm, 녹색)을 가진 배아의 해체 이미지입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig5.jpg"> 그림 5: 큐 레이 션 및 편집 c. 아 세토에서의 배아 혈통. (A) 아세 트리를 사용 하 여 starrynite의 계보 흔적을 편집 합니다 (참고 문헌5,6,8참조). 원고는 또한 우리의 다운로드 번들에 포함 되어 있습니다. 그는 10.1-10.2 단계 완료 시 각 핵 (녹색 직사각형)에 대 한 체계적인 이름을 표시 합니다 . 이 창 (A)는 계보 추적을 추적 하 고 편집할 때 사용자에 게 도움이 되는 정보 (ABa, 파란색으로 강조 표시 됨)의 각 셀에 대 한 정보가 제공 됩니다. 사용자가 확인 하 고 선 세 셀과 그 위치를 비교 하는 것이 좋습니다 c. 엘 레 강 스 배아 세포 혈통은 이전에 술 스턴에 의해 보고 된.1 또한, 사용자가 특정 셀의 위치를 찾는 데 관심이 있는 경우 데이터 시리즈의 해체 (아래 참조, B)는 검색 바 (주황색 직사각형)에서 c. 엘 레 강 스 체계적인 이름을 입력 합니다. (B) 사용자의 자동 완성 된 데이터 계열은 10.1 ~ 10.2 단계를 완료 하는 즉시 열립니다. 빨간색으로 표시 된 핵이 있는 4 세포 단계 배아의이 트로피 칼 융합 이미지가 여기에 표시 됩니다. 핵을 추적 하는 동안 사용자는 이미지의 강도 (빨간색 정사각형)를 변경 하 고 키보드의 화살표 키 (왼쪽/오른쪽, z 위/아래)를 사용 하 여 시간과 z를 탐색 해야 합니다. (C) 회전 가능한 3d 시각화를 가능 하 게하는 특정 기능 (보라색 직사각형)의 timepoint의 3d 만화. 비구와 3d 기능에 대 한 개요는 참조5,6,8을 참조 하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig6.jpg"> 그림 6: diSPIM에 대한 c. 엘 더 스 배아의 시간 개발 역학. 상부 패널은, 이미지 된 배아 중 하나에 대 한 배아 개발의 상반기를 보여주는 diSPIM 영상 (스트레인 BV514 ujIs11324). 배아는 7.5 시간 (20°c에서) 동안 매 분 마다 연속적으로 이미지화 되었다. 상단 패널의 처음 두 이미지는 핵 (빨간색)과 극성 체의 위치 (파란색 별표로 표시 된 짙은 빨간색 구형)와 4 및 8 셀 배아를 나타냅니다. 각 이미지는 이미지화 된 배아의 단일 뷰 최대 강도 프로젝션을 나타냅니다. 축척 막대 = 10 µm. 타임 라인 (가로 막대)은 c. 엘 더 란 스 배아의 개발의 포스트 시비 (m.p.f.) 분을 나타낸다. 우리는 diSPIM 취득에 대 한 우리의 프로토콜의 매개 변수는 생존, 세포 분열의 타이밍, 개발 이정표의 해칭 및 타이밍에 의해 평가 되는 이미지 배아에 대 한 검출 가능한 광 독성을 유도 하지 않았다 검증 (참조 1 , 25 , 26). 우리는 개발 이정표의 타이밍은 우리의 이미징 매개 변수와 배아에 걸쳐 재현할 수 있었다 (6.4 시간 긴 이미징 세션에 대 한 SEM ± 8.174 분; = 10). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig7_v2.jpg"> 그림 7입니다. C. 엘 레 강 스 배아를 개발 하는 신경 세포의 성장 역학의 셀룰러 식별 및 단일 세포 특성화. BV514 ujIs113를 교차 하 여 만든 균 주의 이중 색 이미징 (선 노화 용) 및 DCR7692 (olaex4655), 알 수 없는 세포의 서브 세트에서 neuropeptide FLP-19 프로모터 떨어져 GFP를 표현 하는 형질 전환 네 마 충 균 주. (-H) 여기에 설명 된 프로토콜의 단계에 따라, 우리는 알 수 없는 세포가 배설물 운하 세포 (파란색 화살표)에, 그리고 두 개의 근육 세포 (백색 화살표)에 게 RMDDL 및 RMDDL (노란 화살)에 상응 하는 모터 뉴런에 대응 한다고 결정 했습니다. (I) 피지 플러그인을 사용 하 여 RMDDL 및 RMDDL 뉴런의 성장 역학의 정량화 "간단한 신경 테 추적" 및이 소부 트로피 칼 융합 볼륨의 3d 재구성에 적용. RMDDL과 RMDDL이 모두 전체 길이 11.0 ± 0.6 µm (평균 ± SEM) 동안 동기적으로 확장 되는 입체 형의 비 성장 역학을 보여 줍니다. 신경 링의 등 쪽 꼭대기에서 회합 하는 것이 가능 합니다 ( 영화 S1참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig8.jpg"> 도 8: c. 엘 레 강 스 배아에서의 신경 형태에 대 한 등방성 디 스 핌 이미지의 검사. AVHL 및 AVHL 뉴런 (노란색 화살표)의 등방성 시각화. DiSPIM을 사용 하 여, 뉴런 형태는 약 330 nm의 등방성 공간 분해능을 갖는 4 차원 (4d) 이미지를 산출 할 수 있다. DiSPIM을 사용 하면 사용자가 모든 방향에서 동일한 해상도로 이미지 볼륨을 사실상 회전할 수 있습니다. A-D 의 이미지는 배아의 긴 축을 중심으로 별개의 회전에서 동일한이 소 트로피 칼 융합 dispim 이미지 볼륨의 최대 강도 투영입니다. 축척 막대 = 5 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 동영상 S1: 280에서 434 분 후에 개발 된 엘 더 스 배아. 등방성의 변형 DCR7692 (olaex4655)는 rmdd 신경에 DACR2819 희소 하 게 라벨링 된 ujIs113 ubiquitously를 발현 합니다 (그림 7a, 노란색 화살표). DACR2819는 또한 배아 개발 중에 두 개의 근육 세포 (그림7a-d, 흰색 화살표) 및 배설 운하 세포 (그림 7A-d, 파란색 화살표)를 레이블 합니다 (그림 7a-d). 축척 막대 = 10 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/Movie_S1.mov">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

이 프로토콜은 C.elegans 뉴런 개발에 축축한 및 점원과 같은 상세한 세포 형태를 동시에 분석하는 동안 살아있는 배아에서 세포 계보 및 정체성의 효율적인 추적을 가능하게 합니다. 공초점 현미경 검사법에 비해 이중 보기 반전 선택적 비행기 조명 현미경 검사법 또는 diSPIM은 소음에 더 높은 신호, 더 많은 등위학적 공간 해상도를 제공하며 생체 내 이미징의 장기에 더 적합합니다. 오목한 현미경 슬라이드의 우울증에 1% 메틸셀룰로오스 용액의 500 마이크로리터를 추가하여 시작합니다.플래티넘 와이어 픽을 사용하여 선충 성장 중간 플레이트에서 M9 메틸셀룰로오스 용액으로 성인을 이송합니다. 18 게이지 피하 바늘의 날카로운 팁을 사용하여 각 동물을 중간 체에서 반비례하여 적어도 1 ~ 4 개의 세포 배아로 슬라이스하십시오. 아스피라이터 마우스피스가 치아 사이에 부드럽게 유지되어 M9 버퍼 10~15마이크로리터로 마이크로카세필리 파이펫을 미리 채우고 슬라이드에서 모세관으로 여러 배아를 부드럽게 흡인시합니다.신선한 M9 버퍼로 채워진 강철 이미징 챔버의 커버슬립의 중앙 사각형으로 배아를 분배합니다. 각 배아의 긴 축이 커버슬립의 긴 축에 수직이 되도록 배아를 수직으로 부드럽게 방향을 지정합니다. 그런 다음 강철 이미징 챔버를 디스피M 의 단계에서 샘플 홀더에 놓습니다.이미징용 배아를 준비하기 위해 마이크로 매니저를 열고 레이저 강도를 179 마이크로와트0.5%의 동일성으로 설정하여 488나노미터 및 79마이크로와트0.25%의 561나노미터에 대해 동일성을 설정합니다. 소프트웨어 조정과 실제 레이저 출력 간의 교정은 특정 마이크로와트의 범위를 설정하려면 미리 수행해야 합니다. 플러그인 메뉴에서 장치 제어를 선택하고 과학 이미징 diSPIM을 적용하여 적용 된 과학 이미징 이중 보기 반전 선택적 평면 조명 현미경 창을 엽니 다.획득 탭에서 매개 변수가 표시된 대로 설정되어 있는지 확인합니다. 자동 초점 탭에서 표시된 대로 매개 변수를 설정합니다. 자동 초점 채널은 계획된 리노징 실험에 대해 핵 형광 채널을 지정해야 합니다.경로 A 또는 B에 대한 빔과 시트 박스를 확인하고 라이브를 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 라이브 뷰 창이 열립니다. 그런 다음 관심있는 배아 주위에 상자를 그려 배아의 자동 초점 분석 영역을 선택하고 시작 인수를 클릭하여 장기 다차원 이미지 캡처를 시작합니다.이미지 보기, 처리 및 셀 리니지 분석을 위해 소프트웨어 번들을 다운로드하고 추출한 후 CytoSHOW_app jnlp 파일을 두 번 클릭하여 CytoSHOW 실행을 시작합니다. 파일 메뉴에서 새 및 diSPIM 모니터 마이크로 관리자를 선택하여 원시 마이크로 관리자 이미지가 저장된 루트 데이터 집합 폴더를 찾습니다.시간 점 폴더를 선택하고 열기를 클릭합니다. 다차원 네비게이션 창은 다차원 네비게이션 윈도우가 다각형 선택 도구를 사용하여 SPIM A와 SPIM B.를 모두 자동으로 열고, 관심있는 배아의 전방, 후방, 등및 복부 가장자리 바로 밖을 클릭하여 SPIM A및 SPIM B 뷰 모두에서 배아 위에 나비 넥타이 패턴을 생성하고 디스피엠을 클릭합니다. 각 SPIM 암에 대한 녹색 및 빨간색 채널을 정렬하고 다시 diSPIM을 클릭합니다.교대는 다른 모든 위치 창에서 트리거됩니다. 다음으로, 디스피M을 클릭하고 퓨즈를 클릭하여 deconvolved 퓨즈 퓨즈 디스피M 원시 데이터 볼륨 대화 상자를 열고 표시된 대로 매개 변수를 설정합니다. 모든 매개 변수가 설정된 경우 예를 클릭하고 확인을 클릭하기 전에 처리된 파일을 저장할 출력 디렉터리를 지정합니다. 미리 보기 창에서 t-스크롤 막대를 창 의 두 시간 지점으로 이동하고 배아의 긴 축을 직접 따라 보기가 표시될 때까지 z-슬라이더를 이동합니다.t 스크롤 막대를 미리 보기 창에서 시간 지점 1로 다시 이동하고 라인 선택 도구를 사용하여 AB 셀 메타위상 플레이트의 평면을 통해 복부 대부분의 둥근 핵에서 선을 그립니다. 디스피M 미리 보기 버튼을 클릭하여 미리 보기된 이미지 볼륨의 방향을 미세조정합니다. 디스피M 모니터 창의 t 스크롤 막대를 처리할 전체 이미지 범위의 시작 및 종료 시간 점으로 설정합니다.그런 다음 확인을 클릭합니다. 효율적이고 정확한 셀 리니지 분석을 위해서는 Starry Night 처리 전에 데이터 볼륨의 정확한 ADL 방향을 달성하는 것이 중요합니다. AceTree에서 별이 빛나는 야간 계보 추적 시리즈를 열려면 제공된 사용자 지정된 AceTree 파일을 열고 열린 구성 파일을 선택하여 이전에 표시된 출력 디렉터리를 찾습니다. 관심 있는 배아용 퓨즈 하위 폴더를 열고 편집된 파일을 선택합니다.그런 다음 열린 다음 이전에 설명한 대로 계보 시각화 및 편집을 진행합니다. 최적화된 프로토콜은 부화 시점및 발달 이정표와 관련된 타이밍에 의해 평가된 바와 같이 배아에 검출 가능한 광독성을 유도하지 않습니다. 이 프로토콜을 사용하여 선충 균주를 발현하는 이 형광성 단백질에서 정체불명의 세포는 운동 뉴런, 배설운하 세포 및 2개의 근육 세포에 대응하도록 결정되었다.확인된 뉴런은 뉴라이트 아웃성장을 위한 후속 축을 나타내는 더 긴 세포축으로 360분 일찍 수정을 부각했다. 385내지 410분 후 수정, RMDD 중성염은 세포체의 전방약 6마이크로미터를 확장했다. 415분에서 445분 후 수정, 두 중성염은 추정 신경 고리 안팎으로 등쪽으로 확장되었습니다.평균적으로, 각 RMDD neurite는 링의 정점에 있는 그것의 반대측을 동기적으로 충족하기 전에 세포 바디에서 대략 11 마이크로미터를 확장했습니다. 종합, 이러한 데이터는 단일 식별 셀에 대한 신경 발달 기능이 이 통합 프로토콜을 사용하여 검사, 비교 및 정량화될 수 있음을 보여줍니다. 각 배아의 긴 축이 커버슬립의 긴 축에 수직이 되도록 배아를 수직으로 방향을 지정하는 것이 중요합니다.이 프로토콜을 사용하여, 우리는 모든 각도에서 초기 배아 신경계를 탐구하기 시작했습니다. 예를 들면, 세포 출생 도중, 이주 및 분화, 중성염 형성, 밖으로 성장 및 매혹.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

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선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

연구

발생학

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

고해상도 무시 무시 현미경 (HREM) - 유기 재료의 시각화 및 처리를위한 간단하고 강력한 프로토콜

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

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라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...