Name: isotropic light-sheet microscopy and automated cell lineage analyses to catalogue caenorhabditis elegans embryogenesis with subcellular resolution
Uploaded: 2019-06-06T14:00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution at JoVE.com

Biz entegre strain için John Murray teşekkür ederiz, ujIs113, lineaging gerinim BV514 oluşturmak için; Brandon Harvey (NıBıB) protokolü test etmek için yardım; Jon Daniels ve Gary Rondeau (uygulamalı bilimsel enstrümantasyon) Micro-Manager ve diSPIM enstrüman ile yardım için; ve Andrew York ve Hank eden diSPIM sistemi üzerinde kritik geribildirim için. Ayrıca bir toplantı ve beyin fırtınası platformu sağlamak için azınlık kurumları Araştırma Merkezi programı ve Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) için teşekkür ederiz. Bu çalışmanın çoğu Whitman programı aracılığıyla Woods Hole 'daki deniz biyolojik Laboratuvarı 'nda yapılmıştır. Bu çalışma NıH Ulusal Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü Intramural araştırma programları ve NıH Grant No tarafından destekleniyordu. U01-HD075602 ve hayır. R24-OD016474. Mark W. Moyle, F32-NS098616 ve Leighton H. Duncan tarafından desteklenen bir çeşitlilik Supplement tarafından R24-OD016474 tarafından destekleniyordu.

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Bao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cell+lineage+tracing+in+Caenorhabditis+elegans.">Automated cell lineage tracing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (8), 2707-2712 (2006).</li><li>Santella, A., Du, Z., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-local+neighborhood-based+framework+for+probabilistic+cell+lineage+tracing.">A semi-local neighborhood-based framework for probabilistic cell lineage tracing.</a> BMC Bioinformatics. 15, 217 (2014).</li><li>Santella, A., Du, Z., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+blob-slice+model+for+accurate+and+efficient+detection+of+fluorescence+labeled+nuclei+in+3D.">A hybrid blob-slice model for accurate and efficient detection of fluorescence labeled nuclei in 3D.</a> BMC Bioinformatics. 11, 580 (2010).</li><li>Boyle, T. J., Bao, Z., Murray, J. I., Araya, C. L., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AceTree:+a+tool+for+visual+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis.">AceTree: a tool for visual analysis of Caenorhabditis elegans embryogenesis.</a> BMC Bioinformatics. 7, 275 (2006).</li><li>Katzman, B., Tang, D., Santella, A., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AceTree:+a+major+update+and+case+study+in+the+long+term+maintenance+of+open-source+scientific+software.">AceTree: a major update and case study in the long term maintenance of open-source scientific software.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 121 (2018).</li><li>Murray, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+embryonic+gene+expression+with+cellular+resolution+in+C.+elegans.">Automated analysis of embryonic gene expression with cellular resolution in C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (8), 703-709 (2008).</li><li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree.">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy.">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nature Biotechnology. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Stage-+and+Slit-Scanning+to+Improve+Contrast+and+Optical+Sectioning+in+Dual-View+Inverted+Light+Sheet+Microscopy+(diSPIM).">Using Stage- and Slit-Scanning to Improve Contrast and Optical Sectioning in Dual-View Inverted Light Sheet Microscopy (diSPIM).</a> The Biological Bulletin. 231 (1), 26-39 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging.">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li><li>Wu, Y., Christensen, R., Colon-Ramos, D., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+optical+imaging+techniques+for+neurodevelopment.">Advanced optical imaging techniques for neurodevelopment.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1090-1097 (2013).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology.">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nature Methods. 12 (1), 23-26 (2015).</li><li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+fluorescence+microscopy:+advances+in+high+speed+biological+imaging.">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 46-53 (2014).</li><li>Lucy, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+technique+for+the+rectification+of+observed+distributions.">An iterative technique for the rectification of observed distributions.</a> Astronomical Journal. 76 (6), 745-754 (1974).</li><li>Richardson, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian-Based+Iterative+Method+of+Image+Restoration.">Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration.</a> JOSA. 62 (1), 55-59 (1972).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+microManager.">Computer control of microscopes using microManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 14, (2010).</li><li>Gualda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIM-fluid:+open+source+light-sheet+based+platform+for+high-throughput+imaging.">SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging.</a> Biomedical Optics Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).</li><li>Ardiel, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Calcium+Flux+in+Freely+Moving+Nematode+Embryos.">Visualizing Calcium Flux in Freely Moving Nematode Embryos.</a> Biophysical Journal. 112 (9), 1975-1983 (2017).</li><li>Walton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicoid+class+homeodomain+factors+ceh-36/OTX+and+unc-30/PITX+cooperate+in+C.+elegans+embryonic+progenitor+cells+to+regulate+robust+development.">The Bicoid class homeodomain factors ceh-36/OTX and unc-30/PITX cooperate in C. elegans embryonic progenitor cells to regulate robust development.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005003 (2015).</li><li>Altun, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormAtlas. , (2002).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology:+In+the+nematode+C.+elegans.">Embryology: In the nematode C. elegans.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. Chapter 8, 215-241 (1988).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314 (1165), (1986).</li><li>Bao, Z., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+Caenorhabditis+elegans+embryos+for+live+imaging+of+embryogenesis.">Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis.</a> Cold Spring Harb Protoc. (9), (2011).</li><li>Christensen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untwisting+the+Caenorhabditis+elegans+embryo.">Untwisting the Caenorhabditis elegans embryo.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Santella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormGUIDES:+an+interactive+single+cell+developmental+atlas+and+tool+for+collaborative+multidimensional+data+exploration.">WormGUIDES: an interactive single cell developmental atlas and tool for collaborative multidimensional data exploration.</a> BMC Bioinformatics. 16, 189 (2015).</li><li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first+version+of+the+Caenorhabditis+elegans+Promoterome.">A first version of the Caenorhabditis elegans Promoterome.</a> Genome Research. 14 (10B), 2169-2175 (2004).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+transcription+factor+gene+duplication+from+Caenorhabditis+elegans+Promoterome-driven+expression+patterns.">Insight into transcription factor gene duplication from Caenorhabditis elegans Promoterome-driven expression patterns.</a> BMC Genomics. 8 (27), (2007).</li><li>. WormBase Available from: <a target="_blank" href="https://www.wormbase.org">https://www.wormbase.org</a> (2019)</li><li>Lee, R. Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormBase+2017:+molting+into+a+new+stage.">WormBase 2017: molting into a new stage.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), D869-D874 (2018).</li></ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

C. elegans son pozisyonlar ve27bilinen her yetişkin nöron bağlantı ile tek organizma olarak öne çıkmaktadır. Ancak, C. elegans konektom 'i yapan çalışma devreleri ve ağlar örgütine giden gelişimsel dinamikler bilinmiyor. Işık mikroskobu gelişmeler gelen fırsatlar dayanarak, şimdi yakalamak ve hücre konumlarını analiz, morfojenler, ve C. elegans embriyonik gelişimi boyunca nörojenez.
Biz tarif ettiğimiz ve rutin olarak laboratuvarda kullandığınız prosedür, C. elegans embriyolarındaki hücre satırı için etiketli nöronların ve çekirdeklerin 4d-izotropik görüntülerini verir. Daha da önemlisi, biz Dispım ile uzun vadeli görüntüleme koşulları optimize edilmiş ve C. elegans embryogenesis analiz hızını ve hassasiyetini artırmak için yüksek çözünürlüklü görüntüleri ile yarı otomatik lineaging yetenekleri birleştiğinde. Bu tümleşik protokol, kullanıcıların hücreleri görselleştirmesine ve tanımlamasına ve erken seğirme başlangıcı ile nörit göçü ve akon fascic Bu yordam, bir ASı Dispım sistemi ile herhangi bir tesis içine kolayca uyarlanabilir ve bu sistem özellikle bu protokol için öneririz. Ticari olarak sunulan diğer SPıM formülasyonları, örnek oda ve optik özellikteki ASı konfigürasyonlarından farklı olabilir. Ancak, diğer platformlardan dışa aktarılan veriler de veri ardışık düzenimize konulabilir. Bu nedenle, lineaging kendi değerinin değerleme, görüntü kalitesi ve enstrüman stabilitesi zorlu bir test, uygulanabilir. Dispım 'ı düzenli olarak diğer numuneler (Drosophila ve zebra balığı embriyoları gibi) için aktif olarak kullansa da, embriyoların açıklanan ve kapsamlı lineaging Analizi halen nematod türlerle sınırlıdır. Daha büyük veya kalın örnekler için, örnekleri sabit bir ışık levha aracılığıyla tarayacak sahne tarama yaklaşımlarını kullanmayı tercih ediyoruz. Kumar ve ark. daha önce Dispım10ek değişiklikler olmadan kalın örneklerden yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için bu geliştirilmiş dispım bölümleme göstermiştir.
Protokol içindeki kritik adımlar arasında C. elegans embriyoları poli-L-Lysine kaplamalı coverslip, veri edinme ve veri işleme arasında montaj bulunmaktadır. Hasat ve montaj C. elegans embriyolar cam lamel magazini deneyimsiz kullanıcılar için zor olabilir, ama burada öğrenme kolaylaştırmak için önemli adımlar ayrıntılı bir protokol sağlar. Uzun süreli görüntüleme isteniyorsa, 8-10 genç yetişkinlerden gelen dört hücreli veya daha önceki embriyolar hasat en iyi sonuçları elde28. Onlar rahim ve döllenmeyen yumurtalar eski embriyolar içeren eğilimindedir çünkü eski yetişkinler erken evre embriyo hasat için daha az arzu edilir unutmayın. Embriyo montajı açısından, monte aspiratördeki tıkanma (ağız pipeti) veya mikrokapiller pipetinde çok büyük bir açılış gibi sorunlar embriyoların uygun şekilde takılması ve oryantasyonunu önleyebilir. Optimum görüntüleme hazırlığı için, hafif levhalar, kameralar, hedefler ve otofokus performansını kontrol etmek için erken ve geç saat öncesi embriyolar üzerinde satın alma öncesi testler gerçekleştiriyoruz. Bu işlemlerin tümü test edildiğinde en iyi sonuçları elde ediyoruz ve satın alma öncesi testlerimiz sırasında yüksek kalitede görüntüler kazanıyoruz. Bu özellikle izotropik uzamsal çözünürlüğe sahip görüntüler oluşturmak için geçerlidir, her iki görünümden elde edilen ham görüntülerin (hedefler) yüksek kalitede olması gerekir. Satın aldıktan sonra, her görünüm için alınan birimler izotropik görüntüler elde etmek için işlenir. Bu protokolde açıklandığı gibi uygun bir grafik işleme birimi (GPU) kartı kullanmak önemlidir (aşağıya bakın). Bu, ısotropically erimiş görüntüleri oluşturulur, veri analizleri için zaman kısaltma işlem hızını artırır. Ayrıca, kullanıcıların en son Sitat sürümünü çalıştırmasına ve StarryNite otomatik satırlık için indirme paketimiz ile sağlanan parametreleri kullandığıyla da zorunludur. Kullanıcılar diğer örnekler (örneğin, zebrafish, Drosophila vb.) için otomatik lineaging kullanmayı ilgileniyorsanız, starrynite 'de kullanılan parametrelere ek optimizasyon gerekli olacaktır (bkz. referanslar3,4).
Entegre protokolün ön-seğirme embriyo içinde görüntü ve lineaging sonuçları sağlasa da, kullanıcılar, sonrası seğirme embriyo otomatik lineaging Şu anda mümkün değildir farkında olmalıdır: nükleer pozisyonlar saniye sırasına göre değişir seğirme sonrası embriyo, çok hızlı bir şekilde Lineage izleme izin vermek. Ancak, dispim gerçekten nörogelişimsel olayları yakalamak için umut verici bir yetenek göstermiştir ve embriyogenesis Post-twkaşıntı aşamalarında bazı hücre konumlarını izlemek23,29. Eğer kullanıcılar Post-seğirme embriyo inceleyerek ilgileniyorsanız, diSPIM hacimsel anlık görüntüler elde etmek için hız sağlar ve ince nörogelişimsel olayları izlemek, nörit büyüme gibi, hızla hareket eden embriyolar.
Bu protokol WormGUIDES Atlas30hücre-by-Cell tamamlanması için temel olacak, tanımlamak ve sırasında etiketli nöronların 3D morfolojileri yakalamak için yüksek çözünürlüklü izotropik görüntüleri ile entegre bir yaklaşım sağlayacaktır embriyogenesis ilk 430 dakika. Olduğu gibi, prototip WormGUIDES Atlas gelişmekte olan embriyo hücrelerin nükleer pozisyonlar sağlar ve embriyonik nöronların bir alt kümesinin gelişimsel dinamiklerini yakalamak amaçlamaktadır. Bu protokol WormGUIDES Atlas30içine ek gelişmekte olan nöronların entegrasyonu için bir anahtar olacaktır.
Entegre protokollerimiz C. elegans embryo 'da yeni gen ifade profillerini keşfetmeyi de basitleştirecek. Transjenik C. elegans, birçok hücreye özgü Rehberleri dağınık ve geçici olarak transgen ifade kontrol. Çoğu genlerin ifade desenleri yaygın yetişkin hayvan31,32,33,34, neredeyse tüm henüz gelişmekte olan karakterize edilmelidir karakterize edilmiştir iken (özellikle geç aşama) embriyo. C. elegans promoterome hücre spesifik transgen ifade götürmek için solucan topluluğuna yararlı bir kaynak olmuştur, yanı sıra gen işlevi hücre otonom veya otonom olmayan olup olmadığını belirlemek. Genlerin izotropik yüksek çözünürlüklü ve dinamik ifade desenleri yakalama ve tam olarak lineaging yoluyla ifade hücreleri tanımlayan bilimsel toplumda birçok değerli olacaktır.
Embriyogenesis iki iç içe geçmiş büyük süreçler, hücresel farklılaşma ve doku morfojeninden oluşur. C. elegansgelişimi sırasında farklı hücre türlerini tanımlayan mekanizmalar ve moleküller hakkında büyük bir anlaşma bilinmektedir. Ancak, küçük mekanizma hücre göç, hücre yapışma için önemli ve C. elegans embryo hücre şekli hakkında bilinmektedir. Bilinen C. elegans sabit hücre sırtı ile, bizim protokol bize kolayca detay yeni düzeylerde morfojenler sırasında embriyonun kataloglu 3D-mikroanatomisini ayırt sağlar: Örneğin, Axon fasciculation, synaptogenesis, ve nöronal aktivite. Ardiel ve al. daha önce C. elegans embriyolar23tek bir nöronların düzeyinde kalsiyum geçiciler yakalamak için dispım gücünü göstermiştir. Gelişimsel fizyolojisinin diğer birçok yönü bu yöntemlerle soruşturma için olgunlaşmış durumdadır.
Son olarak, bu protokol büyük ölçüde otomatiktir ve sistematik deconvolution görüntüleri oluşturmak ve StarryNite ve Asetree üzerinden hücre-lineaging gerçekleştirmek için gereken süreyi azaltır. Bu protokolde kullanılan yazılım stratejileri, biyolojinin pek çok soruya, onları burada gösterdiği çok spesifik alanlardan uzak bir şekilde uygulanabilmektedir.
Yazılım uyumluluğu ve indirme erişimi hakkında ayrıntılar
Micro-Manager ve Dispım görüntüleme için eklentiler hakkında bilgi http://dispim.org/software/micro-manager ve https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin adresinde mevcuttur.
Veri işleme ardışık düzeni şu anda bir Windows işletim sistemi gerektirir. Gerekli tüm veri işleme programlarının ve destek dosyalarının yüklenmesini kolaylaştırmak için tek bir arşiv dosyası paketlemiştir. Http://dispimlineage.wormguides.org adresinde indirilebilir.
Sitshow (http://run.cytoshow.org/) yaygın olarak kullanılan ve açık kaynak görüntü analiz platformu, ımagej (v1) dayanmaktadır. Java 'nın bilgisayarda yüklü olması ve Sitat gösterisi kullanmak için güncel olması ve Sitat güncellemeleri Java Web Start yoluyla otomatik olarak dağıtılmalıdır. Birçok ımagej tabanlı işlevleri Sitshow olarak açıklandığı ve https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html adresinde gösterilmiştir. Sitshow, ASı Dispım 'ın yanı sıra TIFF çıkışı oluşturan diğer görüntüleme yazılımından çok boyutlu ham verileri görüntülemek için özelleştirilmiştir. Prensip olarak, diğer Multi-View SPıM görüntüleme sistemleri bu protokolün farklı mikroskop sistemlerinde gerçekleştirilmesine izin vermek için Sitat 'ın küçük değişiklikleriyle desteklenebilir.

SpimFusion CUDA/C++ CUDA Toolkit v 7.5 ile Visual Studio 2013 kullanarak yazılmıştır. SpimFusion çalışan belirli bir bilgisayar donanımı gerektirir: bir NVıDıA grafik işlemci birimi (GPU) kartı CUDA işlem yeteneği 1,0 veya üzeri ve en az 2 GB grafik kartı belleği. Protokolün yayınlanması sırasında, SpimFusion yayınlanmamış (min Guo ve Hari Shroff) ama yukarıda bahsedilen yazılım paketi arşivinde mevcuttur.

StarryNite özel olarak oluşturulmuş bir komut satırı tabanlı sürümü serbestçe kullanılabilir MATLAB derleyici çalışma zamanı yüklü olduğunu gerektirir, ancak ticari MATLAB yazılımı için bir lisans gerektirmez. MATLAB derleyici çalışma zamanı yukarıda belirtilen yazılım paketi arşivinde bulunur. Bu protokolde kullanılan StarryNite için kod aslında Konfokal görüntüler6için kullanılan değişmeden. Ancak, starrynite işleme ve starrynite sonuçlarının işlenmesi için giriş görüntüleri yaratılmasında birkaç operasyonel konularda burada sitroshow içinde yöntemleri tarafından ele alınmıştır sürekli veri işleme boru hattı için erimiş izotropik dispım etkinleştirmek Birim. Bu değişiklikler, bu pre-ve post-processing adımları işleyen Sitam kodu tarafından otomatiktir. Sitlet Ayrıca, bölümlendirme algoritmasını otomatik olarak görüntülenmiş verilerdeki çekirdeklerin floresan yoğunluğuna ayarlamak için önceden optimize edilmiş Dispım özel şablonu StarryNite parametresini düzenler. Her Dispım veri kümesinde StarryNite tarafından kullanılan benzersiz parametreler sonra çıktı görüntü ve lineaging veri ile birlikte bir dosyaya kaydedilir.
16-bit görüntüler ile çalışır ve Java3D işleme ile uyumluluğu korur Asetree özel bir sürümü en iyi bu protokol için uygundur. Ayrıca yukarıda belirtilen yazılım paketi arşivinde yer almaktadır.

C. elegans , embriyo içindeki her hücrenin nörogelişim boyunca gözleneceği tek organizma olarak öne çıkmaktadır. Tüm Cell-Lineage bilinen ve sabit1ile, ve embriyolar tek hücrelerin etiketleme ve sürekli görüntüleme sağlayan yeni araçların geliştirilmesi ile, biyologlar şimdi nematod sinir gelişiminde farklı adımları inceleyerek başlayabilirsiniz tüm açıları-hücre Doğum sistemi; göç ve farklılaşma; nörit oluşumu, hedeflenen büyüme ve fasciculation; sinaps oluşumu; ve fonksiyonel devrelerin ayarlanması. C. elegans embryo 'da nöronal büyüme dinamiklerini yakalamak, belirgin olarak ifade edilen gazetecileri ve floresan mikroskobu ile birleştirerek bilimsel toplum için değerlidir.
C. elegans gelişimsel çalışmalar genellikle sağlam organizma1içinde tek hücreli düzeyde bağlamsal anlayış artırmak için bu türün sabit hücre-soy ve hücre kaderi haritaları kaldıraç. Auto-lineaging Analizi-starrynite2,3,4 ve acetree kullanarak5,6,7,8 yazılım-yüksek kontrast faydaları, yüksek çözünürlüklü Floresan çekirdekleri görüntüleri. Optimal çalışmak için, StarryNite/Asetree de geliştirme sırasında görüntülenmiş embriyo öngörülebilir kısıtlı oryantasyona bağlıdır. İki kapak arasında sıkıştırılmış C. elegans embriyoları ile yapılan Konfokal mikroskopi, yüksek kontrast/yüksek çözünürlük ve öngörülebilir kısıtlı bir güç sağlar, çünkü on yıldan fazla bir süredir standart otomatik lineaging mikroskopisi yöntemi olmuştur. embriyo7,8' in oryantasyonu. Daha önce C. elegans embriyogenez9,10 gibi canlı örnek görüntüleme için yeni bir ışık yapraklık tabanlı çift-görünüm ters seçici düzlem aydınlatma mikroskop (dispım) inşaat ve kullanımı nitelendirdi , 11 ' i , 12 tane , 13. ışık levha mikroskobu, genel olarak, düşük fototoksisite, yüksek hız ve canlı 3D numunelerin uzun vadeli görüntüleme sağlar14,15. Dispım yöntemi, özellikle, yaklaşık 330 nm9yaklaşık izotropik uzamsal çözünürlüğe sahip dört boyutlu (4D) görüntüler üretir.
Konfokal microkopi ile karşılaştırıldığında dispım daha yüksek sinyal-gürültü ve hız, daha izotropik uzamsal çözünürlük sunar ve uzun vadeli In vivo görüntüleme16için daha uygundur. Bu nedenle, Dispım verilerini StarryNite/AceTree içine giriş için uyarlamaya çalışmıştık ve bu da lineaging analizlerini artırıp geliştirmeyeceğini araştırdık. Büyük bir engel Dispım örneklerin kolayca yumurta kabuğu-sıkıştırma tarafından StarryNite/Asetree için beklenen Oryantasyonlar benimsemek için kısıtlı olamaz olmasıdır. Analiz edilen hacimde hücre pozisyonlarının rasgele oryantasyonu, otomatik lineaging analizinin doğruluğunu düşürür.
Bu nedenle, kullanıcıların Dispım görüntülerin ön işleme sırasında embriyolar hassas 3D yönünü seçmek için izin veren bir izleyici destekli Kullanıcı arayüzü, hem kalite-optimize edilmiş görüntü verileri sağlayan ve StarryNite giriş için bağlam-Aware Siteshow istihdam /Asetree. Görüntülenmiş embriyolar Kullanıcı seçimi üzerine, Sitor otomatik bir veri işleme boru hattını düzenler. Kırpılmış ve arka planda açılan embriyo görüntüleri her konum, zaman noktası ve görünüm için TIFF yığın dosyaları içinde kaydedilir. Sitat sonra yinelemeli olarak Co-kayıt ve ortaklaşa iki önceden işlenmiş görünümleri deconvolve için program spimfusion çağırır, Richardson-Lucy17,18 algoritmasını kullanarak Isotropic yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüleri verim. Dispım özgü parametreler kümesi için en iyi duruma getirilmiş starrynite görüntü Segmentation sırasında davranışını yönetmek ve çekirdek izleme izotropically erimiş görüntüler. Fused görüntüler ve lineaging sonuçları sonra asetat kullanarak düzenlenebilir, hangi kullanıcıların tanımlamak ve StarryNite tarafından oluşturulan otomatik Lineage izleme herhangi bir hata düzeltmek sağlar. Asetree aynı zamanda embriyo içinde izlenen çekirdeklerin Lineage-Tree ve 3D modellenmiş render sunabilir. Biz Auto-lineaging hız ve doğruluk belirgin izotropically erimiş görüntüleri kullanarak gelişmiş olduğunu bulmak, ya SPIM kameradan ham görüntülere kıyasla. Bizim protokol, burada açıklanan C. elegans uygulaması için optimize ederken, genellikle diğer türler veya örnekler Için üretilen dispım veri otomatik çizgiyle adapte edilebilir. Bu protokol kullanımı amaçlanan ise, lütfen unutmayın starrynite parametreleri ek ayarlama büyük olasılıkla yeni örnekler için gerekli olacaktır, açıklandığı gibi3,4.
4D-izotropik çözünürlüğe sahip görüntülerde bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması ve biyologlar hücre sırlarını izlemek için sağlar, aynı anda tanımlayan ve gelişmekte olan C. elegans embriyo nöronlar analiz ederken. Dahası, birkaç post-processing algoritmaları birleştirerek-bu en zaman alıcı olan donanım hızlandırma ile-şimdi hem ince hücre altı detayları ve hücre-lineages ve gerçek zamanlı olarak canlı embriyo hücre-kaderlerde analiz edebilirsiniz. Bu yeni protokol, diferansiyel ve morfojeninin in vivo probasyon çalışmaları sırasında hücre davranışlarını hassas, bilgili manipülasyon ve gözlem sağlar. Bu yazıda, C. elegans embriyoları geliştirmede lineaging ve hücre takibi için geliştirdiğimiz gelişmiş protokollerin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz, embriyo, gen ifadesi veya nörogelişim çalışmalarını geliştirmek.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steps 1-4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concavity slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1519006</td>
			<td>5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with 10&#215;&#8211;50&#215; zoom range</td>
			<td>Motic</td>
			<td>SMZ-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, no. 1.5, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose &#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7509-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary pipette aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, no. 18G x 1 &#189; (1.2mm x 40mm)</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared as described by Brenner (1974)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring for imaging chamber</td>
			<td>O-Rings West</td>
			<td>M1.5X40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Corning/Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095D5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire, 0.5-mm diameter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>267201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm)</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td>I2450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Eyelash Pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hart, A. C. Behavior. WormBook.&#160; (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm Pick</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steps 5-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm long-pass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LP02-488 RU-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561-nm notch filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>NF03-561E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLP02-561R-25, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software for bottom camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td></td>
			<td>ProgRes CapturePro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSIPM assembly video</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSPIM alignment video</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>https://youtu.be/qnOrg30NNuE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diSPIM imaging PC</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total,&#160;64&#160;GB memory, Windows 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF01-525/45-25, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FF555-DI03-25X36, quantity 2</td>
			<td>Semrock</td>
			<td></td>
			<td>555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging PC Graphics Card</td>
			<td>NVIDIDA</td>
			<td></td>
			<td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kumar et al diSPIM Setup</td>
			<td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td>
			<td></td>
			<td>Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 &#160;diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Manager</td>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table with isolators, 4 feet &#215; 6 feet &#215; 12 inches</td>
			<td>TMC</td>
			<td>784-651-02DR and 14-416-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steps 7-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis PC</td>
			<td>Intel</td>
			<td></td>
			<td>Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis PC Graphics Card</td>
			<td>NVIDIDA</td>
			<td></td>
			<td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation instructions</td>
			<td>Software bundle</td>
			<td></td>
			<td>http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software bundle</td>
			<td>Software bundle</td>
			<td></td>
			<td>http://dispimlineage.wormguides.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isotropic light-sheet microscopy and automated cell lineage analyses to catalogue caenorhabditis elegans embryogenesis with subcellular resolution

Halil özgül (C. elegans), tek hücre çözünürlüğü, in vivo ile, tüm sinir sisteminin hücresel kökenini anlamanın zorluk gözlemlenebilir tek organizma olarak öne çıkmaktadır. Burada, C. elegans embriyolarında nörogelişimin incelenmesi için entegre bir protokol sunuyoruz. Protokollerimiz, embriyolar gelişmekte olan tek hücrelerin görüntüleme, lineaging ve nöroanatomik izlemeyi birleştirir. Biz uzun vadeli elde, dört boyutlu (4D) canlı C. elegans embriyo ile neredeyse izotropik uzamsal çözünürlüğü ile çift görünümü ters seçici düzlem aydınlatma Microkopi (dispım) kullanımı ile. Nematod embriyolarında çekirdekler ve nöronal yapılar görüntülenmiş ve her üç boyutta ~ 330 nm çözünürlüğe sahip görüntüleri verim için izotropically erimiş. Bu dakikada dakika yüksek çözünürlüklü 4D veri setleri daha sonra, tek hücreli ve alt hücresel ayrıntı düzeylerinde gen ifadesi ve morfolojik dinamikler ile kesin hücre-satır kimlikleri ilişkilendirilmesi için analiz edilir. Protokollerimiz, açıklanan adımların her birinin modüler olarak uygulanmasını sağlamak ve embriyogenyon, gen ifadesi veya nörogelişim üzerinde çalışmalar geliştirmek için yapılandırılmıştır.

İlk olarak dispim edinme (bölümler 1-6) için protokolün parametrelerini kullanarak görüntülenmiş embriyolar canlılığı doğrulanmış. On embriyo aynı anda 20 °C, bir hacim/embryo/dakika, 2 hücreli aşamasından 2 kat aşamaya (7,5 saat, 451 hacimler/embriyo) olarak görüntülenmiş. Embriyogenesis boyunca hücre bölümlerini izlemek için, biz her yerde MCherry::histone Reporter yapıları entegre transgene dizi ujIs11324ifade gerginlik BV514, kullanılır. Şekil 6 , görüntülenmiş embriyolar için embriyonik gelişimin ilk yarısının bir zaman çizelgesini gösterir. Her görüntü, görüntülenmiş embriyonun tek görünümlü maksimum yoğunlukta projeksiyon (7-8 adımda üretilir) temsil eder. Biz optimize protokollerin embriyolar için herhangi bir algılanabilir fototoksisite neden vermedi bulundu, Hücre bölünmeleri zamanlaması (gösterilmez) tarafından değerlendirildiği gibi, hatching zaman, ve zamanlama gelişimsel kilometre taşları ile ilgili (Şekil 6 ve referanslar1 , 25 , 26).
Daha sonra embriyolar gelişmekte olan tek nöronların büyüme dinamiklerini analiz etmek için protokol uyguladıysanız. Biz ımaged DCR7692 (olaex4655), bir transgenik nematod gerinim bir alt kümesi içinde neuropeptid FLP-19 Organizatör kapalı Gfp ifade eder (DACR2819, PFLP-19 (3.6 KB):: Syn21:: Gfp:: caax::p 10 3 ' UTR) . Burada özetlenen protokolün adımlarını izleyerek, tanımlanamayan hücrelerin, RMDDL ve RMDDR motor nöronlarına, boşaltım kanal hücresine ve iki kas hücresine karşılık geldiğini tespit ettik (Şekil 7). Daha sonra, RMDDL ve RMDDR nöronların büyüme dinamiklerini inceledi ve değerlendirdik. Biz RMDDL ve RMDDR nöronların oblikik olarak erken 360 dakika gübreleme sonrası olarak şekillendirilir gözlenen, daha uzun hücresel eksen nörit büyüme için sonraki ekseni temsil eden (Şekil 7 ve film S1). "Basit nörit izleme" FIJI eklentisi kullanarak ve izotropically erimiş hacimlerin 3D reinşaatları uygulayarak, daha sonra altı embriyo için RMDDL ve RMDDR nöronların stereotifik büyüme nicelik. Biz büyüme dinamikleri RMDDL ve RMDDR embriyolar (burada RMDDs denilen) boyunca stereotipleşti olduğunu tespit etti. İtibaren 385-410 dakika gübreleme sonrası, RMDDs nöronlar Extended 6,0 ± 0.5 μm (ortalama ± SEM; n = 12 nörit) hücre gövdelerin anterior (şekil 7b, C, ı). İtibaren 415-445 dakika döllenme sonrası, her iki nörosit içine ve varsayımsal sinir halkası etrafında dorsal uzatmak ( Şekil 7dyıldız). Ortalama olarak, her RMDD neurite genişletilmiş 11,0 ± 0,6 μm (ortalama ± SEM; n = 12 nörit) hücre gövdesinde, eşzamanlı olarak halka zirvesindeki kontralateral meslektaşı (Şekil 7i) ile buluşmadan önce. Daha da önemlisi, temsili sonuçlarımız, entegre protokollerimizi (Şekil 7 ve Şekil 8) kullanarak tek tanımlanabilir hücreler için nöronal gelişimsel özellikleri inceleyebilmemizi, karşılaştırabilmemizi ve ölçmemizi mümkün olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig1.jpg"> Şekil 1: diSPIM örnek montaj kurulumu. (A) Poly-L-Lysine ile lamel magazini hazırlanması. İnset içinde, 10 μL Poly-l lizin 5 dakika için lamel magazini ceket için kullanıldı. Poly-L-lizin, embriyo yumurta kabuğu dikdörtgen içinde lamel magazini sıkıca sopa sağlar. (B) çelik görüntüleme odasının ve montajlı odanın şematiği. Inset, temsili embriyolar ön-posterior eksen coverslip üzerinde uzun eksen dik ile yönlendirilmiş. (C) mikrokapiller pipet ile monte edilen aspiratör tüpü. (D) dispim 40X hedefleri altında örnek tutucuya monte edilmiş çelik görüntüleme odası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig2.jpg"> Şekil 2: mikro yöneticisinde uzun süreli diSPIM görüntüleme kurulumu. (A) fotootoksisite azaltarak ( C. elegans embriyoları yüksek hatching oranı ile değerlendirilir) uzun süreli görüntüleme için optimize dispim lazer güç parametreleri (kırmızı dikdörtgen) önerilir. 561 nm lazerle 79 μW (0,25) ve 488 nm lazer ile 179 μW (0,5) arasında ayarlayın. Yazılım ayarlarının lazer gücüne tam olarak kalibre edilmesi diSPIM kurulumları arasında değişir. 79 μW (561 Nm) ve 179 μW (488 Nm) lazer gücü elde etmek için kullanıcıların lazer gücünü ölçmeye ve kalibre etmesi önerilir. (B) veri kaydetme (yeşil dikdörtgen), ses ayarları (mavi kare) ve dilim ayarları (turuncu kare) için dispim parametreleri. (C) c. elegans embriyogenez 'in uzun süreli görüntülenmesi için dispim otofokus parametreleri (bkz. adımlar 6.1-6.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig3.jpg"> Şekil 3: Sitshow kullanarak görüntü görselleştirme ve veri işleme Kurulumu. (A) Sitat tarafından açılan RAW dispim görüntüleri. Sitshow her iki kamera yolu (SPıM A ve B) tarafından yakalanan görüntüleri açmak mümkün. Bu ham görüntüler Dispım monitörüolarak adlandırılan çok boyutlu pencerelerin açılır. Dispim monitörde, bir "Bowtie desen" embriyo ön, posterior, dorsal ve ventral kenarları seçmek için oluşturulur (bkz. Adım 9,1). Bow-tie seçimleri deconvolution ve StarryNite destekli lineaging izleme için embriyo yönünü gösterir. (B) izotropik görüntüler oluşturmak için kullanılan optimum parametreler. İçinde Deconvolved alırken Window, adımları 9.5.1-9.5.8 belirtilen parametreleri ayarlayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig4.jpg"> Şekil 4: Dispım kamera yapılandırması. (A) dispim kamera yerleşimlerinin ve oryantasyonların fotoğrafı. (B) SPIM A 'nın + 90 derece rotasyonlarının, toplanan spim B görüntülerine uyacak şekilde tasvir edilmesi. (C) dispım 'ın kamera yapılandırmasına dayalı olarak (bkz. Adım 9.5.2) oryantasyon indeksi + 1 ' e göre birimler girin. Biz spim B görüntü (ler) eşleştirmek için kayıt önce Y ekseni etrafında bir görüntü (ler) + 90 derece döndürmek. Ölçek çubukları = 10 μm. görüntüler temsili tek-görünüm, maksimum yoğunluklu projeksiyonlar ve deconvolution görüntüler 1,5-fold embriyo etiketli çekirdekler (561-Nm, kırmızı) ve nöronlar (488-Nm, yeşil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig5.jpg"> Şekil 5: Asetree 'de kürasyon ve düzenleme C. elegans embriyonik soy. (A) biz starrynite 's Lineage izleri düzenlemek için asetree kullanın (referanslar bakın5,6,8; el yazmaları da indirme paketi dahil). AceTree adımları tamamlanması üzerine her çekirdeği (yeşil dikdörtgen) için C. elegans sistematik adlar gösterecektir 10.1-10.2. Bu pencere (A) Lineage izlemedeki her hücre (mavi renkte vurgulanan ABA) hakkında bilgi (siyah dikdörtgen) sağlar ve lineage izlerinin izlenmesi ve düzenlenmesi sırasında kullanıcılara rehberlik eder. Kullanıcıların doğrulamak ve lineaged hücreleri ve konumlarını karşılaştırmak tavsiye edilir C. elegans embriyonik hücre sırık daha önce Sulston ve al.1 tarafından bildirilen Ayrıca, kullanıcılar belirli hücreleri bulma ilgileniyorsanız deconvolved veri serisi (aşağıya bakınız, B) arama çubuğuna C. elegans sistematik adını girin (turuncu dikdörtgen). (B) kullanıcının deconvolved veri serisi de 10.1-10.2 adımları tamamlandıktan sonra otomatik olarak açılır. Burada gösterilen bir izotropically çekirdekten kırmızı etiketli bir dört hücreli aşama embriyo görüntü erimiş. Bir çekirdekler izleme sırasında, kullanıcılar görüntünün yoğunluğunu değiştirmek gerekir (kırmızı kare) ve zaman ve z kendi klavyede ok tuşlarını kullanarak gezinmek (zaman-sol/sağ, z-yukarı/aşağı). (C) döndürülebilir 3D görselleştirme sağlayan belirli işlevleri (mor dikdörtgen) (B) timepoint 3D karikatür. Asetree ve 3D işlevselliğine genel bir bakış için bkz: Referanslar5,6,8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig6.jpg"> Şekil 6: diSPIM üzerinde C. elegans embriyoları zaman zaman gelişimsel dinamikleri. Üst panel, diSPIM görüntüler embriyonik gelişim ilk yarısında gösteren bir görüntülenmiş embriyo (strain BV514 ujIs11324). Embriyo, her dakika 7,5 saat (20 °C ' de) sürekli olarak görüntülenmiş. Üst panelin ilk iki görüntüsü, 4-ve 8 hücreli embriyoları çekirdeklerle (kırmızı) ve kutup organları (yoğun kırmızı küreler, mavi yıldız ile işaretlenmiş) pozisyonları ile temsil eder. Her görüntü, görüntülenmiş embriyonun tek görünümlü maksimum yoğunlukta projeksiyon temsil eder. Ölçek çubukları = 10 μm. Zaman çizelgesi (yatay çubuk), C. elegans embriyoları gelişiminin dakika sonrası FERTİLİZASYONU (m.p.f.) temsil eder. Biz diSPIM satın alma için protokolünün parametreleri görüntü embriyolar için herhangi bir algılanabilir fototoksisite teşvik etmedi doğrulanmıştır olarak viability, Hücre bölünmeleri zamanlaması, tarama ve gelişimsel kilometre taşları zamanlaması zamanlaması (referanslar bakın 1 , 25 , 26). biz gelişimsel kilometre taşları zamanlaması bizim görüntüleme parametreleri ile embriyolar arasında tekrarlanabilir olduğunu unutmayın (SEM ± 8,174 dakika 6,4 saat uzun görüntüleme oturumları için; n = 10). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig6large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig7_v2.jpg"> Şekil 7 ' ye. C. elegans embriyoları gelişmekte olan nörit büyüme dinamiklerinin hücresel kimlik ve tek hücreli karakterizasyonu. BV514 ujIs11324 (lineaging için) ve DCR7692 (olaex4655), bir transgenik nematod gerinim geçiş tarafından yapılan bir gerinim çift renkli görüntüleme nörofobi FLP-19 Organizatör kimliği belirsiz hücrelerin bir alt altında Gfp ifade eder. (A-H) Burada özetlenen protokolün adımlarını izleyerek, tanımlanamayan hücrelerin motor nöronlarına RMDDL ve RMDDR (sarı oklar), boşaltım kanalı hücresine (mavi oklar) ve iki kas hücresi (beyaz oklar) karşılık geldiğini tespit ettik. (I) FIJI eklentisi kullanarak rmddl ve RMDDR nöronların büyüme dinamiklerinin miktarını "basit nörit izleme" ve izotropik erimiş hacimlerin 3D reinşaatları için uygulama. Hem RMDDL hem de RMDDR 'nin stereotifik büyüme dinamiklerini nasıl göstermesini unutmayın, her biri toplam uzunluğu 11.0 ± 0.6 μm (ortalama ± SEM; n = 12 nörosit) ve sinir halkası dorsal Apex toplantı (Ayrıca bkz: film S1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig7large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig8.jpg"> Şekil 8: C. elegans embriyolarında nöronal morfolojilerin Izotropik dispim görüntülerinin incelenmesi. AVHL ve AVHR nöronların izotropik görselleştirme (sarı oklar). Dispım kullanarak, nöronal morfolojiler yaklaşık 330 nm izotropik uzamsal çözünürlüğe sahip dört boyutlu (4D) görüntüler elde yakalanabilir. Dispım kullanıcıların neredeyse tüm yönde aynı çözünürlüğe sahip görüntü birimleri döndürmek sağlar. A-D içindeki görüntüler, embriyonun uzun ekseninin çevresindeki farklı rotasyonların aynı Izotropik olarak erimiş dispım görüntü hacminin maksimum yoğunluklu projeksiyonlarına sahiptir. Ölçek çubukları = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın</a> .
Ek film S1: C. elegans embriyo 280 dan 434 dakika içinde fertilizasyon sonrası gelişmekte. Gerilme DCR7692 izotropik film (olaex4655) DACR2819 seyrek RMDD nöronlar etiketleme ile ujIs113 ubiquitously ifade (şekil 7a-D, sarı oklar). DACR2819 Ayrıca iki kas hücresi (şekil 7a-d, beyaz oklar) ve atılım kanal hücresi (şekil 7a-d, mavi ok) embriyonik gelişim sırasında Etiketler (şekil 7a-d). Ölçek çubukları = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/Movie_S1.mov">bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution at JoVE.com

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Bu protokol canlı embriyolarda hücre soylarının ve kimliklerinin etkin bir şekilde izlenmesini sağlarken, c.elegans nöronlarının geliştirilmesinde aksonlar ve dendritler gibi ayrıntılı hücre morfolojilerini de analiz eder. Konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, çift görüşlü ters selektif düzlem aydınlatma mikroskopisi veya diSPIM gürültüye daha yüksek sinyal, daha izotropik uzamsal çözünürlük sunar ve vivo görüntülemede uzun süreli için daha uygundur. Bir içbükey mikroskop slayt depresyon içine% 1 metilselüloz çözeltisi 500 mikrolitre ekleyerek başlayın.Platin tel pick kullanarak, m9 metilselüloz çözeltisi içine bir nematod büyüme orta plaka yetişkin transfer. En az bir ila dört hücreli embriyolar için orta vücutta her hayvan enine dilim için 18 gauge hipodermik iğneler keskinleştirilmiş ipuçlarını kullanın. Dişler in arasında hafifçe tutulan bir aspiratör ağızlık ile, 10 ila 15 mikrolitre M9 tamponu ile mikrokapiller bir pipet ön doldurun ve yavaşça kapiller içine slayt birkaç embriyo aspire.Embriyoları taze M9 tamponu yla dolu çelik bir görüntüleme odasının kapağının merkezi dikdörtgenine dağıtın. Embriyoları dikey olarak, her embriyonun uzun ekseninin örtünün uzun eksenine dik olması için yavaşça yönlendirin. Daha sonra çelik görüntüleme odasını bir diSPIM sahnesine numune tutucuya yerleştirin.Embriyoları görüntülemeye hazırlamak için, mikro yöneticisi açın ve lazer yoğunluklarını 488 nanometre için %0,5 eşdeğerliğe ve 561 nanometre için %0,25 eşdeğerliğe ayarlayın. Belirli mikrowatt'ların kapsamını belirlemek için yazılım ayarı ve gerçek lazer çıkışı arasındaki kalibrasyon önceden yapılmalıdır. Eklentiler menüsünde, uygulanan bilimsel görüntüleme çift görünümlü ters selektif düzlem aydınlatma mikroskopisi penceresini açmak için cihaz kontrolü ve uygulamalı bilimsel görüntüleme diSPIM'i seçin.Edinme sekmesialtında, parametrelerin belirtildiği gibi ayarlı olduğunu onaylayın. Otomatik netleme sekmesinin altında, parametreleri belirtildiği gibi ayarlayın. Otofokus kanalının planlanan hatlama deneyleri için nükleer floresan kanalını belirtmesi gerektiğini unutmayın.A veya B yolu için ışın ve sayfa kutularını kontrol edin ve görüntü edinimi başlatmak için canlı'yı tıklatın. Canlı bir görünüm penceresi açılır. Sonra embriyo otofokus analiz bölgesiseçmek için ilgi embriyo etrafında bir kutu çizmek ve uzun vadeli çok boyutlu görüntü yakalama başlatmak için satın alma başlat'ı tıklatın.Görüntü görüntüleme, işleme ve hücre soy analizi için, yazılım paketini indirip çıkardıktan sonra CytoSHOW'u çalıştırmaya başlamak için CytoSHOW_app. jnlp dosyasına çift tıklayın. Dosya menüsünün altında, ham mikro yönetici görüntülerinin kaydedildiği kök veri seti klasörünü bulmak için yeni ve diSPIM monitör mikro yöneticisini seçin.Herhangi bir zaman noktası klasörünü seçin ve aç'ı tıklatın. Çok boyutlu navigasyon pencereleri hem SPIM A hem de SPIM B için otomatik olarak açılacaktır.Çokgen seçim aracını kullanarak, hem SPIM A hem de SPIM B görünümlerinde embriyo üzerinde papyon deseni oluşturmak için anterior, posterior, dorsal ve ventral kenarlarının hemen dışına tıklayın ve diSPIM'e tıklayın. Her SPIM kolu için yeşil ve kırmızı kanalları hizalayın ve diSPIM'i yeniden tıklatın.Vardiyalar diğer tüm konum pencerelerinde tetiklenir. Ardından, deconvolved sigorta diSPIM ham veri hacimleri iletişim kutusunu açmak ve parametreleri belirtildiği gibi ayarlamak için diSPIM ve sigorta yı tıklatın. Tüm parametreler ayarlandığında, Evet'i tıklatın ve Tamam'ı tıklatmadan önce işlenen dosyaları kaydetmek için çıktı dizinini belirtin. Önizleme penceresinde, t kaydırma çubuğunu pencerenin ikinci noktasına taşıyın ve z kaydırıcısını doğrudan embriyonun uzun ekseni boyunca görünüm gösterilene kadar hareket ettirin.T-scroll çubuğunu önizleme penceresindeki bir zaman noktasına geri taşıyın ve AB hücre metafaz plakalarının düzleminden ventral en yuvarlak çekirdeğinden bir çizgi çizmek için hat seçim aracını kullanın. İnce ayarlamaları önizleme hacminin yönü yle kaydetmek için diSPIM önizleme düğmesini tıklatın. diSPIM monitör pencerelerinin t kaydırma çubuklarını, işlenecek görüntülerin tam açıklığı olan başlangıç ve bitiş zaman noktalarına ayarlayın.Ardından Tamam'ı tıklatın. Verimli ve doğru bir hücre soy analizi için Starry Night işlemeden önce veri hacimlerinin kesin bir ADL yönünü elde etmek çok önemlidir. AceTree Starry Night soy izleme serisi açmak için, sağlanan özelleştirilmiş AceTree dosyasını açın ve daha önce belirtilen çıkış dizini bulmak için dosyayı açık seçin. İlgi çeken embriyo için sigorta alt klasörünü açın ve düzenlenen dosyayı seçin.Daha sonra aç'ı tıklatın ve daha önce açıklandığı gibi soy görselleştirme ve düzenleme ile devam edin. Optimize edilmiş protokoller, kuluçka zamanı ve gelişimsel kilometre taşlarına ilişkin zamanlama ya da kuluçka zamanına göre değerlendirildiği gibi embriyolara saptanabilir fototoksisite yapmaz. Bu protokolün gösterildiği gibi, nematod türünü ifade eden bu transgenik yeşil floresan proteindeki tanımlanamayan hücrelerin motor nöronlara, boşaltım kanalı hücresine ve iki kas hücresine karşılık olduğu belirlenmiştir.Tanımlanan nöronlar oblik olarak erken şekilli edildi 360 dakika sonra döllenme uzun hücresel eksen ile nötrit büyüme için sonraki ekseni temsil eden. 385 ila 410 dakika sonra döllenme, RMDD nöritler hücre gövdelerinin yaklaşık altı mikrometre ön genişletti. 415 ila 445 dakika sonra döllenme, her iki nöritler içine ve varsayımsal sinir halkası etrafında dorsally uzattı.Ortalama olarak, her RMDD neurite senkronize halkanın tepede kontralateral meslektaşı toplantı önce hücre vücudundan yaklaşık 11 mikrometre uzatıldı. Birlikte ele alındığında, bu veriler, tek tanımlanabilir hücreler için nöronal gelişimsel özelliklerin bu entegre protokol kullanılarak incelenebildiğini, karşılaştırılabildiğini ve ölçülebildiğini göstermektedir. Her embriyonun uzun ekseninin örtünün uzun eksenine dik olması için embriyoları dikey olarak yönlendirmeyi unutmamak önemlidir.Bu protokolü kullanarak, yeni doğan embriyonik sinir sistemini her açıdan keşfetmeye başladık. Örneğin, hücre doğumu sırasında, göç ve farklılaşma, nötrit oluşumu, büyüme ve fasikülasyon.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

Hücre Lineage belirteçlerinin Eş-lokalizasyonu ve Domates Sinyali

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Yüksek Çözünürlüklü Episkopik Mikroskopi (HREM) - Organik Malzemelerin İşlenmesi ve Görselleştirilmesi için Basit ve Sağlam Protokoller

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...