Name: in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices
Uploaded: 2019-09-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices at JoVE.com

Nous remercions Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang et Jean Simonnet pour leur aide dans le développement des versions précédentes du protocole d'injection stéréotaxique et Marin Manuel et Patrice Jegouzo pour leur aide technique. Ce travail a été soutenu par le ministère Français de l'éducation et de la recherche (L. R., L. S.), le Centre national des Etudes Spatiales (M. B.) et l'Agence Nationale de la Recherche Grant <span lang="FR" style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).

Toutes les procédures ont été réalisées conformément à la directive du Conseil communautaire européen (2010/63/UE) et approuvées par le comité d'éthique de l'Université Paris Descartes. L'expérimentateur doit obtenir l'autorisation de la procédure pour se conformer à la réglementation locale.
1. Planification de l'expérience
<ol><li>Définir la zone du cerveau à cibler. Déterminer les coordonnées stéréotaxiques du site d'injection à l'aide d'un atlas du cerveau de sour...

<ol>
	<li>Goodridge, J. P., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+postsubiculum+and+anterior+thalamus+in+the+generation+of+head+direction+cell+activity.">Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).</li><li>Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+navigation.+Disruption+of+the+head+direction+cell+network+impairs+the+parahippocampal+grid+cell+signal.">Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal.</a> Science. 347 (6224), 870-874 (2015).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+decrease+of+excitability+in+rat+hippocampal+neurons+through+increases+in+I(h).">Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h).</a> Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).</li><li>Takahashi, H., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+Interactions+and+Synaptic+Plasticity+in+the+Dendritic+Tuft+Regions+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).</li><li>Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleus+reuniens+and+entorhinal+cortex+projections+in+hippocampal+field+CA1+of+the+rat.">Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat.</a> Brain Structure &amp; Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).</li><li>Callaway, E. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulating+neurons+with+light.">Stimulating neurons with light.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).</li><li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).</li><li>Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+neuronal+circuits+underlying+the+interaction+between+sensory+and+motor+cortex.">Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex.</a> Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).</li><li>Simonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependent+feedback+inhibition+may+maintain+head+direction+signals+in+mouse+presubiculum.">Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum.</a> Nature Communications. 8, 16032 (2017).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+Thalamic+Excitation+and+Feedforward+Inhibition+of+Presubicular+Neurons+Projecting+to+Medial+Entorhinal+Cortex.">Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).</li><li>Fricker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+cells+of+rodent+presubiculum+express+a+tetrodotoxin-insensitive+Na++current.">Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current.</a> The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).</li><li>Simonnet, J., Eug&#232;ne, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+neuroanatomy+of+rat+presubiculum.">Cellular neuroanatomy of rat presubiculum.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).</li><li>Simonnet, J., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+components+and+circuitry+of+the+presubiculum+and+its+functional+role+in+the+head+direction+system.">Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system.</a> Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Huang, L. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+Localization+and+Projection-Specific+Properties+of+Presubicular+Neurons+Targeting+the+Lateral+Mammillary+Nucleus,+Thalamus,+or+Medial+Entorhinal+Cortex.">Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex.</a> eNeuro. 4 (2), (2017).</li><li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons.">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li><li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+Projections+from+the+Medial+Septum+Selectively+Inhibit+Interneurons+in+the+Medial+Entorhinal+Cortex.">GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum.">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Hass, C. A., Glickfeld, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+optical+excitation+of+cortico-cortical+projections+at+physiological+frequencies.">High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).</li></ol>

L'injection virale in vivo pour exprimer les opsines sensibles à la lumière dans une zone cérébrale définie est une méthode de choix pour l'analyse optogénétique de la connectivité fonctionnelle à longue portée10,11,17,18. Les injections stéréotaxiques offrent la possibilité de cibler précisément une zone spécifique du cerveau. La coexpression d'un opsin avec un journaliste flu...

Définir la connectivité entre les régions du cerveau est nécessaire pour comprendre les circuits neuronaux. Les méthodes classiques de traçage anatomique permettent d'établir une connectivité interrégionale, et les études sur les lésions aident à comprendre l'organisation hiérarchique du flux d'information. Par exemple, les circuits cérébraux pour l'orientation spatiale et la signalisation de direction de la tête impliquent le flux directionnel de l'information du thalamus au présubiculum. Ceci a été démontré par des études de lésion des noyaux thalamicants antéro-dorsal (ADN) qui dégradent le signal de direction de tête dans le presubiculum dorsal en aval, aussi bien que le signal de cellule de grille parahippocampal1,2.
La connectivité fonctionnelle entre les zones du cerveau est plus difficile à établir au niveau cellulaire et subcellulaire. Dans l'hippocampe, une anatomie très organisée permet d'étudier les connexions synaptiques spécifiques à la voie à l'aide de la simulation électrique dans la préparation des tranches. Les électrodes de stimulation placées dans le radiatum de strate de CA1 peuvent être utilisées pour stimuler spécifiquement l'entrée collatérale de Schaffer de CA33. Des électrodes stimulantes placées dans la strate lacunosum moleculare de CA1 activeront l'entrée de chemin de perforant à CA14,5. La stimulation électrique active la libération de neurotransmetteurdes des terminaux d'axone ; cependant, il active les neurones avec somata près du site de stimulation ainsi que des axones de passage. Il est donc d'une utilité limitée pour l'étude des afférents des régions définies du cerveau lorsque les fibres de différentes régions d'origine s'entremêlent dans la structure cible, comme c'est généralement le cas dans le néocortex.
Les neurones peuvent également être stimulés par la lumière. Les méthodes optiques incluent la photoactivation du glutamate en cage, qui peut être combinée avec un ou deux photons de balayage laser. Plusieurs sites étroitement espacés peuvent être stimulés séquentiellement, sans dommages mécaniques au tissu6. Ceci a été utilisé avec succès pour cartographier les récepteurs synaptiques ainsi que d'activer les neurones individuels7. Bien que le décaissement du glutamate puisse être utilisé pour l'analyse des circuits locaux, il ne permet pas l'activation spécifique des entrées à longue portée.
Une méthode de choix pour l'étude de la connectivité à longue portée dans les circuits neuronaux est l'utilisation de l'expression de canalrhodopsine virus-négociée. En utilisant des injections stéréotaxiques in vivo telles que décrites ici, l'expression des canaux ioniques à portes lumineuses peut être ciblée et spatialement limitée à une région du cerveau désirée. De cette façon, les channelrhodopsines sont efficaces pour cartographier la connectivité excitatrice ou inhibitrice d'une région à sa cible. Les terminaux d'axones transfectés peuvent être stimulés avec la lumière dans une préparation de tranche de cerveau, et les enregistrements de correction-clamp comme lecture-out permettent l'examen des fonctions et des forces des composants spécifiques de circuit dans le cerveau8. L'approche optogénétique combinée à l'injection stéréotaxique d'un virus offre une spécificité sans précédent et un contrôle génétique9. Stimuler avec la lumière permet en outre à la fois haute précision temporelle et spatiale10,11.
Le présubiculum est une structure corticale à six couches à la transition de l'hippocampe et de la formation para-hippocampal12,13. Il reçoit une entrée synaptique importante de l'ADN11, mais aussi de plusieurs autres régions corticales et sous-corticales14. Ainsi, la stimulation sélective des terminaux d'axones thalamic dans une tranche présubiculaire n'est pas possible avec la stimulation électrique ni le glutamate uncaging. Décrits dans ce protocole sont des méthodes pour déterminer la connectivité fonctionnelle entre les régions du cerveau (ADN et presubiculum) en utilisant des injections stéréotaxiques précises de vecteurs viraux exprimant des canaux à porte-lumière. On décrit également la photostimulation des terminaux d'axones des neurones projetants dans leur région cible, couplée aux enregistrements de patch-clamp de cellules entières des neurones post-synaptiques dans la préparation de tranche de cerveau.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:927px;" width="927">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.5 mm bur&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">724962</td>
			<td style="width:365px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10 &#181;L Hamilton syringe</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">1701 RN - 7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">10X PBS solution</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">AM9624</td>
			<td>&#160;text</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">36% PFA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">470 nm LED&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">P1105/470/LED&#160; DC/59022m</td>
			<td style="width:365px;">use with matched excitation filter 470/40x&#160; and emission filter for GFP&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td>
			<td>Penn Vector Core</td>
			<td>AV-5-PV3446</td>
			<td>lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">All chemicals</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Bath temperature controler</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM7</td>
			<td>Set at 34&#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">beveled metal needle</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">7803-05</td>
			<td>33 gauge, 13mm, point style 4-20&#176;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Big scissors</td>
			<td style="width:183px;">Dahle Allround</td>
			<td style="width:136px;">50038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Biocytin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">B4261</td>
			<td>final 1-3 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Borosilicate Capillaries</td>
			<td style="width:183px;">Havard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">GC150-10</td>
			<td>1.5 mm outer, 0.86 inner diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Brown Flaming electrode puller</td>
			<td style="width:183px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:136px;">P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">BupH Phosphate Buffered Saline pack</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">28372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">butterfly needle for perfusion</td>
			<td style="width:183px;">Braun&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Venofix A</td>
			<td>24G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:183px;">Andor&#160;</td>
			<td style="width:136px;">DL-604M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss</td>
			<td style="width:136px;">LSM710</td>
			<td>20X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">curved forceps</td>
			<td style="width:183px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:136px;">11011-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">CY5 configuration (confocal)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">CY5 configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">DAPI configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Digital handheld optical meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:136px;">PM100D</td>
			<td>Parametered on 475 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Double egde stainless steel razor blades</td>
			<td style="width:183px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:136px;">72000</td>
			<td>Use half of the blade in the slicer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dual Fluorescent Protein Flashlight</td>
			<td style="width:183px;">Nightsea</td>
			<td style="width:136px;">DFP-1</td>
			<td style="width:365px;">excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">EGTA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E4368</td>
			<td>final 0,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:136px;">Eclipse TE-2000E</td>
			<td>10 or 20X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">Filter paper</td>
			<td style="width:183px;">Whatman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fluoro-Ruby 10%</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:136px;">AG335</td>
			<td>disolve 10 mg in 100 &#181;l of distilled water ; inject 150 to 300 nl</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">GFP configuration (epifluo)</td>
			<td style="width:183px;">Nikon/Chroma</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:365px;">Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heatingplate</td>
			<td style="width:183px;">Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">HP4M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heparin choay 5000 U.I./ml</td>
			<td style="width:183px;">Sanofi</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>5 ml vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">H3375</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High speed rotary micromotor kit</td>
			<td style="width:183px;">Foredom</td>
			<td style="width:136px;">K.1070</td>
			<td>maximum drill speed 38,000 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Internal solution compounds :</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isolated Pulse Stimulator</td>
			<td style="width:183px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:136px;">2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P4504</td>
			<td>final 1,2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketamine 1000</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ketofen 10%</td>
			<td style="width:183px;">Merial</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>100 mg/ml : dilute 1 &#181;l in 1ml total (0,1%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laocaine (lidocaine)</td>
			<td style="width:183px;">MSD</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LED hi power spot for surgery</td>
			<td>Photonic (via Phymep)</td>
			<td style="width:136px;">10044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">LED Power Supply</td>
			<td style="width:183px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:136px;">OptoLED Light Source</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Manipulators</td>
			<td style="width:183px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:136px;">SM-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mg-ATP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9187</td>
			<td>final 4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MgCl2</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">63069</td>
			<td>final 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Micro temperature controler</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td style="width:136px;">MTC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Milk powder</td>
			<td style="width:183px;">Carnation</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na Phosphocreatine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P7936</td>
			<td>final 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Na3-GTP 2H20</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G9002</td>
			<td>final 0.4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:243px;">needle holder/hemostat</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">13005-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">pClamp acquisition software</td>
			<td style="width:183px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">Minipuls 3</td>
			<td>14-16 on the display for 2-3 ml/min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium gluconate (K-gluconate)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">G4500</td>
			<td>Final 135 mM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">ProLong Gold antifade mounting medium</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P36390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Rompun 2% (xylazine)</td>
			<td style="width:183px;">Bayer</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">small scissors</td>
			<td style="width:183px;">FST</td>
			<td style="width:136px;">14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride 0.9%&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>dilute 8.5 mL in 10 ml total</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope VISISCOPE SZT</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">630-1584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereotaxic frame with digital display</td>
			<td style="width:183px;">Kopf</td>
			<td style="width:136px;">Model 940</td>
			<td>Small animal stereotaxic instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy3 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:136px;">434315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Streptavidin-Cy5 conjugate</td>
			<td style="width:183px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">S32357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Superglue3 Loctite</td>
			<td style="width:183px;">Dutscher</td>
			<td style="width:136px;">999227</td>
			<td>1g tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid</td>
			<td style="width:183px;">Ethicon</td>
			<td style="width:136px;">F3210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:183px;">kdScientific</td>
			<td>Legato 130 - 788130</td>
			<td>Use Infuse and Withdraw modes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:136px;">VT1200S</td>
			<td>speed 0.07, amplitude 1.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">tubing</td>
			<td style="width:183px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F117942, F117946</td>
			<td>Yellow/Black, Purple/Black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">upright microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:136px;">BX51W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Versi-dry bench absorbant paper</td>
			<td style="width:183px;">Nalgene</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo intracerebral stereotaxic injections for optogenetic stimulation of long-range inputs in mouse brain slices

La connaissance de la connectivité synaptique spécifique de type cellulaire est une condition préalable cruciale pour comprendre les circuits neuronaux à l'échelle du cerveau. L'étude fonctionnelle des connexions à longue portée nécessite des enregistrements ciblés de neurones uniques combinés à la stimulation spécifique d'intrants éloignés identifiés. Ceci est souvent difficile à réaliser avec les techniques conventionnelles et de stimulation électrique, parce que les axones des zones convergentes du cerveau en amont peuvent se mêler dans la région cible. Le ciblage stéréotaxique d'une région spécifique du cerveau pour l'expression par le virus des canaux ioniques sensibles à la lumière permet la stimulation sélective des axones provenant de cette région avec la lumière. Les injections stéréotaxiques intracérébrales peuvent être utilisées dans des structures bien délimitées, telles que les noyaux thalamiques antérieurs, en plus d'autres zones sous-corticales ou corticales dans tout le cerveau.
Décrit ici est un ensemble de techniques pour l'injection stéréotaxique précise des vecteurs viraux exprimant la canalrhodopsine dans le cerveau de souris, suivie par la photostimulation des terminaux d'axone dans la préparation de tranche de cerveau. Ces protocoles sont simples et largement applicables. En combinaison avec l'enregistrement de pince de correction de pleine cellule d'un neurone postsynaptically relié, la photostimulation des axones permet la détection des connexions synaptiques fonctionnelles, la caractérisation pharmacologique, et l'évaluation de leur force. En outre, le remplissage de biocytine du neurone enregistré peut être employé pour l'identification morphologique post-hoc du neurone postsynaptic.

La procédure présentée ici a été utilisée pour exprimer une canalrhodopsine bleu sensible à la lumière (Chronos) fusionnée à GFP dans le noyau antéro-dorsal du thalamus (ADN), par injection stéréotaxique du virus antérograde adéno-associé. Les coordonnées stéréotaxiques ont été déterminées selon un atlas du cerveau de souris et testées en injectant 200 nL de fluoro-ruby fluorescent. L'animal a été sacrifié 10 min après l'injection, et le cerveau a été extrait et fixé pendant la nuit. Les se...

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In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Ce protocole décrit un ensemble de méthodes pour identifier la connectivité fonctionnelle spécifique de type cellulaire des entrées à longue portée des régions éloignées de cerveau utilisant des stimulations optogénétiques dans des tranches de cerveau ex vivo.

Injections stéréotaxiques intracérébrales in vivo pour la stimulation optogénétique des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau de souris

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

L’objectif de cette méthode est d’identifier la connectivité fonctionnelle des entrées à longue portée provenant de régions éloignées du cerveau à l’aide de photostimulation en tranches de cerveau. Le ciblage stéréotaxique d’une région spécifique du cerveau pour diverses expressions médiatisées de canaux iion sensibles à la lumière permet la stimulation sélective des axones provenant de cette région avec de la lumière. Louis Richevaux, doctorant de mon groupe, démontrera la procédure.Avant la chirurgie, vérifiez que l’animal est bien anesthésié avec une pincée d’un outeil. Retirez doucement sa langue pour faciliter la respiration. Ensuite, rasez les cheveux crâniens.Injecter 20 microlitres d’hydrochlorure de lidocaïne sous la peau de la tête pour une anesthésie locale et attendre cinq minutes. Pour exposer le crâne, faire une coupure sur le cuir chevelu. Ensuite, placez l’animal dans un cadre stéréotaxique.Insérez les barres d’oreille et reposez-les sur les os légèrement rostral aux oreilles et tirez vers le bas la peau pour créer un bon accès au crâne. Serrez les barreaux d’oreille et installez le morceau de nez. Maintenez le corps de l’animal horizontalement et au niveau de la tête à l’aide d’un support ajusté en hauteur.Placez un coussin chauffant sous l’animal pour le maintenir à la température physiologique. Nettoyez ensuite le crâne en appliquant du chlorure de sodium à 0,9 % à l’l’intérieur d’un coton-tige pour enlever les tissus mous. Ajustez le crâne de sorte que l’accès bregma lambda soit nivelé.Ensuite, localisez le site d’injection sur le crâne selon les coordonnées postérieures et médiale et placez l’aiguille d’injection au-dessus. Marquez le crâne avec une aiguille jetable. Par la suite, déplacez l’aiguille d’injection vers le haut de quatre centimètres.À l’aide d’une bavure de 0,5 millimètre, créer une craniotomie d’un millimètre de diamètre sur la marque à la moitié de la vitesse maximale. Écouvillonner avec un tissu en cas de saignement. Ensuite, videz l’eau contenue dans la seringue Hamilton pour l’entreposer en l’éjectant complètement à l’l’insurgée à l’l’huile.Seule l’aiguille est remplie d’eau. Décongelez la solution virale à injecter sur la glace, puis retirez-la brièvement de la glace et obtenez 700 nanolitres de la solution à l’aide d’une micropipette. Ensuite, déposez une goutte sur un morceau de film de paraffine.Placez le film de paraffine sur la craniotomie. Plongez l’aiguille dans la goutte de solution virale sans changer la position antéroposteriore et latérale. Ensuite, utilisez la fonction de retrait de la pompe pour remplir la seringue d’environ 500 nanolitres de la solution virale sur le film de paraffine.Effectuez cette procédure sous le stéréoscope, observez la chute disparaître et assurez-vous de ne pas aspirer d’air. Assurez-vous que la seringue a été bien remplie. Testez le système d’éjection en descendant le piston pour tester éjecter une petite goutte de liquide.Par la suite, insérez l’aiguille dans le cerveau à la profondeur choisie. Appuyez sur le bouton d’exécuter pour l’injection. Puis, retirez lentement l’aiguille sur trois à cinq minutes.Lavez immédiatement l’aiguille dans de l’eau distillée propre en la vidant plusieurs fois afin d’éviter de l’obstruer. Ensuite, retirez l’animal du cadre stéréotaxique. Suture de la peau et faire trois ou quatre points attachés avec 2-1-1 noeuds chirurgicaux standard.Pour extraire le cerveau, faire une coupe sur la peau du cou au nez, puis sectionner les dernières vertèbres du crâne avec des ciseaux. Rétractez la peau et coupez le crâne le long de la ligne médiane de la direction caudale à la direction rostrale. Retirer délicatement l’os pariétal et la partie caudale de l’os frontal.Extraire le cerveau avec une petite spatule arrondie en l’insérant entre le cerveau et le plancher crânien, sectionnant le bulbe olfactif, le nerf optique, et d’autres nerfs crâniens et cervelet. Submergez doucement le cerveau dans la solution de coupe à froid de glace. Par la suite, transférez le cerveau dans un papier filtre et séchez doucement la surface corticale.Collez le cortex cérébral au porte-spécimen d’un vibratome avec le côté caudal face à la lame afin de couper les tranches horizontales du cerveau. Ensuite, remplissez la chambre de coupe avec une solution de coupe oxygénée glacée afin que le cerveau soit complètement immergé. Section 300 micromètres d’épaisseur tranches avec le vibratome à une vitesse de 07 millimètres par seconde à une amplitude millimétrique.À ce stade, il est recommandé de vérifier brièvement l’expression Chronos-GFP dans le thalamus à l’aide d’une lampe de poche fluorescente et de lunettes de filtre correspondantes. Pour effectuer l’enregistrement patch-clamp à cellules entières, transférez doucement une tranche de cerveau contenant le complexe hippocampal à la chambre d’enregistrement. Perfusez continuellement la chambre d’enregistrement avec 34 degrés Celsius ACSF bouillonné avec du carbogen à deux à trois millilitres par minute.Examinez brièvement l’expression Chronos-GFP dans les terminaux d’axon dans la région d’intérêt avec l’éclairage LED bleu au grossissement 4X. Passer à un objectif d’immersion 63X et ajuster la mise au point. Vérifiez s’il y a des axones exprimant Chronos-GFP et choisissez un neurone pyramidal pour l’enregistrement des patchs.Ensuite, remplissez une pipette avec une solution interne à base de gluconate de potassium. Montez-le dans le porte-pipette sur la scène de la tête. Patchez la cellule dans la configuration de pince de tension.Approchez le neurone identifié et appuyez délicatement sur la pointe pipette sur le soma. La pression positive devrait produire une fossette à la surface de la membrane. Ensuite, relâchez la pression pour créer un joint gigoOm.Une fois scellée, réglez la tension de détention à moins 65 millivolts. Briser la membrane avec une impulsion aiguë de pression négative. Enregistrez les réponses du neurone aux étapes actuelles hyperpolarisantes et dépolarisantes en mode pince à courant à cellules entières.Enregistrement dans les réponses postsynap de pince de courant ou de tension à la stimulation de champ entier de LED de 475 nanomètres des fibres afferent exprimant Chronos. Stimuler avec des trains de dix stimulations de deux millisecondes à 20 hertz. L’activité des neurones présubicular dans la couche trois en réponse aux étapes actuelles hyperpolarisantes et dépolarisantes a été enregistrée dans la configuration de patch-clamp de cellule entière.Les terminaux d’axon d’ADN stimulants exprimant Chronos-GFP ont suscité des potentiels post-synaptiques excitatifs dans la couche présubicular trois cellules principales dans le mode courant de pince. Selon l’intensité lumineuse, les EPSP pourraient atteindre le seuil potentiel d’action. Des réponses post-synaptiques ont également été observées en mode pince de tension, car des courants post-synaptiques excitatifs ont été obtenus.On y voit une couche de trois neurones pyramidaux entourée d’axones thalamiques exprimant Chronos-GFP dans des couches superficielles présubicular avec coloration DAPI photographiée avec un microscope d’épifluorescence. Et cette image a été prise à un grossissement plus élevé avec un microscope confocal. Un nivellement attentif du bregma le long de l’axe dans l’exécution d’expériences pilotes avec un traceur fluorescent est crucial pour améliorer la précision de l’injection stéréotaxique.Cette procédure peut également être utilisée pour étudier les projections convergentes de différentes zones en injectant à deux stades génératifs sensibles à deux longueurs d’onde différentes. Le développement de cette technique a permis une analyse anatomique et fonctionnelle précise des circuits entre des régions cérébrales éloignées d’une manière spécifique au type de cellule.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Recherche

Neurosciences

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Fibre optique d&#39;implantation pour la stimulation chronique optogenetic de tissu cérébral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

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In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

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Stimulation optogenetic du nerf auditif

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Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

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