Name: in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices
Uploaded: 2019-09-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices at JoVE.com

Vi takker Bertrand Mathon, mérie Nassar, Li-Wen Huang, og Jean simonnet for deres hjælp i udviklingen af tidligere versioner af stereotaksisk Injection Protocol og Marin manuel og Patrice Jegouzo for teknisk hjælp. Dette arbejde blev støttet af det franske ministerium for uddannelse og forskning (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) og Agence Nationale de la Recherche Grant <span lang="FR" style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).

Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med det europæiske rådsdirektiv (2010/63/EU) og godkendt af den etiske komité i Paris Descartes Universitet. Eksperimentatoren skal indhente tilladelse til proceduren for at overholde lokale regler.
1. planlægning af eksperimentet
<ol><li>Definer det hjerne område, der skal målrettes. Bestem de stereotaxiske koordinater på injektionsstedet ved hjælp af en musehjerne Atlas15. For den rigtige Antero-dorsale tha...

<ol>
	<li>Goodridge, J. P., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+postsubiculum+and+anterior+thalamus+in+the+generation+of+head+direction+cell+activity.">Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).</li><li>Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+navigation.+Disruption+of+the+head+direction+cell+network+impairs+the+parahippocampal+grid+cell+signal.">Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal.</a> Science. 347 (6224), 870-874 (2015).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+decrease+of+excitability+in+rat+hippocampal+neurons+through+increases+in+I(h).">Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h).</a> Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).</li><li>Takahashi, H., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+Interactions+and+Synaptic+Plasticity+in+the+Dendritic+Tuft+Regions+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).</li><li>Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleus+reuniens+and+entorhinal+cortex+projections+in+hippocampal+field+CA1+of+the+rat.">Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).</li><li>Callaway, E. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulating+neurons+with+light.">Stimulating neurons with light.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).</li><li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).</li><li>Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+neuronal+circuits+underlying+the+interaction+between+sensory+and+motor+cortex.">Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex.</a> Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).</li><li>Simonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+feedback+inhibition+may+maintain+head+direction+signals+in+mouse+presubiculum.">Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum.</a> Nature Communications. 8, 16032 (2017).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+Thalamic+Excitation+and+Feedforward+Inhibition+of+Presubicular+Neurons+Projecting+to+Medial+Entorhinal+Cortex.">Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).</li><li>Fricker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cells+of+rodent+presubiculum+express+a+tetrodotoxin-insensitive+Na++current.">Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current.</a> The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).</li><li>Simonnet, J., Eug&#232;ne, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+neuroanatomy+of+rat+presubiculum.">Cellular neuroanatomy of rat presubiculum.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).</li><li>Simonnet, J., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+components+and+circuitry+of+the+presubiculum+and+its+functional+role+in+the+head+direction+system.">Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system.</a> Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Huang, L. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+Localization+and+Projection-Specific+Properties+of+Presubicular+Neurons+Targeting+the+Lateral+Mammillary+Nucleus,+Thalamus,+or+Medial+Entorhinal+Cortex.">Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex.</a> eNeuro. 4 (2), (2017).</li><li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons.">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li><li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+Projections+from+the+Medial+Septum+Selectively+Inhibit+Interneurons+in+the+Medial+Entorhinal+Cortex.">GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hass, C. A., Glickfeld, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+optical+excitation+of+cortico-cortical+projections+at+physiological+frequencies.">High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).</li></ol>

In vivo viral injektion til at udtrykke lysfølsomme opsynder i et defineret hjerne område er en valgmetode til optogenetiske analyse af langtrækkende funktionelle tilslutningsmuligheder10,11,17,18. Stereotaxiske injektioner giver mulighed for præcist at målrette et bestemt område af hjernen. Coexpression af en opsin med en fluorescerende reporter bekvemt gør det muligt at evaluere den ve...

Det er nødvendigt at definere konnektivitet mellem hjerneregioner for at forstå neurale kredsløb. Klassiske anatomiske sporingsmetoder gør det muligt at etablere interregionale tilslutningsmuligheder, og læsions undersøgelser er med til at forstå den hierarkiske organisering af informationsstrømmen. For eksempel, hjerne kredsløb for rumlig orientering og hovedretning signalering involverer den retningsbestemte strøm af oplysninger fra thalamus til formodbiculum. Dette er blevet påvist ved læsions studier af Antero-dorsale thalamic kerner (ADN), der nedbryder hovedretningen signal i nedstrøms dorsale formodbiculum, samt parahippocampale gittercelle signal1,2.
Den funktionelle konnektivitet mellem hjerneområder er vanskeligere at etablere på et cellulært og subcellulært niveau. I hippocampus, en meget organiseret anatomi gør det muligt at undersøge pathway-specifikke synaptiske forbindelser ved hjælp af elektrisk simulering i Skive forberedelse. Stimulerings elektroder placeret i Stratum radiatum af Carnot kan bruges til specifikt at stimulere Schaffer-sikkerhedsstillelse fra3. Stimulering af elektroder placeret i Stratum lacunosum moleulare af Carnot vil aktivere stien Path-indgangen til4,5. Elektrisk stimulation aktiverer neurotransmitter frigivelse fra Axon terminaler; men det aktiverer neuroner med somata nær stimulerings stedet samt axoner passage. Det er derfor af begrænset brug for at studere afferenter fra definerede hjerneområder, når fibre af forskellige regioner i oprindelse blander sig i målstrukturen, som det typisk er tilfældet i neocortex.
Neuroner kan også stimuleres med lys. Optiske metoder omfatter fotoaktivering af bur glutamat, som kan kombineres med en-eller to-foton Laserscanning. Flere tæt fordelt steder kan stimuleres sekventielt, uden mekaniske skader på vævet6. Dette er blevet brugt med succes til at kort synaptisk receptorer samt aktivere individuelle neuroner7. Mens glutamat-uncaging kan bruges til lokal kredsløbsanalyse, giver det ikke mulighed for specifik aktivering af langtrækkende indgange.
En metode til valg til undersøgelse af langtrækkende konnektivitet i neuronal kredsløb er brugen af virus-medieret channelrhodopsin udtryk. Brug in vivo stereotaxiske injektioner som beskrevet her, kan ekspression af lys-gated ion kanaler målrettes og rumligt begrænses til en ønsket hjerneregion. På denne måde, channelrhodopsins er effektive til kortlægning excitatoriske eller hæmmende tilslutningsmuligheder fra en region til sit mål. Transfected axoner terminaler kan stimuleres med lys i en hjerne skive forberedelse, og patch-klemme optagelser som en læse-out tillade undersøgelse af de funktioner og styrker af specifikke kredsløb komponenter i hjernen8. Den optogenetiske tilgang kombineret med stereotaxisk injektion af en virus giver enestående specificitet og genetisk kontrol9. Stimulering med lys giver desuden mulighed for både høj tidsmæssig og rumlig præcision10,11.
Den formodbiculum er en seks-lags kortikale struktur ved overgangen af hippocampus og para-hippocampale dannelse12,13. Det modtager vigtige synaptiske input fra ADN11 , men også fra flere andre kortikale og subkortikale regioner14. Således er selektiv stimulering af thalamic axoner terminaler inden for en formodnings skive ikke mulig med elektrisk stimulation eller glutamat-ondning. Beskrevet i denne protokol er metoder til at bestemme funktionelle forbindelser mellem hjernen regioner (ADN og formodbiculum) ved hjælp af præcise stereotaksisk injektioner af virale vektorer udtrykker lys-gated kanaler. Også beskrevet er foto stimulation af axoner terminaler af projicerende neuroner i deres målregion, kombineret med hele cellen patch-clamp optagelser af post-Synaptic neuroner i hjernen skive forberedelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:927px;" width="927">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.5 mm bur&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">724962</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10 &#181;L Hamilton syringe</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">1701 RN - 7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10X PBS solution</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">AM9624</td>
			<td>&#160;text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">36% PFA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">470 nm LED&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">P1105/470/LED&#160; DC/59022m</td>
			<td style="width:365px;">use with matched excitation filter 470/40x&#160; and emission filter for GFP&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-5-PV3446</td>
			<td>lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">All chemicals</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Bath temperature controler</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM7</td>
			<td>Set at 34&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">beveled metal needle</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">7803-05</td>
			<td>33 gauge, 13mm, point style 4-20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Big scissors</td>
			<td style="width:183px;">Dahle Allround</td>
			<td style="width:136px;">50038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Biocytin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B4261</td>
			<td>final 1-3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:183px;">Havard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">GC150-10</td>
			<td>1.5 mm outer, 0.86 inner diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Brown Flaming electrode puller</td>
			<td style="width:183px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;">P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BupH Phosphate Buffered Saline pack</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">butterfly needle for perfusion</td>
			<td style="width:183px;">Braun&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Venofix A</td>
			<td>24G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:183px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:136px;">DL-604M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;">LSM710</td>
			<td>20X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">curved forceps</td>
			<td style="width:183px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:136px;">11011-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">CY5 configuration (confocal)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">CY5 configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">DAPI configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digital handheld optical meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:136px;">PM100D</td>
			<td>Parametered on 475 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Double egde stainless steel razor blades</td>
			<td style="width:183px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:136px;">72000</td>
			<td>Use half of the blade in the slicer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dual Fluorescent Protein Flashlight</td>
			<td style="width:183px;">Nightsea</td>
			<td style="width:136px;">DFP-1</td>
			<td style="width:365px;">excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">EGTA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E4368</td>
			<td>final 0,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:136px;">Eclipse TE-2000E</td>
			<td>10 or 20X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Filter paper</td>
			<td style="width:183px;">Whatman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fluoro-Ruby 10%</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:136px;">AG335</td>
			<td>disolve 10 mg in 100 &#181;l of distilled water ; inject 150 to 300 nl</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">GFP configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heatingplate</td>
			<td style="width:183px;">Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">HP4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heparin choay 5000 U.I./ml</td>
			<td style="width:183px;">Sanofi</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>5 ml vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">H3375</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:183px;">Foredom</td>
			<td style="width:136px;">K.1070</td>
			<td>maximum drill speed 38,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Internal solution compounds :</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isolated Pulse Stimulator</td>
			<td style="width:183px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:136px;">2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P4504</td>
			<td>final 1,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketamine 1000</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketofen 10%</td>
			<td style="width:183px;">Merial</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>100 mg/ml : dilute 1 &#181;l in 1ml total (0,1%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laocaine (lidocaine)</td>
			<td style="width:183px;">MSD</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LED hi power spot for surgery</td>
			<td>Photonic (via Phymep)</td>
			<td style="width:136px;">10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">LED Power Supply</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">OptoLED Light Source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Manipulators</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mg-ATP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9187</td>
			<td>final 4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MgCl2</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">63069</td>
			<td>final 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Micro temperature controler</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">MTC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Milk powder</td>
			<td style="width:183px;">Carnation</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na Phosphocreatine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P7936</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na3-GTP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G9002</td>
			<td>final 0.4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">needle holder/hemostat</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">13005-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">pClamp acquisition software</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">Minipuls 3</td>
			<td>14-16 on the display for 2-3 ml/min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium gluconate (K-gluconate)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G4500</td>
			<td>Final 135 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">ProLong Gold antifade mounting medium</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P36390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Rompun 2% (xylazine)</td>
			<td style="width:183px;">Bayer</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">small scissors</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride 0.9%&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>dilute 8.5 mL in 10 ml total</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope VISISCOPE SZT</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">630-1584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereotaxic frame with digital display</td>
			<td style="width:183px;">Kopf</td>
			<td style="width:136px;">Model 940</td>
			<td>Small animal stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy3 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:136px;">434315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy5 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">S32357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Superglue3 Loctite</td>
			<td style="width:183px;">Dutscher</td>
			<td style="width:136px;">999227</td>
			<td>1g tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid</td>
			<td style="width:183px;">Ethicon</td>
			<td style="width:136px;">F3210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:183px;">kdScientific</td>
			<td>Legato 130 - 788130</td>
			<td>Use Infuse and Withdraw modes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">VT1200S</td>
			<td>speed 0.07, amplitude 1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">tubing</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F117942, F117946</td>
			<td>Yellow/Black, Purple/Black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">upright microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Versi-dry bench absorbant paper</td>
			<td style="width:183px;">Nalgene</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices

Viden om celle-typespecifikke synaptiske tilslutningsmuligheder er en afgørende forudsætning for at forstå hjernen-dækkende neuronal kredsløb. Den funktionelle undersøgelse af langtrækkende forbindelser kræver målrettede optagelser af enkelt neuroner kombineret med den specifikke stimulering af identificerede fjerne indgange. Dette er ofte vanskeligt at opnå med konventionel og elektrisk stimulation teknikker, fordi axoner fra konvergerende opstrøms hjerneområder kan blande sig i målregionen. Den stereotaxiske målretning af en specifik hjerneregion for virus medieret ekspression af lysfølsomme Ionkanaler muliggør selektiv stimulering af axoner, der kommer fra denne region med lys. Intracerebral stereotaxiske injektioner kan anvendes i veldefinerede strukturer, såsom den forreste thalamic kerner, foruden andre subkortikale eller kortikale områder i hele hjernen.
Beskrevet her er et sæt af teknikker til præcis stereotaxisk injektion af virale vektorer udtrykker channelrhodopsin i muse hjernen, efterfulgt af foto stimulation af Axon terminaler i hjernen skive forberedelse. Disse protokoller er enkle og almindeligt anvendelige. I kombination med hel-celle patch clamp optagelse fra en postsynaptisk forbundet Neuron, foto stimulation af axoner tillader påvisning af funktionelle synaptiske forbindelser, farmakologisk karakterisering, og evaluering af deres styrke. Desuden kan biocytinel fyldning af den indspillede neuron anvendes til post-hoc morfologiske identifikation af den postsynaptiske neuron.

Den procedure, der præsenteres her, blev brugt til at udtrykke en blå lys-følsom channelrhodopsin (Chronos) smeltet til gfp i Antero-dorsal kernen af thalamus (ADN), ved stereotaxisk injektion af anterograd adeno-associeret virus. De stereotype koordinater blev bestemt i henhold til et muse-hjerne Atlas og afprøvet ved injektion af 200 nL fluorescerende Tracer fluoro-Ruby. Dyret blev ofret 10 min efter injektionen, og hjernen blev ekstraheret og fikseret natten over. Coronal Brain sektioner var parat til at undersøg...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices at JoVE.com

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Denne protokol beskriver et sæt af metoder til at identificere celle typen specifik funktionel konnektivitet af langtrækkende input fra fjerntliggende hjerneområder ved hjælp af optogenetiske stimuleringer i ex vivo hjerne skiver.

In vivo intracerebral Stereotaxiske injektioner til Optogenetisk stimulering af langtrækkende indgange i musehjerne skiver

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Formålet med denne metode er at identificere den funktionelle tilslutning af langtrækkende input fra fjerne hjerneregioner ved hjælp af fotostimulation i hjerneskiver. Den stereotaxiske målretning af en bestemt hjerneregion for forskellige medierede udtryk for lysfølsomme ionkanaler giver mulighed for selektiv stimulering af axoner, der kommer fra denne region med lys. Demonstration af proceduren vil være Louis Richevaux, en ph.d.-studerende fra min gruppe.Før operationen, kontrollere, at dyret er godt bedøvet med en tå knivspids. Træk forsigtigt tungen ud for at lette vejrtrækningen. Barber derefter kraniehåret.Injicer 20 mikroliter lidocainhydrorid under hovedets hud til lokalbedøvelse og vent fem minutter. At afsløre kraniet, lave et snit på hovedbunden. Derefter placere dyret i en stereotaxic ramme.Sæt ørestængerne og hvile dem på knoglerne lidt rostral til ørerne og træk ned huden for at skabe god adgang til kraniet. Stram ørestængerne og monter næsestykket. Vedligehold dyrets krop vandret og på hovedets niveau ved hjælp af en højdejusteret støtte.Placer en varmepude under dyret for at holde det på fysiologisk temperatur. Rengør derefter kraniet ved at anvende 0,9% natriumchlorid med en vatpind for at fjerne blødt væv. Juster kraniet, så bregma lambda adgang er jævnet med nivelleret.Derefter skal du finde injektionsstedet på kraniet i henhold til de bageste og mediale koordinater og placere injektionsnålen over den. Marker kraniet med en engangsnål. Flyt derefter injektionsnålen opad med fire centimeter.Ved hjælp af en 0,5 millimeter grat, skabe en en millimeter diameter kraniotomi på mærket på den ene halvdel af den maksimale hastighed. Podning med et væv, hvis der opstår blødning. Dernæst tømme vandet i Hamilton sprøjten til opbevaring ved helt at skubbe det med en pumpe.Kun nålen er fyldt med vand. Optø den virale opløsning, der skal injiceres på is, derefter kort fjerne det fra isen og få 700 nanoliters af opløsningen med en mikropipette. Dernæst deponere en dråbe på et stykke paraffin film.Placer paraffinfilmen oven på kraniotomien. nålen i dråben af viral opløsning uden at ændre anteroposterior og lateral position. Derefter skal du bruge pumpens trækfunktion til at fylde sprøjten med ca. 500 nanoliter af den virale opløsning på paraffinfilmen.Udfør denne procedure under stereoscope, se dråben forsvinde, og sørg for ikke at aspirere nogen luft. Sørg for, at sprøjten er fyldt korrekt. Test udslyngningssystemet ved at køre stemplet ned for at teste skubbe en lille dråbe væske ud.Derefter sættes nålen ind i hjernen til den valgte dybde. Tryk på kørselsknappen for injektion. Træk derefter langsomt nålen over tre til fem minutter tilbage.Vask straks nålen i rent destilleret vand ved at tømme den flere gange for at undgå tilstopning. Derefter skal du fjerne dyret fra stereotaxic rammen. Sutur huden og gøre tre eller fire sting bundet med 2-1-1 standard kirurgiske knob.At udtrække hjernen, lave et snit på huden fra hals til næse, derefter afsnit den sidste ryghvirvler fra kraniet med en saks. Træk huden tilbage og skær kraniet langs midterlinjen fra hale til rostral retning. Fjern forsigtigt parietal knoglen og caudal del af frontal knoglen.Uddrag hjernen med en lille afrundet spatel ved at indsætte den mellem hjernen og kraniegulvet, der udsniter olfaktoriske pære, synsnerven, og andre kranienerver og lillehjernen. Nedsænk forsigtigt hjernen i iskold skæreopløsning. Derefter overføres hjernen til et filterpapir og tør forsigtigt den kortikale overflade.Lim hjernebarken til prøveholderen af en vibratom med halesiden mod bladet for at skære vandrette hjerneskiver. Dernæst fylde skærekammeret med iskold iltet skæreopløsning, så hjernen er helt nedsænket. Sektion 300 mikrometer tykke skiver med vibratom ved en hastighed på 07 millimeter per sekund på en millimeter amplitude.På dette stadium anbefales det kort at kontrollere Chronos-GFP-udtrykket i thalamus ved hjælp af en fluorescerende lommelygte og tilhørende filterbriller. For at udføre helcellespatch-clamp optagelse, forsigtigt overføre en hjerne skive, der indeholder hippocampal kompleks til optagelsen kammer. Kontinuerligt gennemgå optagelse kammer med 34 grader Celsius ACSF boblede med carbogen på to til tre milliliter i minuttet.Undersøg kort Chronos-GFP-udtrykket i axonterminaler i interesseområdet med blå LED-belysning ved 4X-forstørrelse. Skift til en 63X nedsænkningsmålsætning, og juster fokus. Kontroller for axoner udtrykke Chronos-GFP og vælge en pyramideformet neuron for patch optagelse.Dernæst fylde en pipette med kalium gluconat baseret intern løsning. Monter den i pipetteholderen på hovedscenen. Lappe cellen i spænding klemme konfiguration.Indflyvning den identificerede neuron og forsigtigt trykke pipette spidsen på soma. Det positive tryk skal give en smilehul på membranoverfladen. Slip derefter trykket for at skabe en gigoOm-forsegling.Når den er forseglet, indstilles holdespændingen til minus 65 millivolt. Bryd membranen med en skarp puls af undertryk. Optag neuronens reaktioner på hyperpolarisering og depolarisering af aktuelle trin i helcellestrømskletilstand.Optag i strøm eller spænding klemme postsynaptiske reaktioner på 475 nanometer LED hele felt stimulation af afferent fibre udtrykke Chronos. Stimulere med tog af ti stimulationer af to millisekund varighed på 20 hertz. Aktiviteten af præubkulære neuroner i lag tre som reaktion på hyperpolarisering og depolarisering af aktuelle trin blev registreret i hele celle patch-clamp konfiguration.Stimulering adn axon terminaler udtrykke Chronos-GFP fremkaldte excitatoriske post-synaptiske potentialer i præubicular lag tre vigtigste celler i den nuværende klemme tilstand. Afhængigt af lysintensiteten kan EPSP'erne nå en potentiel tærskelværdi for indsatsen. Post-synaptiske reaktioner blev også observeret i spænding klemme mode, som excitatoriske post-synaptiske strømme blev fremkaldt.Vist her er et lag tre pyramideformede neuron omgivet af thalamic axoner udtrykke Chronos-GFP i præubkulære overfladiske lag med DAPI farvning afbildet med en epifluorescens mikroskop. Og dette billede blev taget ved en højere forstørrelse med et konfokal mikroskop. Omhyggelig nivellering af bregma langs aksen i udførelsen af pilotforsøg med en fluorescerende sporstof er afgørende for at forbedre præcisionen af den stereotaxiske injektion.Denne procedure kan også bruges til at undersøge konvergerende fremskrivninger fra forskellige områder ved at injicere på to generative scene følsomme over for to forskellige bølgelængder. Udviklingen af denne teknik har gjort det muligt præcis anatomisk og funktionel kredsløbsanalyse mellem fjerne hjerneregioner på en celletypespecifik måde.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selektiv Viral transduktion af Voksen-fødte olfaktoriske neuroner for Kronisk In vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Fiberoptisk implantation for kronisk Optogenetic Stimulation af hjernevæv

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Fødselsdepression Elektroporation og Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Mouse Akut hjerneskiver

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering af Rodent centralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetic Stimulering af hørenerven

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Dissektion af Frygt Kredsløb i Brain Skiver

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stereotaxisk kirurgi for genmanipulation i Striatal celler af Neonatal mus hjerner

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering af langvarig depression induktion i voksne cerebellar skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistisk mærkning af pyramideformede neuroner i hjerneskiver og i primærcellekultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...